丁晨召 任蕾 樂昊 李靜 趙天雪 秦貴軍

450052鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南省內(nèi)分泌及代謝病診療中心

HPGD基因缺失突變致厚皮性骨膜病一例

丁晨召 任蕾 樂昊 李靜 趙天雪 秦貴軍

450052鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南省內(nèi)分泌及代謝病診療中心

目的 通過基因測序，在分子水平確診厚皮性骨膜病1例。方法 收集1例26歲男性厚皮性骨膜病患者及其父母外周血DNA，PCR擴(kuò)增HPGD及SLCO2A1基因外顯子片段，通過基因測序查找有無突變。根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的同源性分析。結(jié)果 基因測序結(jié)果顯示，患者HPGD基因第3外顯子存在移碼突變c.310_311delCT（p.L104AfsX3），為純合子，其母為該突變的雜合子攜帶者，其父正常。蛋白空間結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，上述基因突變可使編碼蛋白縮短60%。結(jié)論 厚皮性骨膜病的典型臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)有助于診斷，HPGD、SLCO2A1基因突變測定則是確診的主要方法。

骨關(guān)節(jié)病，原發(fā)肥大性；突變；HPGD基因；SLCO2A1基因

厚皮性骨膜病（pachydermo-periostosis）又稱原發(fā)性肥大性骨關(guān)節(jié)?。╬rimary hypertrophic osteoarthro-pathy，PHO），是一種罕見的遺傳性疾病。目前已報道的病例中，既有呈常染色體隱性遺傳，也有呈不完全外顯的常染色體顯性遺傳，其發(fā)病機(jī)制及遺傳方式尚未確定［1］。Uppal等和 Martínez-Ferrer等［2-3］證明編碼15-羥基前列腺素脫氫酶（15-PGDH）的基因HPGD（NM_000860）為本病的致病基因。Zhang 等［4］認(rèn)為本病的發(fā)生亦與SLCO2A1基因（NM_005630.2）突變有關(guān)，該基因與前列腺素E2（PGE2）在細(xì)胞內(nèi)外的轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。本研究報道1例基因診斷明確的PHO患者。

一、病歷資料

患者男，26歲。6歲時出現(xiàn)手指、足趾增粗，16歲時出現(xiàn)皮膚粗糙增厚，近5年出現(xiàn)長距離行走后足跟疼痛。父母及一姐體健，父母非近親結(jié)婚。體檢：皮膚粗厚，油膩潮濕，毛孔粗大，頭面部皮膚過度增生，頭部皮膚形成深褶，呈腦回狀（圖1）。手指、足趾末端增粗，呈杵狀指（圖2），不能做精細(xì)動作，手指、足趾、雙膝關(guān)節(jié)粗大，雙足跟壓痛。未見其他陽性體征。實驗室檢查：血堿性磷酸酶135 U/L（0～40 U/L），肝腎功能及血常規(guī)、血鈣、血磷等生化指標(biāo)均正常，血卵泡刺激素、促黃體生成素、泌乳素、睪酮、雌二醇、生長激素、胰島素樣生長因子1均正常，甲狀腺激素及腎上腺激素正常。影像學(xué)檢查：垂體MRI正常。手足部正側(cè)位X線片：雙足第1腳趾遠(yuǎn)端趾骨缺失，雙踝關(guān)節(jié)及跗、跖關(guān)節(jié)模糊，間隙顯示不清；雙手遠(yuǎn)端指間關(guān)節(jié)屈曲，關(guān)節(jié)面邊緣骨質(zhì)輕度增生，間隙存在；雙腕關(guān)節(jié)骨質(zhì)密度稍減低，局部關(guān)節(jié)面邊緣較模糊。尺橈骨及脛骨正側(cè)位X線片：雙側(cè)尺橈骨骨干端肥大增生，關(guān)節(jié)間隙變窄；骨膜增厚、毛糙；左右膝關(guān)節(jié)形態(tài)結(jié)構(gòu)完好，脛骨平臺、股骨下端邊緣見骨質(zhì)增生，關(guān)節(jié)間隙略變窄；骨膜增厚、毛糙。彩超：左側(cè)陰囊結(jié)石，雙側(cè)附睪頭多發(fā)囊腫。額部正中近發(fā)際線處皮膚組織病理檢查：皮膚真皮層及皮下組織、結(jié)締組織、皮脂腺、汗腺、真皮內(nèi)毛細(xì)血管等結(jié)構(gòu)增生，毛囊間真皮網(wǎng)狀層存在大量嗜堿性粘液樣物質(zhì)。骨密度測定：腰椎部呈輕度骨質(zhì)疏松，股骨頸部骨量正常，大轉(zhuǎn)子部、Wards Tn部輕度骨量減少。臨床診斷：厚皮性骨膜病。

圖1 患者面部皮膚過度增生，油膩潮濕，毛孔粗大

圖2 手指呈杵狀指，關(guān)節(jié)粗大

二、方法

1.DNA提?。夯颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺螅羧』颊呒捌涓改赋科鹂崭雇庵莒o脈血2 ml（肝素抗凝），采用QIAamp DNA Blood Mini Kits劑盒（德國Qiagen公司）提取基因組DNA，測定濃度后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.PCR擴(kuò)增：通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得HPGD基因序列（NM_000860）及SLCO2A1基因序列（MN_005630.2），應(yīng)用Primer3.0設(shè)計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。對上述基因全部外顯子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化及基因測序。

3.突變證實：對發(fā)現(xiàn)的純合缺失突變進(jìn)行反向測序，運用Chromas2軟件將測序結(jié)果與NCBI的參考序列進(jìn)行比較。

4.蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測：通過PDB蛋白數(shù)據(jù)庫查找正常氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)，將突變后基因序列翻譯成氨基酸序列，應(yīng)用PYMOL軟件模擬蛋白空間結(jié)構(gòu)（圖3）。

三、結(jié)果

通過將HPGD及SLCO2A1的全部編碼外顯子的測序結(jié)果與正常序列對比，發(fā)現(xiàn)患者HPGD基因外顯子3的堿基序列第310和311位的胞嘧啶和胸腺嘧啶發(fā)生純合缺失，終止密碼子提前出現(xiàn)，即c.310_311delCT（p.L104AfsX3）。患者的父母均未患病，但其母為這種突變的雜合攜帶者，其父則為正?；蛐停▓D4）。c.310_311delCT導(dǎo)致移碼突變，使HPGD基因編碼的第104位氨基酸由亮氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，并使終止密碼子提前出現(xiàn)。將堿基序列翻譯為氨基酸序列，并預(yù)測突變蛋白的空間結(jié)構(gòu)，可發(fā)現(xiàn)與正常15-PGDH蛋白相比，突變蛋白缺失大量與輔酶、PGE2的結(jié)合區(qū)域以及酶活性位點，肽鏈長度縮短約60%?；颊呒捌涓改妇磾y帶SCOL2A1基因突變。

圖3 15-羥基前列腺素脫氫酶蛋白質(zhì)（15-PGDH）空間結(jié)構(gòu)預(yù)測圖 3A：正常15-PGDH空間結(jié)構(gòu)；3B：患者突變基因合成蛋白的空間結(jié)構(gòu)；3C：正常15-PGDH與NAD+結(jié)合示意圖（藍(lán)色結(jié)構(gòu)為正常15-PGDH，紅色結(jié)構(gòu)為NAD+）

圖4 基因測序結(jié)果 患者基因型為純合c.310_311delCT（-/-型），患者母親基因型為TG/-型，患者父親基因型為TG/TG型

四、討論

目前認(rèn)為與本病發(fā)病相關(guān)的基因有HPGD及SLCO2A1［2-4］。HPGD 基因位于染色體 4q34.1，包含 7個外顯子，編碼由266個氨基酸組成的15-PGDH［5］，該酶催化PGE2脫氫生成酮基前列腺素（PGE-M），從而降低 PGE2 活性［6］。本文患者攜帶的c.310_311delCT（p.L104AfsX3）突變在mRNA水平上提前產(chǎn)生終止密碼，使蛋白長度縮短60%，參與催化反應(yīng)的活性位點及結(jié)合位點均缺失，導(dǎo)致合成的蛋白喪失功能，不能催化PGE2分解。患者體內(nèi)PGE2長期增高，最終表現(xiàn)出PHO的典型特征。按照本病的臨床表現(xiàn)可分為三型：①完全型：有典型的杵狀指、皮膚肥厚及骨膜增生三種表現(xiàn)；②不完全型：有個別的骨改變和局限性皮膚改變；③頓挫型：有皮膚肥厚，伴輕微或無骨膜反應(yīng)。本例患者攜帶純合缺失突變，臨床表現(xiàn)典型，屬于完全型。

SLCO2A1基因位于3q21，包含14個外顯子，編碼前列腺素轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白在PGE2的跨細(xì)胞膜攝取過程起主要作用［7］。這種攝取過程是PGE2在胞質(zhì)內(nèi)氧化分解的前提。因此，SLCO2A1、HPGD基因缺陷均會導(dǎo)致厚皮性骨膜病，其臨床表現(xiàn)無明顯差異［8］，但SLCO2A1基因缺陷會造成患者排泄PGE2、PGE-M均升高，而HPGD基因缺陷患者的血、尿中PGE-M 則降低［4］。

厚皮性骨膜病應(yīng)與繼發(fā)性骨膜增生癥相鑒別。兩者發(fā)病機(jī)制相同、臨床表現(xiàn)相似，鑒別要點在于厚皮性骨膜病患者多為童年時起病，伴不同程度的生長發(fā)育障礙，而繼發(fā)性患者以中老年為主，多有心血管畸形、支氣管肺癌等慢性心肺疾病為基礎(chǔ)。此外，生長激素瘤等疾病也有杵狀指、皮膚增生粗厚等臨床表現(xiàn)，但此類患者還具有鼻頭、舌體肥大等臨床表現(xiàn)，血生長激素、垂體MRI等輔助檢查可鑒別。

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A case of pachydermoperiostosis caused by a deletion mutation in the HPGD gene

Ding Chenzhao,Ren Lei,Yue Hao,Li Jing,Zhao Tianxue,Qin Guijun
Department of Endocrinology,First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Henan Clinical Center for Endocrine and Metabolic Diseases,Zhengzhou 450052,China

ObjectiveTo confirm a case of pachydermoperiostosis （primary hypertrophic osteoarthropathy）at the molecular level by gene sequencing.MethodsPeripheral blood samples were obtained from a 26-year-old male patient with pachydermoperiostosis and his parents,and DNA was extracted from these blood samples.Polymerase chain reaction（PCR）was performed to amplify all the exons of HPGD and SLCO2A1 genes,and gene sequencing to identify gene mutations.According to sequencing results,the spatial structure of relevant proteins was predicted.ResultsGene sequencing showed a homozygous frame-shifting mutation c.310_311delCT（p.L104AfsX3）in exon 3 of the HPGD gene in the patient.His mother was a heterozygous carrier of the mutation,but no mutation was identified in his father.The prediction of spacial structure of proteins revealed that the above gene mutation could shorten the length of the encoded peptide by about 60%.ConclusionTypical clinical manifestations and imaging findings are helpful for the primary diagnosis of pachydermoperiostosis,while mutation analysis of HPGD and SLCO2A1 genes is a main approach to its final diagnosis.

Osteoarthropathy,primary hypertrophic;Mutation;HPGD gene;SLCO2A1 gene

Qin Guijun,Email:hyqingj@zzu.edu.cn

2015-04-10）

（本文編輯：顏艷）

秦貴軍，Email：hyqingj@zzu.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.013