粟連秀，張兆明，陸惠軍，韋翠容

（廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院，廣西貴港537100）

DEK 蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系

粟連秀，張兆明，陸惠軍，韋翠容

（廣西醫(yī)科大學(xué)第八附屬醫(yī)院，廣西貴港537100）

目的探討DEK蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法應(yīng)用組織芯片和快捷免疫組織化學(xué)MaxVisionTM法檢測(cè)185例結(jié)直腸癌及癌旁正常黏膜組織中DEK蛋白表達(dá)情況。結(jié)果DEK蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)陽(yáng)性率為86.49%（160/185），明顯高于正常結(jié)腸黏膜組織［64.86%（120/185）］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。DEK蛋白表達(dá)與腫瘤臨床分期及浸潤(rùn)深度有關(guān)，臨床分期越晚、腫瘤浸潤(rùn)越深，DEK蛋白表達(dá)越高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論DEK蛋白在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。

結(jié)直腸腫瘤；免疫組織化學(xué)；DEK；組織芯片

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)疾病中常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。由于全球人口老齡化及物質(zhì)生活水平不斷改善，結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率在全球呈不斷上升趨勢(shì)，已列入常見(jiàn)十大惡性腫瘤之一。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展及對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制研究的不斷深入，逐漸認(rèn)識(shí)到結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素有關(guān)，腫瘤相關(guān)基因與腫瘤的關(guān)系逐漸被闡明。DEK蛋白是原癌蛋白的一種，很多種惡性腫瘤和一部分自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展均與DEK蛋白存在有關(guān)，另外，DEK蛋白的功能還有抑制細(xì)胞衰老、凋亡，影響細(xì)胞增殖和分化。本研究選擇組織芯片聯(lián)合免疫組織化學(xué)MaxVisionTM的方法對(duì)結(jié)直腸癌組織及癌旁正常黏膜組織進(jìn)行檢測(cè)，分析DEK蛋白表達(dá)水平，通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌中DEK蛋白表達(dá)情況，探討DEK蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展及各臨床病理特征的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1一般資料選取本院2010年1月至2012年10月收治的結(jié)直腸癌患者185例，均行手術(shù)切除。其中男99例，女86例；年齡28～89歲，平均（58.36±1.34）歲；結(jié)腸癌101例，直腸癌84例；按照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）公布的標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ期47例，Ⅱ期61例，Ⅲ期67例，Ⅳ期10例；腫瘤分化程度：高分化腺癌43例，中分化腺癌88例，低分化腺癌54例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移114例。185例患者均經(jīng)病理檢查確診，術(shù)前均未曾行放、化療。185例結(jié)直腸癌組織作為研究對(duì)象；同時(shí)選擇距腫瘤邊緣5 cm以上的癌旁正常黏膜組織作為對(duì)照。

1.2試劑英國(guó)Abcam公司生產(chǎn)的兔多克隆抗體DEK（ab85407）、福州邁新生物技術(shù)公司生產(chǎn)的抗體稀釋液、即用型快捷免疫組織化學(xué)MaxVisionTM試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色劑等。

1.3方法

1.3.1組織芯片制備組織芯片采用自制的方法。

1.3.1.1空白受體蠟塊制作空白受體蠟塊數(shù)張備用。

1.3.1.2制備組織芯片蠟塊（1）標(biāo)記目標(biāo)組織，組織芯片的供體蠟塊先行常規(guī)病理切片，并經(jīng)常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色，病理診斷閱片，然后根據(jù)組織切片結(jié)果，對(duì)相應(yīng)供體蠟塊進(jìn)行目標(biāo)組織標(biāo)記；（2）對(duì)組織芯片蠟芯的取樣，預(yù)熱蠟塊使其軟化，用穿刺針對(duì)目標(biāo)組織進(jìn)行抽取，將抽取的目標(biāo)組織分別按預(yù)先指定位置放進(jìn)空白受體蠟塊模中；（3）組織芯片蠟塊行二次包埋，在蠟?zāi)３尚涂蛏戏湃胍呀?jīng)取樣組織芯片蠟塊，把熔化的石蠟液倒入包埋盒，室溫冷卻至石蠟?zāi)蹋唬?）把蠟?zāi)３尚涂蚝退芰鲜灠窈兄車鷼埩舻氖炄コ?，并將成型組織芯片蠟塊取出。

1.3.1.3組織芯片切片采用全自動(dòng)組織切片機(jī)進(jìn)行常規(guī)病理切片，制備石蠟組織芯片切片，各切片厚度約4 μm。

1.3.2免疫組織化學(xué)染色選用快捷免疫組織化學(xué)MaxVisionTM法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的要求操作，具體染色步驟：（1）先將石蠟組織芯片切片行脫蠟和水化，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH 7.4）沖洗，每次3 min，共3次；（2）高溫、高壓抗原修復(fù)；（3）使用3%過(guò)氧化氫溶液（H2O2）在室溫下孵育10min，使內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性被阻斷；給予PBS沖洗，每次3min，共3次，去除PBS液；（4）將DEK一抗工作液（1∶800）分別滴入切片，置于4℃冰箱中過(guò)夜；（5）用PBS沖洗，每次5 min，共3次，去除PBS液；各張切片加入即用型快捷免疫組織化學(xué)MaxVisionTM試劑，繼續(xù)室溫孵育15 min；PBS沖洗，每次3 min，共3次；（6）去除PBS液，每張切片滴加新鮮配制的DAB溶液，在顯微鏡下連續(xù)觀察5min；（7）使用流動(dòng)自來(lái)水沖洗，HE復(fù)染，用自來(lái)水沖洗后返藍(lán)，梯度乙醇脫水使其干燥，再用中性樹(shù)膠封固；選用已知DEK陽(yáng)性的組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，而以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)DEK蛋白免疫染色陽(yáng)性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，細(xì)胞核著色；染色評(píng)分方法：根據(jù)切片中染色強(qiáng)度深淺程度和陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)比例情況，按照Mathew等［1］的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：切片中無(wú)表達(dá)為（-）；切片中著色細(xì)胞數(shù)小于50%或切片中染色較淺為（+）；切片中著色細(xì)胞數(shù)大于50%且染色較深為（++）。其中（+）和（++）均視為表達(dá)陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1DEK蛋白在癌旁正常黏膜組織與結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況DEK蛋白在癌旁正常黏膜組織和結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率分別為64.86%（120/185）、86.49%（160/185），且二者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)表1，圖1、2。

表1　DEK蛋白在癌旁正常黏膜組織及結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)情況

圖1　DEK蛋白在正常腸黏膜組織中陰性表達(dá)情況（快捷免疫組織化學(xué)MaxVisionTM法，200×）

圖2　DEK蛋白在結(jié)直腸癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)情況（快捷免疫組織化學(xué)MaxVisionTM法，200×）

2.2DEK蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

DEK蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)與患者性別、年齡、分化程度等無(wú)關(guān)（P＞0.05），與腫瘤組織浸潤(rùn)深度、臨床分期有關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2　DEK蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系（n=185）

續(xù)表2　DEK蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系（n）

3　討論

組織芯片技術(shù)是在一張固相載體上，集中數(shù)十個(gè)至數(shù)千個(gè)不同個(gè)體組織標(biāo)本，形成組織微陣列［2］。組織芯片技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)行大樣本檢測(cè)，從而節(jié)省時(shí)間、人力，還可節(jié)省試劑及組織標(biāo)本等，在當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。

DEK蛋白是一種可磷酸化的具有染色質(zhì)架構(gòu)蛋白，其由375個(gè)氨基酸組成，屬于原癌基因；DEK蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)。于多細(xì)胞生物體中及除酵母外的一些單核細(xì)胞有機(jī)體中，普遍存在DEK蛋白。DEK在DNA有2個(gè)結(jié)合域，二者結(jié)合特性不同，對(duì)CK2磷酸化反應(yīng)能力也不同［3］。DEK蛋白的生物學(xué)作用主要是通過(guò)干擾細(xì)胞分裂、影響DNA修復(fù)［4］，具有抑制細(xì)胞分化、衰老及凋亡等作用［5-7］。在多種惡性腫瘤中，DEK蛋白過(guò)度表達(dá)。喬煒等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在正常胃組織、慢性萎縮性胃炎組織及胃癌組織中，DEK蛋白表達(dá)陽(yáng)性率不同，分別為28.6%（14/49）、60.3%（38/63）、78.0%（103/132），三者兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同時(shí)腫瘤分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均會(huì)影響DEK蛋白在胃癌組織中的表達(dá)，表明在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中，DEK蛋白起著重要的促進(jìn)作用。Lee等［9］研究還發(fā)現(xiàn)，DEK蛋白對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡具有拮抗功能，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及和HAT相關(guān)的凋亡過(guò)程中均起作用，并且DEK蛋白還是高危型HPVE7基因調(diào)控下的主要下游靶基因，因此推測(cè)HPVE7基因表達(dá)因受DEK蛋白的影響，從而引起宮頸癌的發(fā)生。張坤等［10］研究結(jié)果顯示，DEK蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；同時(shí)運(yùn)用Log-rank及Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，通過(guò)結(jié)直腸癌患者生存時(shí)間與DEK蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析，以及DEK蛋白表達(dá)對(duì)患者生存因素的影響發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌患者中DEK蛋白高表達(dá)者總生存時(shí)間明顯低于DEK蛋

Relationship between DEK protein expression in colorectal cancer tissue and clinicopathology

Su Lianxiu，Zhang Zhaoming，Lu Huijun，Wei Cuirong（Eighth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Guigang，Guangxi 537100，China）

ObjectiveTo investigate the expression of DEK protein in colorectal cancer and its relationships with clinicopathological features.MethodsThe expression of DEK protein was detected in 185 cases of colorectal cancer tissues and paracancerous normal mucosa tissues by using the tissue microarray and immunohistochemical MaxVisionTM method.Results The positive expression rate of DEK protein in colorectal cancer was 86.49%（160/185），which was significantly higher than 64.86%（120/185）in the normal colonic mucosa tissues，the difference was statistically significant（P＜0.001）.The DEK protein expression was related to the tumor clinical stage and infiltration degree.The later the tumor clinical stage，the deeper the tumor infiltration，the higher the DEK protein expression，the difference was statistically significant（P＜0.05）.ConclusionDEK protein plays an important role in the occurrence and development of colorectal cancer.

Colorectal tomur；Immunohistochemistry；DEK；Tissue microarray

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.19.005

A

1009-5519（2016）19-2951-03

粟連秀（1970-），在職碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸腫瘤病理的研究。