李云珠 路雪艷 姜薇 李鄰峰

100045北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科（李云珠）；北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科（路雪艷、姜薇）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院皮膚科（李鄰峰）

青鵬軟膏對皮膚干燥志愿者及特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型皮膚屏障功能的影響

李云珠 路雪艷 姜薇 李鄰峰

100045北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院皮膚科（李云珠）；北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科（路雪艷、姜薇）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院皮膚科（李鄰峰）

目的 探討青鵬軟膏對皮膚屏障功能的影響及其可能機(jī)制。方法 招募12名小腿伸側(cè)皮膚干燥的女性志愿者，青鵬軟膏涂于右小腿伸側(cè)（青鵬側(cè)）、青鵬軟膏基質(zhì)涂于左小腿伸側(cè)（基質(zhì)側(cè)），用藥7 d。分別于用藥前、用藥3 d及用藥7 d測定皮膚屏障功能相關(guān)指標(biāo)，如，經(jīng)表皮失水量（TEWL）及角質(zhì)層含水量。2,4-二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠背部產(chǎn)生特應(yīng)性皮炎樣改變，分別外用青鵬軟膏基質(zhì)（基質(zhì)組），50%、75%、100%青鵬軟膏治療（50%、75%、100%青鵬組），每天2次，用藥2周后，進(jìn)行組織病理檢查，背部皮褶厚度、TEWL的測定，免疫組化測定表皮絲聚蛋白，外皮蛋白及激肽釋放酶7含量。結(jié)果 志愿者外用青鵬軟膏及其基質(zhì)，3 d、7 d后均較治療前TEWL顯著下降（青鵬側(cè)t=2.651、3.615；基質(zhì)側(cè)t=2.996、3.586，均P＜0.05），含水量顯著上升（青鵬側(cè)t=9.029、13.842；基質(zhì)側(cè)t=5.830、11.299，均P＜0.001）。青鵬側(cè)及基質(zhì)側(cè)TEWL、含水量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從外觀、皮褶厚度及組織病理看，基質(zhì)組小鼠與模型組相比，皮炎程度差異不大，各青鵬組小鼠皮炎均有不同程度緩解。基質(zhì)組、青鵬組TEWL均較模型組下降（P＜0.05），而基質(zhì)組與青鵬組TEWL比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。基質(zhì)組、青鵬組KLK7表達(dá)均較模型組下降（P＜0.05），但各治療組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 青鵬軟膏基質(zhì)有改善皮膚屏障功能的作用。

皮炎，特應(yīng)性；模型，動(dòng)物；小鼠；皮膚；志愿者；青鵬軟膏；皮膚屏障

青鵬軟膏是一種外用中成藥，臨床上用于治療濕疹皮炎類皮膚病，特別是亞急性（非滲出）及慢性濕疹有良效［1-3］。皮膚屏障功能異常是濕疹重要的發(fā)病基礎(chǔ)，而青鵬軟膏對皮膚屏障功能的影響值得研究。本研究首先在小腿皮膚干燥的志愿者中，觀察青鵬軟膏及其基質(zhì)對志愿者經(jīng)表皮失水量（TEWL）及角質(zhì)層含水量的影響，然后外用致敏劑在小鼠皮膚制備特應(yīng)性皮炎樣模型，此種小鼠模型表皮屏障功能存在明顯異常，TEWL增加，角質(zhì)層含水量下降，與皮膚屏障相關(guān)的一些蛋白：絲聚蛋白、外皮蛋白、激肽釋放酶7等表達(dá)也出現(xiàn)變化［4］。本研究應(yīng)用這種皮膚屏障受損的動(dòng)物模型，研究青鵬軟膏對皮膚屏障功能影響及其可能機(jī)制。

一、資料和方法

（一）資料：6周齡BALB/c雌鼠36只，均產(chǎn)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號LA 2012-66。青鵬軟膏（規(guī)格15 g）及青鵬軟膏基質(zhì)均由西藏奇正藏藥股份有限公司提供，配制成50%、75%、100%3個(gè)濃度。2,4-二硝基氟苯（DNFB，日本W(wǎng)ako公司），配置成0.5%和0.2%的濃度。絲聚蛋白抗體（美國Novus公司），外皮蛋白抗體（英國Abcam公司），激肽釋放酶7抗體（美國Santa Cruz公司）。皮膚測試儀（德國Courage-khazaka公司）。

（二）臨床試驗(yàn)：

1.病例選擇：小腿伸側(cè)皮膚干燥的志愿者，且局部皮膚出現(xiàn)細(xì)小白色鱗屑，無明顯紅斑、丘疹等表現(xiàn)。

2.試驗(yàn)方法：將青鵬軟膏涂于右小腿伸側(cè)（青鵬側(cè)）、青鵬軟膏基質(zhì)涂于左小腿伸側(cè)（基質(zhì)側(cè)），每天2次，每次用量均為2個(gè)指尖單位，共用藥7 d。要求志愿者不要改變用藥前的洗護(hù)習(xí)慣，直至試驗(yàn)結(jié)束。

3.皮膚屏障功能測定：在用藥前、用藥3 d及用藥7 d，分別測定皮膚屏障功能相關(guān)指標(biāo)。測定在無陽光直射、無風(fēng)，室溫22～24℃，濕度40%～60%的環(huán)境中進(jìn)行，志愿者靜息10～20 min，使用皮膚測試儀測定志愿者小腿脛前皮膚TEWL和角質(zhì)層含水量，每個(gè)指標(biāo)檢測3次，取其平均值。

（三）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：

1.動(dòng)物模型的制備［5］：小鼠飼養(yǎng)于恒溫恒濕清潔級環(huán)境中，飼養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前一天，用理發(fā)器剃除小鼠背部面積2 cm×4 cm毛發(fā)，再用電動(dòng)剃須刀，將殘余毛發(fā)剃除干凈，注意勿損傷小鼠皮膚。將36只小鼠隨機(jī)分為6組，每組6只。一組小鼠不予任何制劑和藥物外涂，作為空白對照（空白組）。其余小鼠用0.5%DNFB 100 μl外涂背部進(jìn)行2次誘導(dǎo)（間隔2～3 d）；實(shí)驗(yàn)第2周起于背部外涂0.2%DNFB 100 μl進(jìn)行激發(fā)，每周 2次（間隔 2～ 3 d），連續(xù) 4周；于治療第8天（實(shí)驗(yàn)第7周起的第1天）再次給予0.2%DNFB 100 μl激發(fā) 1 次。

2.藥物治療：第6周開始實(shí)驗(yàn)，一組模型小鼠不予外用治療藥物，作為未治療組（模型組），其余4組模型小鼠分別接受背部皮損處外用青鵬軟膏基質(zhì)（簡稱基質(zhì)組）、50%、75%、100%青鵬軟膏的治療（50%、75%、100%青鵬組），每天2次，連續(xù)用藥2周。

3.檢測方法：用藥2周后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測：①大體觀察：肉眼觀察小鼠皮炎情況；②皮膚厚度測定：應(yīng)用千分尺測量小鼠背部皮褶厚度，每只小鼠背部隨機(jī)測量3處不同部位厚度值，取平均值的 1/2 作為皮膚厚度值（μm）［5］；③TEWL測定：在處死小鼠前，用皮膚測試儀檢測皮膚TEWL。每只小鼠隨機(jī)檢測背部3處不同部位，所得值取平均數(shù)；④組織病理：處死小鼠，取背部涂藥處皮膚，經(jīng)HE染色觀察表皮厚度及形態(tài)學(xué)變化；⑤免疫組化：取背部涂藥處皮膚，甲醛固定，制成石蠟切片，按步驟加入絲聚蛋白，外皮蛋白或激肽釋放酶7抗體、二抗及顯色劑。免疫組化圖片使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行表皮細(xì)胞平均吸光度值的檢測，比較不同組間表皮細(xì)胞吸光度值，推測各組目的蛋白表達(dá)強(qiáng)度的差異。

（四）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用±ss表示，采用配對t檢驗(yàn)比較志愿者治療前后及左右側(cè)脛前皮膚TEWL和角質(zhì)層含水量，采用單因素方差分析比較各組小鼠皮膚厚度、TEWL、皮膚屏障相關(guān)因子蛋白表達(dá)量，采用LSD法進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

（一）臨床試驗(yàn)：共12名女性參與研究，年齡（34.75±9.06）歲。青鵬軟膏和基質(zhì)治療前后，志愿者左右腿脛前皮膚TEWL和角質(zhì)層含水量見表1。青鵬軟膏用藥3 d，較用藥前TEWL 顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.651，P=0.024）；用藥7 d，TEWL較用藥前及用藥3 d均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.615、3.260，P=0.004、0.009）。用藥 3 d、用藥7 d角質(zhì)層含水量均較用藥前顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.029、13.842，均P＜0.001），用藥 7 d與用藥 3 d角質(zhì)層含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.521，P=0.159）。

基質(zhì)側(cè)用藥3 d，較用藥前TEWL顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.996，P=0.013）；用藥 7 d，TEWL 較用藥前及用藥3 d均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.586、3.108，P=0.004、0.011）。用藥3 d含水量較用藥前顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.830，P=0.000）。用藥7 d，含水量較用藥前及用藥3 d均顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.299、2.472，P=0.000、0.033）。治療前，治療3 d及治療7 d，分別比較青鵬軟膏與基質(zhì)治療后脛前皮膚TEWL和角質(zhì)層含水量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1 志愿者左右腿脛前皮膚不同治療時(shí)間經(jīng)表皮失水量和角質(zhì)層含水量比較（μm，±s）

表1 志愿者左右腿脛前皮膚不同治療時(shí)間經(jīng)表皮失水量和角質(zhì)層含水量比較（μm，±s）

注：a：與用藥前相比，P ＜ 0.05，b：與用藥 3 d 相比，P ＜ 0.05

分組 例數(shù) 經(jīng)表皮失水量 角質(zhì)層含水量0 d 3 d 7 d 0 d 3 d 7 d青鵬側(cè)（右腿） 12 42.49±15.04 33.20±7.93a 28.43±4.01ab 46.66±6.63 61.53±8.57a 64.75±5.76a基質(zhì)側(cè)（左腿） 12 43.65±14.93 32.25±7.39a 28.46±4.64ab 47.31±7.14 62.56±8.20a 67.20±5.46ab t值 0.670 1.082 0.047 0.492 0.535 2.088 P值 0.517 0.305 0.964 0.632 0.604 0.061

圖1 6組小鼠皮膚大體改變 1A～1F：治療2周后各組小鼠皮損炎癥程度從模型組至100%青鵬組依次減輕：模型組背部可見明顯紅斑脫屑，皮膚紅腫；治療組各組背部均未見明顯鱗屑，皮膚腫漲程度隨給藥濃度增加而逐漸減輕

（二）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：

1.大體觀察：除空白組，治療前各組小鼠背部皮膚可見明顯紅斑、浸潤增厚、漿痂、鱗屑。藥物治療2周后，模型組小鼠背部皮膚仍有明顯紅斑、浸潤增厚、漿痂、鱗屑；基質(zhì)組小鼠背部皮膚雖未見明顯漿痂，但紅斑、增厚等皮損表現(xiàn)與模型組無明顯差異；各種濃度的青鵬組小鼠背部皮炎均有不同程度緩解（圖1）。各組小鼠皮膚組織學(xué)改變見圖2。未經(jīng)治療的模型組小鼠組織病理可見特應(yīng)性皮炎樣改變：棘層肥厚，部分區(qū)域見細(xì)胞間水腫，真皮淺層見大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤。基質(zhì)組小鼠表皮增厚及炎癥細(xì)胞浸潤仍明顯。各組青鵬組小鼠表皮變薄，炎癥細(xì)胞浸潤不同程度減輕。

2.皮膚厚度：采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩之間的多重比較。結(jié)果顯示，基質(zhì)組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），各青鵬組皮膚厚度均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖2 6組小鼠皮膚組織病理改變（HE×100） 2A～2F：模型組小鼠組織病理可見特應(yīng)性皮炎樣改變：棘層肥厚，部分區(qū)域見細(xì)胞間水腫，真皮淺層見大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤；基質(zhì)組小鼠表皮增厚及炎癥細(xì)胞浸潤仍明顯；各濃度青鵬組小鼠表皮變薄，炎癥細(xì)胞浸潤不同程度減輕

表2 6組小鼠皮膚厚度、經(jīng)表皮失水量、皮膚屏障相關(guān)因子蛋白平均表達(dá)量的比較（±s）

表2 6組小鼠皮膚厚度、經(jīng)表皮失水量、皮膚屏障相關(guān)因子蛋白平均表達(dá)量的比較（±s）

注：n=6。a：與模型組相比，P ＜ 0.01；b：與模型組相比，P ＜ 0.05

組別 皮膚厚度（mm）經(jīng)表皮失水量（g·m-2·h-1） 絲聚蛋白 外皮蛋白 激肽釋放酶7空白組 0.35±0.06a 5.12±0.50a 0.55±0.05b 0.71±0.08a 0.42±0.02b模型組 1.07±0.18 30.64±4.10 0.52±0.01 0.54±0.03 0.44±0.02基質(zhì)組 1.06±0.07 11.83±0.68a 0.50±0.01 0.56±0.03 0.41±0.02b 50%青鵬組 0.95±0.03b 12.91±0.70a 0.49±0.02 0.57±0.04 0.41±0.01a 75%青鵬組 0.87±0.08a 14.50±0.76a 0.48±0.03 0.58±0.02 0.41±0.01a 100%青鵬組 0.44±0.06a 13.25±0.61a 0.47±0.02 0.58±0.02 0.40±0.02a

3.TEWL：模型組小鼠TEWL明顯較空白組小鼠升高（P＜0.01）。與模型組相比，基質(zhì)組及3個(gè)青鵬組TEWL均在一定程度上有所降低，但這4個(gè)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2。

4.免疫組化：模型組小鼠表皮內(nèi)絲聚蛋白、外皮蛋白表達(dá)均較空白組小鼠降低（P分別為＜0.05、＜0.01），而激肽釋放酶7則相反（P＜0.05）?；|(zhì)及不同濃度青鵬軟膏對特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型表皮絲聚蛋白和外皮蛋白表達(dá)影響均不大（均P＞0.05），而基質(zhì)和不同濃度青鵬軟膏對激肽釋放酶7表達(dá)均有抑制作用（P＜0.05），但各治療組間差異不大（P＞0.05）。見表 2。

三、討論

皮膚具有保護(hù)人體并抵御外界刺激和傷害的重要功能，除具有物理防護(hù)作用外，還具有生物、化學(xué)、水分等物質(zhì)通透性的調(diào)節(jié)功能。這些功能的遺傳性或獲得性損傷與皮膚病有著密切的聯(lián)系。TEWL測定的是通過皮膚擴(kuò)散入外界環(huán)境的水分，它是皮膚通透屏障功能的一個(gè)重要參數(shù)，皮膚屏障功能受損時(shí)，TEWL增加。研究顯示，慢性皮膚炎癥患者，如，特應(yīng)性皮炎患者，存在明顯的皮膚屏障功能異常，表現(xiàn)為TEWL升高、角質(zhì)層皮脂含量下降、角質(zhì)層細(xì)胞間脂膜皮脂成分變化、某些酶活性改變及絲聚蛋白合成減少等［6］。

絲聚蛋白，外皮蛋白及激肽釋放酶7都是參與表皮終末分化階段的重要蛋白［7］，絲聚蛋白主要存在于表皮顆粒層和透明層，與角蛋白中間絲相互作用，凝聚形成致密的角蛋白纖維束，從而構(gòu)成角質(zhì)形成細(xì)胞扁平堅(jiān)韌的支架結(jié)構(gòu)。同時(shí)，在角質(zhì)形成細(xì)胞向角質(zhì)層分化過程中，該蛋白由顆粒層被釋放至細(xì)胞間隙并逐漸降解，形成多種氨基酸，是皮膚天然保濕因子中的重要組分之一。外皮蛋白緊鄰細(xì)胞膜，構(gòu)成角質(zhì)化包膜的外表面，為其他蛋白在角質(zhì)化包膜上交叉連接提供了支架。激肽釋放酶屬于絲氨酸蛋白酶，它參與角橋粒（角質(zhì)形成細(xì)胞間連接）的裂解，從而使角質(zhì)層細(xì)胞脫落。正常情況下，激肽釋放酶7被絲氨酸蛋白酶抑制劑（LEKTI）抑制，處于失活狀態(tài)，而LEKTI由SPINK5基因編碼，并受表皮pH值調(diào)節(jié)。研究顯示，特應(yīng)性皮炎患者存在SPINK5基因突變，從而可使絲氨酸蛋白酶的活性異常，激肽釋放酶7等活性增加，引起角橋粒非成熟性裂解并增加角質(zhì)形成細(xì)胞的脫落，導(dǎo)致皮膚屏障功能受損［8］。已有研究顯示，在皮膚屏障功能受損的疾病中，絲聚蛋白，外皮蛋白表達(dá)下降［9-10］，激肽釋放酶表達(dá)增加［11］；而外皮蛋白基因敲除的小鼠模型以及過度表達(dá)激肽釋放酶7的小鼠，均出現(xiàn)皮膚屏障受損的特應(yīng)性皮炎樣皮損［12-13］。因此，這些分子表達(dá)的改變將會(huì)影響角質(zhì)層的完整性，從而改變皮膚的屏障功能。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚干燥的志愿者，外用青鵬軟膏或基質(zhì)對皮膚屏障功能的改善作用相同，提示青鵬軟膏基質(zhì)也具有恢復(fù)皮膚屏障功能的作用。在皮膚屏障功能受損的特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型，外用青鵬軟膏或其基質(zhì)均能降低TEWL，改善屏障功能，而青鵬軟膏與基質(zhì)對屏障功能的影響沒有顯著差別。但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)，青鵬軟膏可以減輕皮炎癥狀、降低皮膚厚度，其基質(zhì)則沒有這些作用，說明青鵬軟膏基質(zhì)雖然可以恢復(fù)皮膚屏障功能，但不具備抗炎作用。奇正青鵬軟膏的基質(zhì)成分包括液體石蠟、甘油、水等保濕滋潤成分。既往研究發(fā)現(xiàn)，某些潤膚劑可以改變表皮分化脫落相關(guān)基因的表達(dá)從而改善皮膚屏障功能［14］。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外用青鵬軟膏或基質(zhì)至少可以通過減少激肽釋放酶7在表皮的表達(dá)改善皮膚屏障功能，而不影響絲聚蛋白等，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

聲明 本文無藥廠資助

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Effects ofQingpengointment on skin barrier function in volunteers with xerosis and atopic dermatitis-like mouse models

Li Yunzhu,Lu Xueyan,Jiang Wei,Li Linfeng
Department of Dermatology,Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045,China （Li YZ）;Department of Dermatology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China（Lu XY,Jiang W）;Department of Dermatology,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing 100050,China（Li LF）

ObjectiveTo estimate effects ofQingpengointment on skin barrier function,and to explore their potential mechanisms.MethodsA total of 12 female volunteers with xerosis on the extensor surfaces of legs were enrolled into this study.All the volunteers were topically treated withQingpengointment on the right leg（Qingpengside）and its vehicle on the left leg （vehicle side）twice daily for 7 consecutive days.Skin barrier function-associated indexes including transepidermal water loss（TEWL）and the water content of the stratum corneum were measured before the treatment,after 3-and 7-day treatment separately.Thirty-six BALB/c female mice were randomly and equally divided into 6 groups:a blank control group receiving no induction or treatment,a model group induced by 2,4-dinitrofluorobenzene（DNFB）on the back for 5 consecutive weeks,3Qingpenggroups and a vehicle group induced by DNFB on the back for 5 consecutive weeks followed by topical treatment with different concentrations（50%,75%,100%）ofQingpengointment or its vehicle twice a day for 2 consecutive weeks.At the end of treatment,skin appearance of mice was observed with naked eyes,skinfold thickness and TEWL were measured.Then,all the mice were sacrificed,and skin tissue specimens were resected from the back of mice followed by histopathologic examination and immunohistochemical staining for the detection of filaggrin （FLG）,involucrin（IVL）and kallikrein 7（KLK7）expressions in the epidermis.ResultsAfter start of treatment,both theQingpengside and vehicle side showed significantly decreased TEWL on day 3（t=2.651,2.996,respectively,bothP＜0.05）and 7 （t=3.615,3.586,respectively,bothP＜0.05）,but increased water content of the stratum corneum on day 3（t=9.029,5.830,respectively,bothP＜0.001）and 7（t=13.842,11.299,respectively,bothP＜0.001）compared with those before the treatment.However,no significant differences were observed in TEWL or the water content of the stratum corneum between theQingpengside and vehicle side at any of the time points（allP＞0.05）.In addition,there were no marked differences in mouse skin appearance,skinfold thickness or histopathologic manifestations between the vehicle group and model group,while the manifestations of dermatitis were attenuated to different extents in the threeQingpenggroups compared with the model group.Both TEWL and KLK7 expression levels were significantly decreased in the vehicle group and threeQingpenggroups compared with the model group（allP＜0.05）,but similar between the vehicle andQingpenggroups （allP＞ 0.05）.ConclusionThe vehicle ofQingpengointment can improve skin barrier function.

Dermatitis,atopic;Models,animal;Mice;Skin;Volunteer;Qingpengointment;Skin barrier

Li Linfeng,Email:zoonli@sina.com

2015-03-09）

（本文編輯：吳曉初）

李鄰峰，Email：zoonli@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.012

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