胡湘麟，卿鑫，曾凡才△

（西南醫(yī)科大學(xué)：1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州646000）

人LDH-B 基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建*

胡湘麟1，卿鑫2，曾凡才2△

（西南醫(yī)科大學(xué)：1.臨床醫(yī)學(xué)院；2.生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，四川瀘州646000）

目的克隆人乳酸脫氫酶B（LDH-B）基因并構(gòu)建其真核表達(dá)載體。方法提取人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，以cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增獲得LDH-B基因編碼區(qū)序列片段，限制性核酸內(nèi)切酶Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切LDH-B基因片段及pUC19質(zhì)粒，連接反應(yīng)構(gòu)建pUC19-LDH-B克隆載體，并將其轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白篩選挑取白色菌落，酶切驗(yàn)證后測(cè)序鑒定。將序列正確的LDH-B基因亞克隆到pcDNA3.1（-）載體上，構(gòu)建LDH-B真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）-LDH-B。結(jié)果PCR擴(kuò)增后可見約1.0 kb的特異性條帶，與預(yù)期的LDH-B片段長(zhǎng)度相符合；Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切pUC19-LDH-B后可見約2.6 kb和1.0 kb的條帶，分別與pUC19和LDH-B的片段長(zhǎng)度相符合，LDH-B測(cè)序結(jié)果與DNA序列數(shù)據(jù)庫（Genebank）中的參考序列相一致；Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切pcDNA3.1（-）-LDH-B后可見約5.5 kb和1.0 kb的條帶，分別與pcDNA3.1（-）和LDH-B的片段長(zhǎng)度相符合。結(jié)論成功克隆了人LDH-B基因，并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步探究LDH-B的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

L-乳酸脫氫酶；基因；克隆，分子；遺傳載體；真核細(xì)胞

乳酸脫氫酶（LDH）是糖酵解最后一步反應(yīng)中負(fù)責(zé)催化丙酮酸與乳酸相互轉(zhuǎn)變的一組同工酶，是由LDH-A和LDH-B 2種亞基以不同的比例組裝而成，主要有LDH1（B4）、LDH2（A1B3）、LDH3（A2B2）、LDH4（A3B1）、LDH5（A4）5種形式。通常情況下，LDH1和LDH2存在于心肌并催化乳酸生成丙酮酸，而LDH4和LDH5存在于骨骼肌并催化丙酮酸生成乳酸，即四聚體中LDH-A的比例越高，則該同工酶催化丙酮酸發(fā)生乳酸反應(yīng)的能力也就越強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，LDH4和LDH5還普遍高表達(dá)于惡性腫瘤組織中，通過上調(diào)LDH-A/LDH-B比例，促進(jìn)腫瘤乳酸產(chǎn)生，造成組織乳酸堆積，密切影響著腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。抑制LDH-A以減少乳酸生成被認(rèn)為是抗腫瘤治療的理想靶點(diǎn)之一［1-2］。

LDH-B作為構(gòu)成LDH的另一種亞基形式，有著與LDH-A相反方向的催化功能。Bonuccelli等［3］在免疫組織化學(xué)染色中發(fā)現(xiàn)，LDH-B會(huì)選擇性地高表達(dá)于乳腺癌的腫瘤間質(zhì)，可能在支持癌細(xì)胞的生長(zhǎng)上同樣發(fā)揮著作用。目前，LDH-A在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用已備受關(guān)注和論述，而有關(guān)LDH-B與腫瘤關(guān)系的研究卻仍需進(jìn)一步闡明。因此，本實(shí)驗(yàn)研究旨在克隆人LDH-B基因，并通過構(gòu)建其真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步探究LDH-B的生物學(xué)功能做好準(zhǔn)備。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑T100型PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司，TGL-16R型低溫高速離心機(jī)購自珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司，ZHWY-2102C型恒溫?fù)u床購自上海智成分析儀器制造有限公司，電泳儀及水平電泳槽購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系、大腸埃希菌DH5α感受態(tài)菌株、pcDNA3.1（-）質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)室保存，質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Roche公司，Trizol total RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、pUC19質(zhì)粒、Taq DNA聚合酶、Bam HⅠ和KpnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自大連寶生物（TaKaRa）公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)DNA序列數(shù)據(jù)庫（Genebank）所提供的人LDH-B基因mRNA序列（NM_002300.6），使用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由上海Invitrogen公司合成。上游引物序列：5′-CGGGATCCAAAATGGCAACTCTTAAGG-3′，雙下劃線處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)，單下劃線處為起始密碼子，5′端加入2個(gè)保護(hù)堿基；下游引物序列：5′-GGGGTACCTCACAGGTCTTTTAGGTC-3′，雙下劃線處為KpnⅠ酶切位點(diǎn)，單下劃線處為終止密碼子，5′端加入2個(gè)保護(hù)堿基。PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段長(zhǎng)度為1 006 bp。

1.2.2細(xì)胞總RNA的提取與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2孵箱中待細(xì)胞生長(zhǎng)近80%呈融合狀態(tài)時(shí)收集細(xì)胞，使用Trizol total RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及吸光度（A）值?？俁NA量固定為1 μg，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增LDH-B基因片段，共20.0 μL反應(yīng)體系：15.4 μL ddH2O（雙蒸水），2.0 μL 10×Taq buffer，0.4 μL Taq DNA聚合酶，0.4 μL dNTP mixture of 10 mmol/L，0.4 μL正向引物（10.0μmol/L），0.4 μL反向引物（10.0 μmol/L）和1.0 μL cDNA；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3min后，95℃變性30s，61℃退火30 s，

72℃延伸1 min，重復(fù)34個(gè)循環(huán)，72℃最后延伸5 min。PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min），溴化乙錠（ethidium bromide，EB）染色成像。

1.2.3LDH-B克隆載體的構(gòu)建與鑒定紫外光下切取上述包含目的條帶的凝膠塊，使用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切膠回收產(chǎn)物及pUC19質(zhì)粒，根據(jù)1.0μL酶最大能切1.0μg DNA配置20.0μL酶切體系，37℃酶切1 h，酶切產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，測(cè)量純化后DNA的濃度及OD值。取酶切純化后的pUC19載體DNA1.0μL（約50ng），酶切純化后的目的基因片段20.0μL（約200ng），10×連接緩沖液5.0 μL，T4 DNA連接酶1.0 μL，加雙蒸水至連接體系50.0μL，16℃連接過夜。取10.0μL連接液迅速加入至100.0 μL的DH5α感受態(tài)細(xì)菌中，冰浴30 min，42℃熱激50 s，再次冰浴2 min，加入1 mL的LB液體培養(yǎng)基后，37℃、180r/min搖菌1h。取約200.0μL轉(zhuǎn)化菌液涂布于含異丙基硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷和氨芐西林的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上單個(gè)較大的白色菌落，接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖菌12 h，提取質(zhì)粒，Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒以篩選重組成功的質(zhì)粒。選取包含重組質(zhì)粒的菌液送往廣州光正物園研發(fā)中心進(jìn)行DNA測(cè)序，運(yùn)用美國國家生物技術(shù)信息中心中的BLAST工具進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.4LDH-B真核表達(dá)載體的構(gòu)建Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切含有正確LDH-B基因序列的重組質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色成像后，紫外光下切取包含LDH-B基因的凝膠塊，回收凝膠塊中的LDH-B基因片段。Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切pcDNA3.1（-）質(zhì)粒，純化酶切產(chǎn)物。參照1.2.3步驟中的連接體系及條件，配制pcDNA3.1（-）-LDH-B連接液，并將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)菌，體外培養(yǎng)后將轉(zhuǎn)化菌液涂布于含氨芐西林的LB固體平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取平板上的菌落作模板，菌落PCR篩選出包含pcDNA3.1（-）-LDH-B的陽性菌落，Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切其質(zhì)粒驗(yàn)證，挑選酶切驗(yàn)證陽性的菌落送往廣州光正物園研發(fā)中心測(cè)序后進(jìn)一步確認(rèn)。

2　結(jié)果

2.1RT-PCR擴(kuò)增LDH-B基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色成像后，在1.0 kb處可見一明顯的特異性條帶（圖1），與預(yù)期的LDH-B片段長(zhǎng)度1 006 bp相符合。膠回收PCR產(chǎn)物，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得濃度為10.12ng/μL，A260/A280=1.89。

2.2pUC19-LDH-B酶切驗(yàn)證及測(cè)序挑取藍(lán)白篩選平板上的白色菌落，LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳、EB染色成像后可見約2.6 kb和1.0 kb的條帶（圖2），分別與pUC19和LDH-B的片段長(zhǎng)度相符合，表明pUC19-LDH-B克隆載體構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，目的片段的編碼區(qū)堿基序列與Genebank中LDH-B的編碼區(qū)參考序列一致性為100.0%，表明LDH-B基因克隆成功。

圖1　PCR擴(kuò)增LDH-B產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

圖2　pUC19-LDH-B酶切產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

2.3pcDNA3.1（-）-LDH-B酶切驗(yàn)證菌落PCR篩選包含pcDNA3.1（-）-LDH-B重組質(zhì)粒的陽性菌落，挑取單克隆搖菌提取質(zhì)粒，Bam HⅠ和KpnⅠ雙酶切質(zhì)粒后可見約5.5kb和1.0kb的條帶（圖3），分別與pcDNA3.1（-）和LDH-B的片段長(zhǎng)度相符合，進(jìn)一步測(cè)序后證明pcDNA3.1（-）-LDH-B真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖3　pcDNA3.1（-）-LDH-B酶切產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果

3　討論

根據(jù)中國癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生率約占女性所有惡性腫瘤的15%，是45歲以下女性最常見的癌癥死因［4］。乳腺癌是一組高度異質(zhì)性的疾病，根據(jù)乳腺癌分子表達(dá)情況的不同，可將其分為多個(gè)亞型。其中三陰乳腺癌是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表達(dá)均為陰性的乳腺癌。三陰乳腺癌侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，對(duì)傳統(tǒng)的內(nèi)分泌治療及曲妥珠單抗靶向治療均無反應(yīng)，患者預(yù)后往往很差，因此，找出新的三陰乳腺癌的治療靶點(diǎn)極為重要［5］。

Mccleland等［6］通過構(gòu)建siRNA文庫對(duì)8種三陰乳腺癌細(xì)胞系和3種管腔型乳腺癌細(xì)胞系共計(jì)79個(gè)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)LDH-B基因是唯一一個(gè)三陰乳腺癌增殖所特定需要的基因。在體外或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用shRNA沉默LDH-B基因后，均會(huì)明顯抑制三陰乳腺癌細(xì)胞的增殖或其移植瘤的生長(zhǎng)。該研究小組認(rèn)為，三陰乳腺癌更加依賴于糖酵解產(chǎn)能，這與三陰乳腺癌中LDH-B和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)子1（monocarboxylate transporter，MCT1）的共表達(dá)有很大關(guān)系。LDH-B可能作為干預(yù)三陰乳腺癌生長(zhǎng)的分子靶標(biāo)。高表達(dá)LDH-B的乳腺癌患者常預(yù)示其總生存期和無疾病進(jìn)展生存期較短。同時(shí)，Dennison等［7］通過蛋白質(zhì)印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LDH-A在各種乳腺癌細(xì)胞系中均有表達(dá)，而LDH-B僅在三陰乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)。shRNA沉默三陰乳腺癌細(xì)胞系的LDH-B基因后，將增加腫瘤細(xì)胞的氧化磷酸化。其臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，LDH-B是預(yù)測(cè)三陰乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的唯一指標(biāo)，并且高度認(rèn)為L(zhǎng)DH-B可以用于預(yù)測(cè)新輔助化療對(duì)乳腺癌的治療效果。由此可見，LDH-B無論是在基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用中，都與三陰乳腺癌之間有著十分緊密而特殊的聯(lián)系。

明確LDH-B所涉及的分子機(jī)制是研究LDH-B的重要內(nèi)容。Zha等［8］的研究證明，在高度激活的哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）所介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過程中，LDH-B扮演著十分關(guān)鍵的角色。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR信號(hào)通路是機(jī)體調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、代謝及血管形成等的一個(gè)重要信號(hào)通路，在許多惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)有PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的持續(xù)性激活，包括乳腺癌［9］。Zha等［8］研究發(fā)現(xiàn)，mTOR是LDH-B的正調(diào)節(jié)分子，會(huì)促進(jìn)細(xì)胞LDH-B的表達(dá)，即高度激活的mTOR能夠上調(diào)其下游的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，繼而激活LDH-B基因的轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)LDH-B分子的表達(dá)，即構(gòu)成mTOR/STAT/LDH-B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，認(rèn)為L(zhǎng)DH-B可能會(huì)成為一個(gè)有效的靶點(diǎn)，用于治療由PI3K/Akt/mTOR異常激活所導(dǎo)致的腫瘤。

在最近一項(xiàng)對(duì)乳腺癌荷瘤小鼠的研究中，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過持久運(yùn)動(dòng)和鍛煉的荷瘤小鼠，其瘤體內(nèi)LDH-B的表達(dá)水平將會(huì)增高，而LDH-A的表達(dá)水平則降低。此外，LDH同工酶電泳顯示，經(jīng)過持久鍛煉的荷瘤小鼠，在瘤體中開始更多地表達(dá)LDH1和LDH2，而未經(jīng)鍛煉的荷瘤小鼠在瘤體中仍較高地表達(dá)LDH4和LDH5［10］。

本實(shí)驗(yàn)研究所選取的MDA-MB-231細(xì)胞系即為ER、PR和HER2均不表達(dá)的三陰乳腺癌細(xì)胞系，通過分、切、接、轉(zhuǎn)、篩等一系列的經(jīng)典操作，成功克隆了LDH-B基因的編碼區(qū)序列，并構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pcDNA3.1（-）-LDH-B。在下一步的實(shí)驗(yàn)方案中，本課題組計(jì)劃將pcDNA3.1（-）-LDH-B轉(zhuǎn)染入T47D、MCF-7等不表達(dá)LDH-B的乳腺癌細(xì)胞系，并用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LDH-B分子的過表達(dá)，以探究過表達(dá)LDH-B分子會(huì)對(duì)LDH同工酶酶譜產(chǎn)生如何的影響，過表達(dá)的LDH-B分子是否會(huì)對(duì)腫瘤的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響等。

總之，本研究為進(jìn)一步探究LDH-B的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。開展LDH-B與乳腺癌等腫瘤關(guān)系的研究具有十分重要的意義。

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Cloning of human lactate dehydrogenase B gene and construction of its eukaryotic expression vector*

Hu Xianglin1，Qing Xin2，Zeng Fancai2△
（1.Clinical Medical College；2.Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Southwest Medical University，Luzhou，Sichuan 646000，China）

ObjectiveTo clone human lactate dehydrogenase B（LDH-B）gene and to construct its eukaryotic expression vector.MethodsTotal RNA was extracted from human breast cancer cell line MDA-MB-231，cDNA was generated by reverse transcription，cDNA was used as the template and the sequence segment of LDH-B gene coding region was amplified by poly merase chain reaction（PCR），both LDH-B gene segment and pUC19 plasmid were digested with two restriction endonucleases of BamHⅠand KpnⅠ，pUC19-LDH-B cloning vector was constructed by ligation reaction and then transformed into E.coli DH5α competence cells，the single white bacterial colony was selected in the blue-white selection plates，positive recombinant plasmid was identified by double restriction endonucleases digestion and DNA sequencing.Eukaryotic expression vector of pcDNA3.1（-）-LDH-B was constructed by subcloning LDH-B gene segment with the right sequence into pcDNA3.1（-）vector.ResultsA specific DNA band about 1.0 kb was found by PCR amplification，which agreed with the expected fragment length of LDH-B；two DNA bands about 2.6 kb and 1.0 kb were seen after digestion of pUC19-LDH-B with BamHⅠand KpnⅠ，which agreed with the fragment length of pUC19 and LDH-B respectively，the LDH-B sequencing result was consistent with its reference sequence in Genebank；two DNA bands about 5.5 kb and 1.0 kb were seen after digestion of pcDNA3.1（-）-LDH-B with BamHⅠand KpnⅠ，which agreed with the fragment length of pcDNA3.1（-）and LDH-B respectively.ConclusionHuman LDH-B gene is successfully cloned in this experimental study and its eukaryotic expression vector is successfully constructed，which lays an essential foundation for further exploring LDH-B biological functions.

L-lactate dehydrogenase；Genes；Cloning，molecular；Genetic vectors；Eukaryotic cells

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.004

A

1009-5519（2016）20-3106-03

國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410632010）。

胡湘麟（1994-），2012級(jí)麻醉專業(yè)在讀本科生。

△，E-mail：zfcai@swmu.edu.cn。

（2016-06-08）