肖其勝，楊捷琳，楊惠琴，丁卓平，何宇平,

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

實(shí)時(shí)熒光PCR法鑒定食品中雙歧桿菌

肖其勝1,2，楊捷琳2，楊惠琴2，丁卓平1，何宇平2,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

根據(jù)雙歧桿菌屬16S rRNA基因的保守區(qū)序設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立一種鑒定食品中雙歧桿菌屬的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法。對(duì)方法的特異性、靈敏度、重復(fù)性和體系抗干擾能力進(jìn)行驗(yàn)證，最后采用該方法對(duì)市售25 份標(biāo)示含雙歧桿菌樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：該檢測(cè)方法可特異性檢測(cè)雙歧桿菌屬細(xì)菌，對(duì)近緣的乳桿菌屬、鏈球菌屬及食品中常見(jiàn)菌群包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌等均無(wú)擴(kuò)增。雙歧桿菌DNA檢測(cè)絕對(duì)靈敏度可達(dá)到2 pg，相對(duì)靈敏度可達(dá)到104CFU/mL。重復(fù)性測(cè)試表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1%。同時(shí)進(jìn)行了雜菌干擾檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，在培養(yǎng)物水平和純基因組DNA水平上將青春雙歧桿菌ATCC15703與大腸桿菌ATCC25922混合進(jìn)行檢測(cè)，檢出Ct值較純菌檢測(cè)時(shí)無(wú)顯著影響，表明建立的熒光PCR方法抗干擾能力良好。對(duì)25 份市售實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)試，有5 份標(biāo)識(shí)含有“雙歧桿菌”的樣品未檢測(cè)出雙歧桿菌成分。本研究所建立的實(shí)時(shí)熒光PCR法能準(zhǔn)確、快速檢測(cè)食品中雙歧桿菌屬細(xì)菌。

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；雙歧桿菌；16S核糖體RNA；鑒定

雙歧桿菌是一類存在于人體中非常重要的專性厭氧菌，于1899年首先在母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離，研究證實(shí)雙歧桿菌具有平衡腸道菌群、降膽固醇、延緩衰老及抗腫瘤等生理功能，是人體益生菌群的主要組成［1-4］。因此，添加雙歧桿菌的微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)研究已成為一大熱點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、保健和醫(yī)療等領(lǐng)域［5-7］。

在雙歧桿菌等益生菌制劑需求大增的同時(shí)，不斷有報(bào)道指出國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上雙歧桿菌微生態(tài)制劑標(biāo)示名稱混亂，很多國(guó)家市場(chǎng)上雙歧桿菌制品假冒代替現(xiàn)象嚴(yán)重［8］。由于沒(méi)有相關(guān)法規(guī)，也沒(méi)有一套完整的體系進(jìn)行監(jiān)控，一些酸奶品牌包裝上雖然標(biāo)示含有高科技益生菌群成分，但到底有無(wú)添加都是廠家自說(shuō)自話，實(shí)際上可能與普通酸奶并無(wú)多大差異，甚至出現(xiàn)在雙歧桿菌發(fā)酵乳制品中檢驗(yàn)不出雙歧桿菌的以假亂真現(xiàn)象［9-10］。為防止名不副實(shí)、以次充好現(xiàn)象的發(fā)生，建立基于物種分子特征性序列的雙歧桿菌特異性檢測(cè)鑒定方法至關(guān)重要。

目前基于DNA的檢測(cè)方法由于快速、靈敏、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)越來(lái)越多地應(yīng)用到物種鑒定中［11-15］。其中實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)以其高特異性、快速、高靈敏度、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用在食品檢測(cè)中［16-19］。本研究旨在建立基于雙歧桿菌屬16S rRNA保守區(qū)基因的特異性序列運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)鑒定食品中雙歧桿菌成分的方法，以保障消費(fèi)者利益，確保食品質(zhì)量安全。

1　材料與方法

1.1材料與菌種

表1　標(biāo)準(zhǔn)菌種名稱及編號(hào)Table1　Names and serial numbers of standard strains

發(fā)酵乳、嬰幼兒配方奶粉和含益生菌食品均購(gòu)自上海各大超市，所有樣品均標(biāo)示含有雙歧桿菌。記錄所有樣品標(biāo)示的菌種成分，包括菌種名稱等。

根據(jù)衛(wèi)生部《可用于食品的菌種名單》，本研究供試菌株包括雙歧桿菌的6 個(gè)種共8 株；非雙歧桿菌共46 株，包括12 株乳桿菌，2 株嗜熱鏈球菌；以及大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌等其他細(xì)菌共32 株［20］。菌株樣本詳見(jiàn)表1。

1.2試劑與儀器

脫脂牛乳培養(yǎng)基：脫脂奶粉120.0 g，蒸餾水1.0 L，自然pH值。113 ℃滅菌20 min；強(qiáng)化梭菌瓊脂培養(yǎng)基（CM1542） 北京路橋技術(shù)有限股份公司；檸檬酸三鈉二水、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、酚氯仿 生工生物工程（上海）股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Cat.：DP302-02）、蛋白酶K（20 mg/mL）、溶菌酶溶液（50 mg/mL）、瓊脂糖、溴化乙錠、1×TE（Cat.：DP324-03）、50×TAE Electrophoresis buffer（Fermentas）、DL 2000 DNA Marker 天根生化科技有限公司；TaKaRa Ex TaqTMPCR試劑 寶生物工程（大連）有限公司；HR qPCR Master Mix（Cat：SJ-2101B）上海輝睿生物科技有限公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。

Vii7實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)ABI公司；麥?zhǔn)媳葷醿x生物梅里埃中國(guó)有限公司；Eppendorf Centrifuge 5415R離心機(jī)、Thermomixer Comfort恒溫振蕩孵育器、Eppendorf Mastercycle Gradient PCR儀 德國(guó)艾本德公司；NanoVue Plus微量分光光度計(jì) 上海匯檢菁英科技有限公司；200/2.2電泳儀、CLP 75.2314電泳槽 伯樂(lè)生化儀器公司；ALPHA 2S-2200凝膠分析成像系統(tǒng) 溫州市安萊科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株的處理

冷凍干燥的雙歧桿菌菌株首先轉(zhuǎn)接于強(qiáng)化梭菌瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接2代恢復(fù)活力用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2樣品制備

相對(duì)靈敏度測(cè)試樣品選取巴氏殺菌純牛乳作為基質(zhì)，代表菌株青春雙歧桿菌ATCC15703和長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC15707培養(yǎng)物稀釋到109CFU/mL，取1 mL培養(yǎng)物加入到9 mL純牛乳中，混勻后，按上述方法用純牛乳10 倍梯度稀釋至10 CFU/mL，每個(gè)濃度梯度樣品取1 mL備用。

抗干擾能力測(cè)試樣品是將青春雙歧桿菌ATCC15703培養(yǎng)物由109CFU/mL 10 倍梯度稀釋到104CFU/mL，分別與106、102CFU/mL兩種濃度的大腸桿菌ATCC25922培養(yǎng)物1∶1混合備用。

1.3.3DNA提取

將不同菌株培養(yǎng)物、混合樣品或?qū)嶋H樣品，使用DNA提取試劑盒并按其操作步驟提取DNA，每次DNA提取均設(shè)置提取空白對(duì)照。用微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA質(zhì)量濃度后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4引物和探針設(shè)計(jì)

在NCBI網(wǎng)站上（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ nucleotide/）下載雙歧桿菌屬16S rRNA基因序列建立本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，采用ClustalW軟件對(duì)雙歧桿菌屬16S rRNA基因保守區(qū)進(jìn)行比對(duì)，然后使用PrimerExpress軟件設(shè)計(jì)引物（FBP：5'-GTT GGG TTA AGT CCC GCA A-3'，RBP：5'-TGA AGC CCT GGA CGT AAG G-3'，BP：5'-FAMACG TAA GGG GCA TGA TGA TCT GAC G-BHQ1-3'）用于雙歧桿菌鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)為145 bp。在NCBI網(wǎng)站上使用BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)引物和探針的理論特異性。細(xì)菌通用引物序列（27F-5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'，1492R-5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'）用于擴(kuò)增提取的DNA［21］，細(xì)菌通用引物可在所有細(xì)菌的DNA中擴(kuò)增出目的條帶。雙歧桿菌屬16S rDNA tuf基因的引物序列（Bif_tuf_F-5'-GTC CGT GAC CTC CTC GAC-3'，Bif_tuf_R-5'-GTG GAA GGT CTC GAT GGA G-3'）［22］，可對(duì)實(shí)際樣品中提取的雙歧桿菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增，片段大小為339 bp。引物和探針均由上海輝睿生物科技有限公司合成。

1.3.5PCR反應(yīng)條件

1.3.5.1普通PCR

普通PCR采用25 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中包括12.5 μL TaKaRa Ex Taq預(yù)混液，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL，2.5 μL DNA模板，去離子水補(bǔ)足至25 μL。

普通PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法：取5 μL PCR產(chǎn)物，在2.0%瓊脂糖凝膠和0.2% TAE緩沖液中電泳30 min（120 V），然后采用凝膠成像系統(tǒng)拍照存檔。

1.3.5.2實(shí)時(shí)熒光PCR

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.25 μL，探針（10 μmol/L）0.625 μL，2.0 μL DNA模板，去離子水補(bǔ)足至25 μL。采用實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火45 s，45 個(gè)循環(huán)。熒光信號(hào)在58 ℃時(shí)收集。

1.3.6檢測(cè)方法的特異性、靈敏度和重復(fù)性測(cè)試

特異性測(cè)試采用8 株雙歧桿菌，14 株近緣乳酸菌，以及32 株其他細(xì)菌DNA為模板，采用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增。

檢測(cè)方法的靈敏度測(cè)試包括絕對(duì)靈敏度和相對(duì)靈敏度。絕對(duì)靈敏度測(cè)試選取收集的8 株雙歧桿菌，分別將提取的DNA溶液稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 5、0.000 1 ng/μL，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。相對(duì)靈敏度測(cè)試采用配制的以純牛乳作為背景的青春雙歧桿菌ATCC15703、長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC15707混合樣品DNA為模板，采用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行測(cè)試。靈敏度測(cè)試每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置5 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4 次，即每個(gè)質(zhì)量濃度得到20 個(gè)對(duì)應(yīng)的Ct值，以滿足不小于95%置信區(qū)間的要求，計(jì)算陽(yáng)性擴(kuò)增的次數(shù)。

重復(fù)性測(cè)試采用雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA的5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度稀釋液分別進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.7實(shí)時(shí)熒光PCR體系抗干擾能力測(cè)試

對(duì)建立的實(shí)時(shí)熒光PCR體系抗干擾能力測(cè)試包括培養(yǎng)物水平和純基因組DNA水平。培養(yǎng)物水平測(cè)試對(duì)配制的不同濃度青春雙歧桿菌ATCC15703培養(yǎng)物與不同濃度大腸桿菌ATCC25922培養(yǎng)物混合樣品提取的DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)混合樣品重復(fù)3 次，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。純基因組DNA水平是將提取的青春雙歧桿菌ATCC15703 DNA溶液稀釋至10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL，在分別添加300 pg、3 ng和30 ng的大腸桿菌ATCC25922 DNA，對(duì)制備的混合DNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，每個(gè)混合樣品重復(fù)3 次，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.8實(shí)際樣品檢測(cè)

對(duì)收集購(gòu)買的標(biāo)注含有“雙歧桿菌”成分的25 份實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)試。每個(gè)樣品取樣2 份，提取DNA后采用細(xì)菌通用引物、雙歧桿菌屬通用引物以及建立的雙歧桿菌檢測(cè)引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增2 次。用細(xì)菌通用引物進(jìn)行擴(kuò)增是為了確保DNA的有效提取，避免假陰性出現(xiàn)。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)方法的特異性

如圖1A所示，所有雙歧桿菌類樣品均產(chǎn)生顯著的熒光增幅，Ct值介于10～16之間；而以其他近緣乳酸菌以及常見(jiàn)食源致病菌樣品DNA為模板均無(wú)熒光擴(kuò)增信號(hào)（圖1B），采用細(xì)菌通用引物對(duì)所有樣品進(jìn)行擴(kuò)增，均可見(jiàn)目的條帶（數(shù)據(jù)未在此呈現(xiàn)）。因此，建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法特異于雙歧桿菌屬檢測(cè)。

圖1　實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的特異性測(cè)試Fig.1　Specificity of the real-time PCR method

2.2檢測(cè)方法的靈敏度

2.2.1實(shí)時(shí)熒光PCR的絕對(duì)靈敏度

表2　實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度Table2　Absolute limit of detection （LOD） of the real-time PCR method

如表2所示，兩歧雙歧桿菌ATCC25921、青春雙歧桿菌ATCC15703、短雙歧桿菌ATCC15700和乳雙歧桿菌HN019樣品可穩(wěn)定檢出的最低質(zhì)量濃度為0.000 5 ng/μL，即檢測(cè)下限為1 pg（模板為2 μL）。動(dòng)物雙歧桿菌BB-12、乳雙歧桿菌Bi-07、長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC15707和嬰兒雙歧桿菌ATCC15697樣品可穩(wěn)定檢出的最低質(zhì)量濃度為0.001 ng/μL，即檢測(cè)下限為2 pg。綜合8 株雙歧桿菌的檢測(cè)結(jié)果，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR體系的絕對(duì)靈敏度可達(dá)到2 pg。

2.2.2實(shí)時(shí)熒光PCR的相對(duì)靈敏度

表3　實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的相對(duì)靈敏度Table3　Relative LOD of the real-time PCR method

相對(duì)靈敏度測(cè)試用純牛乳作為稀釋基質(zhì)，按照10 倍稀釋方法將青春雙歧桿菌ATCC15703、長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC15707培養(yǎng)物稀釋到108～101CFU/mL，各濃度取1 mL提取DNA后測(cè)定可以穩(wěn)定擴(kuò)增的最低濃度，結(jié)果如表3所示。當(dāng)青春雙歧桿菌和長(zhǎng)雙歧桿菌混入牛乳中時(shí)可以穩(wěn)定檢出的最低濃度為104CFU/mL。綜合上述結(jié)果，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光PCR體系的相對(duì)靈敏度可達(dá)到104CFU/mL。

2.3檢測(cè)方法的重復(fù)性

表4　實(shí)時(shí)熒光PCR重復(fù)性Table4　Repeatability of the real-time PCR method

如表4所示，動(dòng)物雙歧桿菌BB-12樣品5 個(gè)質(zhì)量濃度樣品的Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.02～0.18之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.09%～0.66%之間；乳雙歧桿菌Bi-07樣品各質(zhì)量濃度DNA擴(kuò)增Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.07～0.20之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.40%～0.74%之間，均小于1%，在可接受范圍內(nèi)；其他6 株雙歧桿菌重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果與動(dòng)物雙歧桿菌BB-12和乳雙歧桿菌Bi-07一致（數(shù)據(jù)未在此呈現(xiàn)），因此，建立的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系具有較好的重復(fù)性。

2.4實(shí)時(shí)熒光PCR體系抗干擾能力

表5　實(shí)時(shí)熒光PCR體系培養(yǎng)物水平抗干擾能力Table5　Anti-disturbance ability of the real-time PCR method at the culture level

在實(shí)際的微生態(tài)制劑檢測(cè)中，檢測(cè)對(duì)象往往不是單一菌株，而是目標(biāo)菌和雜菌的混合物，因此在培養(yǎng)物水平和純基因組DNA水平上對(duì)建立的熒光定量PCR體系進(jìn)行抗干擾實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)物水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表5）表明：存在102CFU/mL和106CFU/mL大腸桿菌ATCC25922的條件下，該熒光PCR反應(yīng)體系對(duì)雙歧桿菌的檢測(cè)靈敏度未受顯著影響，檢出限仍維持在1×104CFU/mL；不同濃度青春雙歧桿菌ATCC15703培養(yǎng)物，分別添加102CFU/mL和106CFU/mL大腸桿菌，對(duì)檢出Ct值無(wú)顯著影響，均不影響雙歧桿菌的檢出。

表6　實(shí)時(shí)熒光PCR體系純基因組DNA水平抗干擾能力Table 6 Anti-disturbance ability of the real-time PCR method at the level of the genome

純基因組DNA水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表6）表明：不同濃度青春雙歧桿菌ATCC15703 DNA，分別添加300 pg、3 ng和30 ng大腸桿菌ATCC25922 DNA，各質(zhì)量濃度水平DNA檢出Ct值未受顯出影響，均不影響雙歧桿菌的檢出。

2.5實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

圖2　實(shí)際測(cè)試樣品DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　PCR results for 25 commercial samples

對(duì)25 份市售實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果表明，所有樣品采用細(xì)菌通用引物時(shí)均可擴(kuò)增出目的條帶（圖2A），表明所有樣品都成功提出適合擴(kuò)增的DNA；采用雙歧桿菌屬16S rDNA tuf基因引物可在除1、7、8、9、11號(hào)樣品為模板的擴(kuò)增中出現(xiàn)目的條帶（圖2B），表明1、7、8、9、11號(hào)樣品中沒(méi)有檢測(cè)出雙歧桿菌。

表7　實(shí)際樣品實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果Table7　Results of real-time PCR detection of commercial products

采用建立的雙歧桿菌實(shí)時(shí)熒光PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)（表7），在1、7、8、9、11號(hào)樣品中沒(méi)有顯著的熒光信號(hào)，即無(wú)陽(yáng)性擴(kuò)增曲線；表明上述5 個(gè)樣品未檢出雙歧桿菌成分。這一結(jié)果與雙歧桿菌屬普通PCR檢測(cè)結(jié)果一致。

3　討 論

添加雙歧桿菌的食品作為重要的益生菌制劑越來(lái)越受到消費(fèi)者的重視。衛(wèi)生部曾發(fā)布發(fā)酵乳等含益生菌食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中只規(guī)定益生菌限量不小于1×106CFU/g（mL）［23］。目前對(duì)于益生菌菌種、菌株的檢測(cè)鑒定缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。在市場(chǎng)上，通常宣稱“添加”了雙歧桿菌的食品，比普通乳酸菌食品售價(jià)要高出1～3 倍。受利益驅(qū)使，我國(guó)益生菌制劑魚(yú)龍混雜，核心的菌株依賴進(jìn)口。

GB 4789.34—2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：雙歧桿菌的鑒定》規(guī)定了雙歧桿菌的檢驗(yàn)鑒定，該標(biāo)準(zhǔn)利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)和生化鑒定，并結(jié)合氣相色譜法測(cè)定雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物，但此方法耗時(shí)耗力，難以在實(shí)際檢測(cè)中推廣［24］。近年來(lái)，基于分子生物學(xué)的多種手段已被用于雙歧桿菌菌株鑒定，Sheu等［22］根據(jù)雙歧桿菌16S rDNA tuf基因設(shè)計(jì)通用引物，采用普通PCR方法檢測(cè)食品中雙歧桿菌，但普通PCR法操作繁瑣，不適用于大批量產(chǎn)品快速檢測(cè)；吳燕濤等［25］利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定發(fā)酵乳中雙歧桿菌數(shù)量，但沒(méi)有對(duì)方法的特異性、靈敏度及重復(fù)性做進(jìn)一步研究。

基于此，本研究利用雙歧桿菌屬16S rRNA基因保守區(qū)建立了實(shí)時(shí)熒光PCR方法用于檢測(cè)食品中雙歧桿菌成分。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室的全面測(cè)試，建立的檢測(cè)方法特異于雙歧桿菌屬的檢測(cè)，且具有很好的重復(fù)性；檢測(cè)方法可穩(wěn)定檢測(cè)到的DNA量可達(dá)到2 pg，相對(duì)靈敏度為104CFU/mL雙歧桿菌成分；且建立的熒光PCR方法在培養(yǎng)物水平和純基因組DNA水平都有很強(qiáng)的抗干擾能力，可以滿足日常檢測(cè)的要求。對(duì)市售實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，25 份樣品有5 份未檢出雙歧桿菌成分，表明存在不按照產(chǎn)品標(biāo)識(shí)添加益生菌的可能性。

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Identification of Bifi dobacterium Strains in Foods by Real-Time PCR

XIAO Qisheng1,2, YANG Jielin2, YANG Huiqin2, DING Zhuoping1, HE Yuping2,*
（1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China；2. Shanghai Exit-Entry Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China）

A real-time PCR method was developed to identify Bifi dobacterium in foods. Specifi c primers and probes targeting the conserved region of the 16S rRNA gene of Bifi dobacterium were designed. The specifi city, sensitivity, reproducibility and system anti-interference ability of the proposed method were verifi ed. Twenty-fi ve commercial products labeled “containing Bifidobacterium” were tested by the real-time fluorescence PCR assay. Results showed that the developed method was highly specifi c for Bifi dobacterium detection. The detection limits were 2 pg using eight species of Bifi dobacterium as the templates, and the relative detection limits were 104CFU/mL. Standard deviations and relative standard deviations （RSDs）of Ct values for fi ve DNA concentrations were all in the acceptable range. The Ct values were not affected by a mixture of Bifi dobacterium adolescentis ATCC15703 and Escherichia coli ATCC25922 at both the culture level and genomic DNA level, which showed that the fluorescence PCR method has good anti-interference ability. Five samples were detected without Bifi dobacterium. Thus, considering its high specifi city, sensitivity and repeatability, the real-time PCR could be used to rapidly and accurately identify Bifi dobacterium in foods.

real-time polymerase chain reaction （RT-PCR）； Bifi dobacterium； 16S ribosomal RNA； identifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201620030

TS207.4

A

1002-6630（2016）20-0177-06

肖其勝, 楊捷琳 楊惠琴, 等. 實(shí)時(shí)熒光PCR法鑒定食品中雙歧桿菌［J］. 食品科學(xué), 2016, 37（20）： 177-182. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201620030. http：//www.spkx.net.cn

XIAO Qisheng, YANG Jielin, YANG Huiqin, et al. Identification of Bifidobacterium strains in foods by real-time PCR［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 177-182. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620030. http：//www.spkx.net.cn

2016-01-26

上海市科委長(zhǎng)三角聯(lián)合科技攻關(guān)項(xiàng)目（14495810200）；國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目（2015IK227）

肖其勝（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與安全。E-mail：xiaoqsheng@163.com

何宇平（1964—），男，研究員，本科，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：heyuping@shciq.gov.cn