胡　爽，王　鎂

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

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論著

糖腎安對(duì)高糖環(huán)境下大鼠腎臟及腎系膜細(xì)胞炎性因子ICAM-1表達(dá)的影響

胡爽1，王鎂2

(1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110032；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

目的探討糖腎安對(duì)高糖環(huán)境下大鼠腎臟及腎系膜細(xì)胞炎性因子細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)表達(dá)的影響。方法①實(shí)驗(yàn)一：50只健康SD大鼠隨機(jī)分成正常組和造模組，造模組高糖高脂喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)2型糖尿病模型，成模大鼠隨機(jī)分為模型組、糖腎安高劑量組、糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組和西藥組，各給藥組給予相應(yīng)藥物8周后收集腎臟標(biāo)本。②實(shí)驗(yàn)二：大鼠腎系膜細(xì)胞株解凍復(fù)蘇后制成細(xì)胞懸液，將其按照實(shí)驗(yàn)一分組方法進(jìn)行分組，各藥物干預(yù)組在相應(yīng)含藥血清中培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。2組實(shí)驗(yàn)采用Western blot、RT-PCR方法檢測(cè)ICAM-1表達(dá)情況。結(jié)果①實(shí)驗(yàn)一：模型組、糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組ICAM-1表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)，糖腎安各組及西藥組ICAM-1表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組ICAM-1表達(dá)量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組(P均<0.05)。②實(shí)驗(yàn)二：各藥物干預(yù)組ICAM-1表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)，但明顯低于模型組(P均<0.05)；糖腎安高劑量組ICAM-1表達(dá)量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論糖腎安可抑制大鼠腎臟及腎系膜細(xì)胞炎性因子ICAM-1的表達(dá)，減輕腎臟組織病理學(xué)改變，其腎臟保護(hù)作用可能與抑制ICAM-1表達(dá)水平有關(guān)。

糖腎安；大鼠；腎臟；腎系膜細(xì)胞；ICAM-1

糖尿病性腎臟疾病(Diabetic Kidney Disease，DKD)是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[1]，也是終末期腎病的主要原因[2]。細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)屬于免疫球蛋白超家族成員，通過識(shí)別其受體白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)等而促進(jìn)炎癥和免疫反應(yīng)，其與腎臟炎癥的病理生理學(xué)關(guān)系密切[3-5]。本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，采用Western blot、RT-PCR方法檢測(cè)中藥糖腎安對(duì)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠腎臟及高糖培養(yǎng)下腎系膜細(xì)胞炎性因子ICAM-1表達(dá)的影響，探討糖腎安對(duì)糖尿病大鼠腎臟保護(hù)的作用機(jī)制，旨在為其治療糖尿病腎病提供理論依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)材料大鼠腎系膜細(xì)胞株，由湖南湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；SPF級(jí)雄性健康SD大鼠70只，體質(zhì)量230～300 g，由沈陽龍?jiān)?jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCSK(遼)2010-0001。

1.2試劑藥品鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)(美國(guó)Sigma公司)，蛋白裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)，10%胎牛血清(GIBCO公司)，ICAM-1引物(Invitrogen生物試劑公司)，ICAM-1一抗、二抗(武漢博士德公司)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，75%乙醇，胰蛋白酶，DMEM培養(yǎng)基(高糖、低糖)，厄貝沙坦片(安博維，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：2A292)，糖腎安煎劑(由黃芪、茯苓、白術(shù)等8味中藥組成，購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，藥物水煎過濾濃縮至含生藥3 g/mL)。

1.3儀器設(shè)備TDL-5-A型離心機(jī)(飛鴿牌Anke，上海安亭科學(xué)儀器廠)，EQ.0603-021型PCR儀(日本TaKaRa公司)，Bioshine GelX 1520型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)UVP公司)，DK-SA型恒溫水浴箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠)，CO2恒溫培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)一

1.4.1.1分組及動(dòng)物模型建立取50只健康SD大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組8只和造模組42只，造模組用高糖高脂飼料(豬油10%，膽固醇2%，膽酸鹽1%，蔗糖20%，普通飼料67%配比)喂養(yǎng)4周。大鼠造模前禁食不禁水12 h，造模組按35 mg/kg一次性左側(cè)腹腔注射1% STZ溶液，正常組注射相應(yīng)量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72 h后大鼠尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖≥16.7 mmol/L且出現(xiàn)多飲、多食、多尿現(xiàn)象確認(rèn)為2型糖尿病造模成功。造模過程中無大鼠死亡，3只大鼠未成模，從實(shí)驗(yàn)中剔除。

1.4.1.2分組及給藥方法將成模大鼠隨機(jī)分為模型組7只、糖腎安低劑量組8只、糖腎安中劑量組8只、糖腎安高劑量組8只、西藥組8只。糖腎安低、中、高劑量組大鼠分別給予糖腎安6 g生藥/(kg·d)、18 g生藥/(kg·d)、60 g生藥/(kg·d)灌胃，西藥組給予厄貝沙坦13.5 mg /(kg·d)灌胃，正常組和模型組給予相應(yīng)量的生理鹽水灌胃，各組大鼠均每天灌胃1次，其中糖腎安低劑量組2只死亡，從實(shí)驗(yàn)中剔除。

1.4.1.3標(biāo)本采集連續(xù)灌胃8周，在末次灌胃1 h后以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，收集腎臟標(biāo)本，縱向剖開切取皮質(zhì)部分，置于凍存管中-80 ℃保存待用。

1.4.2實(shí)驗(yàn)二

1.4.2.1細(xì)胞復(fù)蘇及培養(yǎng)大鼠腎系膜細(xì)胞株復(fù)溫后從水浴箱中取出凍存管，用75%乙醇噴灑消毒后開啟，吸出細(xì)胞懸液，移入離心管內(nèi)，緩慢加入7～8 mL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,充分混勻,1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入適量細(xì)胞培養(yǎng)液,移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2.2細(xì)胞傳代將培養(yǎng)瓶置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)行細(xì)胞傳代。吸除瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液,以無菌常溫PBS緩沖液沖洗1～2次，加入1 mL胰蛋白酶輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，消化1～3 min后把培養(yǎng)瓶放置于顯微鏡下觀察，倒掉消化液，加入少量含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)。吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液,反復(fù)輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入適量新培養(yǎng)液，等量分種于新培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)條件同前，每2～3 d更換培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)至大部分融合時(shí)，可以再次傳代，本實(shí)驗(yàn)選用3～10代的細(xì)胞。

1.4.2.3藥物血清制備取健康雄性SD大鼠20只，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后,隨機(jī)分為正常組5只、西藥組3只、糖腎安低劑量組4只、糖腎安中劑量組4只、糖腎安高劑量組4只，西藥組給予厄貝沙坦13.5 mg/(kg·d)灌胃，每天1次；糖腎安低、中、高劑量組大鼠分別給予糖腎安6 g生藥/(kg·d)、18 g生藥/(kg·d)、60 g生藥/(kg·d)灌胃，上、下午各1次；正常組給予相應(yīng)量的生理鹽水灌胃，每天1次。各組均連續(xù)灌胃3 d，在末次灌胃1 h后以10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，在無菌條件下經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心15 min分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補(bǔ)體，分裝-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2.4藥物血清培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為6組：模型組給予10%無藥血清0.5 mL+30 mmol/L高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；正常組給予10%無藥血清+5 mmol/L低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；糖腎安低劑量組給予10%低劑量血清0.5 mL+30 mmol/L(4.5 mL)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；糖腎安中劑量組給予10%中劑量血清0.5 mL+30 mmol/L(4.5 mL)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；糖腎安高劑量組給予10%高劑量血清0.5 mL+30 mmol/L(4.5 mL)高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；西藥組給予10%厄貝沙坦血清0.5 mL+30 mmol/L高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.4.3檢測(cè)指標(biāo)

1.4.3.1大鼠腎臟組織ICAM-1表達(dá)情況采用Western blot法檢測(cè)。取100 mg腎皮質(zhì)，加入細(xì)胞裂解液，冰浴下組織勻漿、離心；取組織裂解蛋白50 μg，經(jīng)12%SDSPAGE垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h；加一抗4 ℃過夜，加二抗室溫2 h，以上兩步后TBST洗膜10 min×3次；PVDF膜與顯色劑反應(yīng)后掃描，以GAPDH為內(nèi)參用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的凈光密度值。

1.4.3.2大鼠腎系膜細(xì)胞ICAM-1表達(dá)情況采用RT-PCR法檢測(cè)。取大鼠腎系膜細(xì)胞1×107，按TransZol Up試劑盒提供方法提取總RNA，用蛋白核酸分析儀測(cè)定OD260和OD280值，計(jì)算總RNA純度。取2.5 μL總RNA作為cDNA合成的模板。擴(kuò)增參數(shù)：94 ℃ 3 min預(yù)變性，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，3個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸5 min。均取10 μL的PCR產(chǎn)物及DNA Marker DL2000標(biāo)準(zhǔn)比較物，置1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以5 V/cm電壓電泳60 min。以凝膠分析系統(tǒng)拍攝、定性定量分析。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠腎臟組織中ICAM-1表達(dá)情況正常組腎臟組織中ICAM-1表達(dá)量為30.38±4.07，模型組為81.50±5.13，糖腎安低劑量組為67.63±7.46，糖腎安中劑量組為35.88±4.52，糖腎安高劑量組為17.13±2.95，西藥組為55.25±5.80。模型組、糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組ICAM-1表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)，糖腎安各組及西藥組ICAM-1表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)，糖腎安高劑量組ICAM-1表達(dá)量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組及西藥組(P均<0.05)。見圖1。

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組 圖1　各組大鼠腎臟組織中ICAM-1表達(dá)情況

2.2各組大鼠腎系膜細(xì)胞ICAM-1表達(dá)情況正常組腎系膜細(xì)胞ICAM-1表達(dá)量為0.25±0.03，模型組為0.62±0.04，糖腎安低劑量組為0.38±0.04，糖腎安中劑量組為0.37±0.05，糖腎安高劑量組為0.30±0.04，西藥組為0.31±0.03。各藥物干預(yù)組ICAM-1表達(dá)量均明顯高于正常組(P均<0.05)，但明顯低于模型組(P均<0.05)；糖腎安高劑量組ICAM-1表達(dá)量明顯低于糖腎安中劑量組、糖腎安低劑量組(P均<0.05)，但與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

1為正常組；2為模型組；3為糖腎安低劑量組；4為糖腎安中劑量組；5為糖腎安高劑量組；6為西藥組 圖2　各組大鼠腎系膜細(xì)胞ICAM-1表達(dá)情況

3　討　　論

黏附分子是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合的一類糖蛋白的統(tǒng)稱，主要表達(dá)于細(xì)胞膜表面與細(xì)胞外基質(zhì)中，它參與了機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生及創(chuàng)傷愈合、細(xì)胞活化等一系列重要生理和病理過程。ICAM-1是其中一種重要的黏附分子，可促進(jìn)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附及滲出，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，造成血管病變，導(dǎo)致組織器官發(fā)生病理生理的改變[6]。

在DKD發(fā)生發(fā)展中，ICAM-1可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞黏附，使炎性細(xì)胞游走到腎臟組織，產(chǎn)生細(xì)胞因子，增強(qiáng)白細(xì)胞的黏附，加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，造成血管通透性增強(qiáng)、蛋白漏出，形成蛋白尿[7]，并引起細(xì)胞外基質(zhì)沉積，腎小球和腎小管間質(zhì)纖維化[8]，因此ICAM-1作為一項(xiàng)重要的指標(biāo)反映了DKD的早期病變，參與了DKD的發(fā)病機(jī)制[9]。有報(bào)道顯示ARB類藥物伊貝沙坦能阻止或延緩糖尿病大鼠腎臟的病理?yè)p害，降低ICAM-1mRNA的表達(dá)水平[10]。

澳大利亞學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，患有糖尿病的小鼠與健康小鼠相比，在8月齡時(shí)可出現(xiàn)蛋白尿、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)癥狀，而ICAM-1基因敲除的小鼠在6個(gè)月和8個(gè)月時(shí)尿蛋白分別下降77%和85%，腎小球肥大和腎小管損傷得到改善，并可延緩腎臟纖維化進(jìn)展[11]。長(zhǎng)期的臨床研究表明，中醫(yī)中藥在防治和延緩DKD的發(fā)展上具有一定的作用[12-13]。本研究Western blot及RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，ICAM-1在糖尿病模型組表達(dá)均明顯增強(qiáng)，表明ICAM-1可能在高糖狀態(tài)下被激活；給予糖腎安干預(yù)后，腎臟組織及腎系膜細(xì)胞ICAM-1表達(dá)量均明顯降低。提示糖腎安可抑制高糖環(huán)境下糖尿病大鼠腎臟及腎系膜細(xì)胞炎性因子ICAM-1的表達(dá)，減輕腎臟組織病理學(xué)改變，其腎臟保護(hù)作用可能與抑制ICAM-1表達(dá)水平有關(guān)。

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Effect of Tangshenan decoction on expression of inflammatory factor ICAM-1 of rat kidney and kidney mesangial cell in high sugar environment

HU Shuang1，WANG Mei2

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032,Liaoning, China；2.The Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110032, Liaoning,China)

Objective It is to explore the effect of Tangshenan decoction on the expression of inflammatory factor ICAM-1 of rat kidney and kidney mesangial cell in high sugar environment. Methods Experiment I:50 SPF healthy SD rats were randomly divided into normal group and model building group,the rats in model building group were fed with high-sugar high-fat diet for 4 weeks,then they were given Streptozotocin by intraperitoneal injection one time to induce type 2 diabetes models.The rat models successfully established were randomly divided into model group,Tangshenan high,medium and low concentration groups,western medicine group which were treated with respective drugs for 8 weeks,then their kidney specimens were collected for observation.Experiment II: The rat renal mesangial cell lines after the thawing recovery were used to make cell suspension,then they were divided according to the method in experiment I. The cells were collected after every drug intervention group was cultured under respective drug-containing serum for 24 h. ICAM-1 expression was detected by Westernblot,RT-PCR. Results Experiment I:The expression of ICAM-1 in the model group,low and middle Tangshenan group,western medicine group were higher than that in normal group(P<0.05);that in Tangshenan groups and western medicine group were significantly lower than that in model group(P<0.05);that in Tangshenan high dose group was lower than that in middle and low dose of Tangshenan groups and western medicine group (P<0.05).Experiment II:The expression of ICAM-1 in every drug intervention group was higher than that in normal group but lower than that in model group(P<0.05);the expression in Tangshenan high dose group was lower than that in middle and low dose of Tangshenan groups(P<0.05). Conclusion Traditional Chinese medicine Tangshenan decoction could inhibit the expression of cell inflammatory factor ICAM-1 in rat kidney and kidney mesangial cell,relieve kidney tissue pathology change. The renal protective effect may be related to regulating ICAM-1 expression level.

Tangshenan decoction；kidney of rats；renal mesangial cells;ICAM-1

胡爽，女，在讀碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合內(nèi)分泌代謝研究工作。

王鎂，E-mail：wm896464@163.com

沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(F14-231-1-11)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.29.001

R-332

A

1008-8849(2016)29-3193-04

2016-04-25