肖學(xué)敏 徐浩翔 惠云 張曉峰 何艷艷 李誠讓 王寶璽

·論著·

反常性痤瘡一家系nicastrin基因突變研究

肖學(xué)敏 徐浩翔 惠云 張曉峰 何艷艷 李誠讓 王寶璽

目的 研究一家系2例漢族反常性痤瘡患者γ分泌酶基因的突變。方法 提取家系中5名成員（2例患者、先證者父親、2例目前未發(fā)病者）的外周血DNA，擴(kuò)增nicastrin蛋白（NCSTN）、早老素（PSEN）1、早老素增強(qiáng)子（PSENEN）、前咽缺陷蛋白（APH1）基因所有外顯子和側(cè)翼序列進(jìn)行測序，并以100例無關(guān)系健康人作為對(duì)照。同時(shí)比較先證者皮損與4個(gè)健康對(duì)照NCSTN基因mRNA表達(dá)差異。結(jié)果 檢測到2例患者血樣DNA存在NCSTN基因中第477位堿基發(fā)生C→A的雜合突變，即c.477C＞A，其余3名家系成員及健康對(duì)照未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)突變；查詢美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫也未發(fā)現(xiàn)此突變。另外，先證者皮損NCSTN mRNA水平較健康對(duì)照明顯減少。結(jié)論 NCSTN基因新的無義突變c.477C＞A是該反常性痤瘡家系的致病突變，并可能通過無義介導(dǎo)的mRNA降解途徑導(dǎo)致該基因功能失活。

反常性痤瘡；基因；突變；系譜；基因，nicastrin

作者單位：350001福州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科（肖學(xué)敏）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院 江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室皮膚科（徐浩翔、張曉峰、何艷艷、李誠讓）；南京總醫(yī)院皮膚科（惠云）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院皮膚科（王寶璽）

反常性痤瘡（OMIM142690）又稱化膿性汗腺炎、毛囊閉鎖三聯(lián)征，是一種慢性復(fù)發(fā)性炎癥性疾病。2010年，Wang等［1］通過全基因組連鎖掃描結(jié)合單倍型分析等技術(shù)，首先發(fā)現(xiàn)編碼γ分泌酶不同亞單位的基因突變可引起部分家族性反常性痤瘡。γ分泌酶是一種跨膜蛋白酶，包含4個(gè)必要組分，分別為：早老素（presenilin，PSEN）、nicastrin 蛋白（NCSTN）、前咽缺陷蛋白（anterior pharynxdefective-1，APH1）、早老素增強(qiáng)子（presenilinenhancer-2，PSENEN）［2］。我們報(bào)道1個(gè)漢族反常性痤瘡家系，并對(duì)其進(jìn)行了γ分泌酶基因突變檢測。

1 資料和方法

1.1 臨床資料：我們鑒定了1個(gè)3代12人中國漢族反常性痤瘡家系，家系中有5例患者（男2例，女3例），遺傳方式屬于常染色體顯性遺傳（圖1）。先證者男，24歲，漢族，7年前無明顯誘因出現(xiàn)后頸、背部黑頭粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)，自覺疼痛，皮損漸增多，并累及頭面部、雙側(cè)腋窩、腘窩、雙上肢，病情逐漸加重形成多處囊腫、膿腫、破潰，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行清創(chuàng)、口服米諾環(huán)素、異維A酸等治療尚可控制，但反復(fù)有新疹出現(xiàn)，皮疹愈后留有大量萎縮性不規(guī)則形瘢痕。3年前在臀部出現(xiàn)類似改變，不斷出現(xiàn)新發(fā)囊腫、膿腫，部分相互融合形成竇道，呈篩孔狀，有血性膿液溢出（圖2）。既往體健，有吸煙史7年，約每天10支。家系中其余4例患者有類似癥狀均在青春期發(fā)病，癥狀比先證者輕微，皮損主要累及頸后、背部及臀部，其母親皮損見圖3。家系中所有患者均符合反常性痤瘡的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］。

圖1 家系圖

1.2 方法：

1.2.1 外周血及皮損DNA的提取：獲得知情同意后，抽取該家系中2例患者即先證者（Ⅲ1）與其母親（Ⅱ1）、先證者父親（Ⅱ2）、2例目前未發(fā)病者（Ⅲ2、Ⅲ3）及與該家系無關(guān)的100例健康人外周血2 ml。采用美國Promega公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA。同時(shí)提取100例與家系無血緣關(guān)系的健康成人的基因組DNA作為對(duì)照。本研究經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增和直接測序：根據(jù)已知γ分泌酶基因四亞基各亞型基因序列［1］，對(duì)其所有外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子序列使用在線Primer 5.0程序設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的引物。PCR反應(yīng)體系50 μl，反應(yīng)液成分包括25 μl Mix，上下游引物各 1 μl，DNA 模板 1 μl，加入ddH2O補(bǔ)足至50 μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 3 min、95℃變性 30 s、56℃ ～63℃退火 45 s、72℃延伸45 s、41個(gè)循環(huán)；41個(gè)循環(huán)后再72℃延伸5min。2%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增的目的片段經(jīng)回收、PCR純化試劑盒（德國Qiagen公司）純化、ABI3730自動(dòng)測序儀（美國Applied Biosystems公司）進(jìn)行核苷酸序列測定。測序結(jié)果與人基因組γ分泌酶基因序列比較，使用Phred-Phrap-Consed軟件包（version 12.0）進(jìn)行分析，如存在異常再進(jìn)行反向測序。

圖2 先證者頸后部（2A）及臀部（2B）廣泛的囊腫、膿腫、竇道、瘢痕

圖3 先證者母親頸后部表現(xiàn)為相對(duì)較輕的反常性痤瘡

1.2.3 實(shí)時(shí)PCR法測定皮損中NCSTN基因mRNA水平的表達(dá)：在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院皮膚外科取先證者臀部皮損及4例與該家系無關(guān)的健康對(duì)照相同部位皮膚，盡量切除皮下組織。生理氯化鈉溶液清洗皮膚，吸干，置-80℃冰箱保存。取50～100mg冰凍皮膚組織，于低溫下快速粉碎，用Trizol核酸抽提試劑（美國Invitrogen公司）提取總RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）說明合成cDNA，再用該公司DNA擴(kuò)增試劑盒，根據(jù)說明進(jìn)行PCR反應(yīng)。使用在線Primer 5.0程序設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。NCSTN上游引物為 5′-AATGTGAGCTATCCCAATG-3′，下游引物為5′-GCGATGTAATGTTGAAGAGGC-3′；β肌動(dòng)蛋白上游引物為5′-CCATCGTCCACCGAA AT-3′，下游引物為5′-GCTGTCACCTTCACCGTT CC-3′。PCR反應(yīng)體系置于ABI 7300 Real Time PCR儀（美國Applied Biosystems公司）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min、95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸 30 s，共40個(gè)循環(huán)；40個(gè)循環(huán)后再72℃延伸 5 min。采用 2-△△CT法對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，△CT值表示循環(huán)數(shù)，β肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參照?！鳌鰿T（目的基因）=△CT（目的基因）-△CT（β肌動(dòng)蛋白），目的基因的相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT。陰性對(duì)照加雙蒸水作為模板，重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果

我們對(duì)2例患者血樣NCSTN基因第5對(duì)引物的PCR產(chǎn)物測序后發(fā)現(xiàn)，患者NCSTN基因第5號(hào)外顯子含有雜合性無義突變：第477位堿基胞嘧啶突變?yōu)轼B嘌呤，即c.477C＞A，對(duì)應(yīng)密碼子TGC變成TGA，導(dǎo)致第159位的中性半胱氨酸殘基被終止密碼子替代，即p.C159X（NCSTN GenBank NM_015331.2和NP_056146.1），導(dǎo)致NCSTN前體蛋白缺失了551個(gè)氨基酸。先證者父親、家系中2例目前未發(fā)病者以及100例健康對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)有此突變（圖4）。為探討該突變對(duì)NCSTN mRNA的影響，對(duì)先證者皮損和4例健康對(duì)照用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測NCSTNmRNA水平的表達(dá)，可見先證者皮損NCSTNmRNA水平較健康對(duì)照明顯減少（圖5）。

3 討論

反常性痤瘡多發(fā)于腋窩、腹股溝、肛周、會(huì)陰和乳房下等皺褶部位；臨床表現(xiàn)為痛性皮下結(jié)節(jié)和膿腫，常伴皮膚附屬器破壞、竇道和瘢痕形成。約40%的患者有家族史，屬常染色體顯性遺傳［2］。目前已在反常性痤瘡患者的γ分泌酶基因上發(fā)現(xiàn)了27個(gè)不同的突變位點(diǎn)，其中發(fā)生在NCSTN基因上的有22 個(gè)，均為功能缺失性突變［4-5］。由此可見，NCSTN亞基改變?cè)诜闯Ｐ责畀彴l(fā)病過程中有著重要作用。NCSTN屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，由一個(gè)胞外域和一個(gè)C末端TM組成，參與γ分泌酶的組裝、成熟及穩(wěn)定，最近發(fā)現(xiàn)還具有募集γ分泌酶底物的功能［6-7］。

本研究中，我們?cè)?個(gè)反常性痤瘡家系中發(fā)現(xiàn)先證者及其母親第5號(hào)外顯子含有雜合性無義突變c.477C＞A。先證者父親、家系中2例目前未發(fā)病者以及正常對(duì)照均未發(fā)現(xiàn)有此突變，查詢美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫也未發(fā)現(xiàn)此突變，從而證實(shí)了檢測到的突變是特異性的突變，非核苷酸多態(tài)性。先證者皮損NCSTN mRNA水平較健康對(duì)照明顯減少，說明該突變可通過“無義介導(dǎo)的mRNA降解（nonsense-mediatedmRNA decay）”途徑導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄本表達(dá)缺失，可能使基因編碼的蛋白質(zhì)失去原有的功能，因此，該基因突變屬于功能缺失性突變。另外，本研究發(fā)現(xiàn)的無義突變與既往報(bào)道的4個(gè)無義突變均位于NCSTN亞基的胞外域，進(jìn)一步證實(shí)了胞外域在γ分泌酶復(fù)合體的功能及反常性痤瘡的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用［8］。同時(shí)，我們通過基因庫檢索該突變的相對(duì)蛋白位置，發(fā)現(xiàn)在所有真獸亞綱物種中Cys159屬于保守氨基酸殘基，此位置在長期進(jìn)化過程中未被其他氨基酸替代，表明其對(duì)保持蛋白活性發(fā)揮重要作用。

圖4 NCSTN基因測序結(jié)果 4A：先證者血樣NCSTN基因第477位堿基（箭頭）顯示1個(gè)雜合性突變，1條染色單體上的C轉(zhuǎn)換為A；4B：家系內(nèi)健康人NCSTN基因?qū)?yīng)序列無突變

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR NCSTN 先證者皮損NCSTN mRNA水平較健康對(duì)照明顯減少

NCSTN基因突變?cè)诜闯Ｐ责畀彴l(fā)病中的機(jī)制尚不清楚。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，NCSTN基因缺陷的小鼠會(huì)出現(xiàn)毛囊角化過度、表皮囊腫形成等類似人類反常性痤瘡的表現(xiàn)，而小鼠缺乏頂泌汗腺，提示毛囊栓塞為反常性痤瘡的初始及最主要的致病因素［9］。γ分泌酶的底物中，Notch分子與表皮細(xì)胞分化增殖、毛囊終末分化密切相關(guān)，Notch基因失活的小鼠也出現(xiàn)了類似人類反常性痤瘡的表型［10］。因此，NCSTN基因功能缺失性突變通過導(dǎo)致γ分泌酶-Notch信號(hào)通路受損，進(jìn)而誘發(fā)毛囊漏斗部異常角化及栓塞形成可能在本病發(fā)病中起關(guān)鍵作用。值得一提的是，本家系中先證者較家系中其他患者癥狀要重，這可能與該患者有較長的吸煙史有關(guān)，而其他患者無吸煙史。已有研究證實(shí)，吸煙是反常性痤瘡發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一，吸煙可能進(jìn)一步損害已經(jīng)存在缺陷的 Notch信號(hào)通路，導(dǎo)致病情加重［5］。

綜上所述，本研究在一個(gè)漢族反常性痤瘡家系中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)新的NCSTN基因的無義突變c.477C＞A，擴(kuò)大了反常性痤瘡致病基因的突變譜，皮損中NCSTN表達(dá)降低為NCSTN基因功能缺失性突變導(dǎo)致單倍劑量不足是反常性痤瘡發(fā)病的分子基礎(chǔ)這一觀點(diǎn)提供了證據(jù)，也為后續(xù)探討反常性痤瘡基因型和表型之間的相關(guān)性、闡明反常性痤瘡發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Mutation analysis of the nicastrin gene in a Chinese pedigree with acne inversa

Xiao Xuemin*,Xu Haoxiang,Hui Yun,Zhang Xiaofeng,He Yanyan,Li Chengrang,Wang Baoxi.*Department of Dermatology,Union Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China

Objective To identify mutations of the γ-secretase gene in two patients with acne inversa（AI） in a Chinese pedigree.Methods Blood samples were obtained from 5 family members （including 2 patients,the proband′s father,2 unaffected family members） and 100 unrelated healthy controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples,and PCR was conducted to amplify all the exons and their flanking sequences of nicastrin （NCSTN）,presenilin-1 （PSEN1）,presenilin enhancer（PSENEN） and anterior pharynx-defective 1 （APH1） genes,followed by direct sequencing.Besides,the NCSTN mRNA expression in skin lesions of the proband was compared with that in the normal skin of 4 healthy controls.Results A heterozygous mutation （c.477C ＞ A） at position 477 in the exon 5 of the NCSTN gene,which had not been described previously in the National Center for Biotechnology Information （NCBI） single nucleotide polymorphism database,was identified in the 2 patients,but not observed in the other 3 unaffected family members or the 100 unrelated controls.Additionally,the mRNA expression of NCSTN was evidently decreased in the lesions of the proband compared with the normal skin of healthy controls.Conclusion The novel nonsense mutation c.477C＞ A in the NCSTN gene is the causative mutation of AI in this family,and it may induce functional inactivation of NCSTN through the nonsense-mediated mRNA decay.

Acne inversa;Genes;Mutation;Pedigree;Genes,nicastrin

s:Li Chengrang,Email:nylcr72@163.com;Wang Baoxi,Email:wangbx@ncstdlc.org

國家自然科學(xué)基金（81472905，81472872）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金（3332013056）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China （81472905,81472872）;PUMC Youth Fund （3332013056）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.04.001

李誠讓，Email:nylcr72@163.com;王寶璽，Email:wangbx@ncstdlc.org

2015-07-06）