馬玥任嬡姝付鋼

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科；2.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147

丹酚酸B 對(duì)人牙周膜細(xì)胞成骨分化的影響

馬玥1,2任嬡姝1,2付鋼3

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科；2.口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147

目的 探討中藥丹參主要活性成分丹酚酸B（Sal B）對(duì)人牙周膜細(xì)胞（hPDLCs）成骨分化的影響。方法 取第3代hPDLCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測(cè)不同濃度丹酚酸B對(duì)hPDLCs增殖活性影響，通過(guò)檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）活性、礦化結(jié)節(jié)染色、骨鈣素（OCN）mRNA表達(dá)來(lái)探討丹酚酸B對(duì)hPDLCs成骨分化的影響。結(jié)果 丹酚酸B對(duì)hPDLCs增殖活性無(wú)影響。當(dāng)?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時(shí)均能增加hPDLCs的ALP活性和OCN mRNA表達(dá)，與OIM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且當(dāng)?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時(shí)hPDLCs形成礦化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯高于OIM組。結(jié)論 適宜濃度的丹酚酸B能有效促進(jìn)hPDLCs成骨分化。

丹酚酸B； 人牙周膜細(xì)胞； 成骨分化； 堿性磷酸酶活性； 礦化結(jié)節(jié)

牙周炎是成年人口腔中失牙最主要的原因，其標(biāo)志性的特征是發(fā)生牙槽骨的病理性吸收。牙周組織的修復(fù)與再生一直都是牙周炎治療的重要研究課題之一。人牙周膜細(xì)胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）是包括了大量成纖維細(xì)胞、少量干細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的特異細(xì)胞群[1]，其具有干性和成骨分化的潛能，是牙周組織再生的主要細(xì)胞來(lái)源。丹酚酸B（salvianolic acid B，Sal B）是我國(guó)中藥丹參的水溶性提取物之一，也是水溶性提取物中活性最強(qiáng)的成分之一，占水溶性藥用成分總含量的70%。研究[2-3]表明丹酚酸B主要具有促增殖、抗氧化和細(xì)胞保護(hù)等作用，廣泛用于心血管疾病[4-5]，且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用[6-7]，還能防止肝纖維化。近年來(lái)研究[8]發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B能防治糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨質(zhì)疏松，進(jìn)一步研究[9]表明其能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。而丹酚酸B對(duì)hPDLCs的成骨影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究丹酚酸B對(duì)hPDLCs成骨的影響為牙周組織再生中的牙槽骨重建提供新的思考。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

丹酚酸B（重慶博培生物公司），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)），青霉素/鏈霉素（Hyclone公司，美國(guó)），茜素紅S、抗壞血酸、β-磷酸甘油磷酸鈉、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色試劑盒、地塞米松（Sigma公司，美國(guó)），ALP定量檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（吳江近岸蛋白質(zhì)科技有限公司），real-time聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒、引物合成（Takara公司，日本），波形蛋白抗體、角蛋白抗體、通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。倒置顯微鏡（尼康公司，日本），熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），酶標(biāo)儀（PerkinElmer公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 hPDLCs的取材和培養(yǎng) 取10～12歲因正畸需要而拔除的健康前磨牙進(jìn)行hPDLCs培養(yǎng)。所有患者知情同意，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵守重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)的要求。拔牙后將離體牙立即置于含青霉素、鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液中。無(wú)菌條件下反復(fù)沖洗后，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，用剪刀剪碎后平鋪于25 mL培養(yǎng)瓶底，加入含血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液（含100 μg·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素、10%FBS），翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶放入CO2孵箱（37 ℃、5%CO2、100%濕度）。12 h后待組織塊貼壁，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)后繼續(xù)培養(yǎng)。此后每間隔3 d換液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底約80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 hPDLCs的鑒定 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。選取第3代細(xì)胞按二步法進(jìn)行波形蛋白和角蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)染色，鑒定細(xì)胞來(lái)源。

1.2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將第3代hPDLCs以密度為每孔4×103個(gè)接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后，分別加入含0、0.1、0.5、1、5 μmol·L-1丹酚酸B的含藥培養(yǎng)基[8-9]，在藥物作用1、3、5、7 d后，采用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法，每孔加入20 μL MTT溶液（0.5 mg·mL-1）孵育4 h后，吸去孔內(nèi)液體，加入150 μL DMSO振蕩10 min后，490 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔光密度（optical density，OD）值。

1.2.4 丹酚酸B影響hPDLCs成骨分化 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Con組）：DMEM/F12+胎牛血清；標(biāo)準(zhǔn)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基組（OIM組）：DMEM/F12+5%FBS、10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉、50 mg·L-1抗壞血酸、1×10-8mol·L-1地塞米松；丹酚酸B+標(biāo)準(zhǔn)成骨培養(yǎng)基組（Sal B+OIM組）：標(biāo)準(zhǔn)成骨培養(yǎng)基分別加入濃度為0.1、0.5、1、5 μmol·L-1的丹酚酸B。

1.2.5 ALP活性測(cè)定 將第3代hPDLCs以密度為每孔5×104個(gè)接種于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合后，按預(yù)先設(shè)置的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，即為Con組、OIM組、Sal B+OIM（0.1、0.5、1、5 μmol·L-1）組，培養(yǎng)7 d后去上清液，PBS沖洗2遍，加入0.2% TritonX-100 100 μL裂解2 h后，吹打1 min，取50 μL裂解液至96孔板中，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行OD值測(cè)定，并用BCA法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的總蛋白量，校正ALP的活性結(jié)果。

1.2.6 ALP染色 將第3代hPDLCs以密度為每孔5×104個(gè)接種于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合后，按預(yù)先設(shè)置的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后去上清液，PBS沖洗2遍，95%乙醇固定30 min后PBS沖洗2遍，加入按試劑盒要求配置的染液染色10 min，蒸餾水沖洗2遍后鏡下觀察成像。

1.2.7 礦化結(jié)節(jié)染色 將第3代hPDLCs以密度為每孔4×104個(gè)接種于24孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至60%匯合后，按預(yù)先設(shè)置的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)20 d后去上清液，PBS沖洗2遍，95%乙醇固定30 min后PBS沖洗2遍，加入0.2%茜素紅染液（pH 8.4），37 ℃染色30 min，蒸餾水沖洗2遍后鏡下觀察成像。

1.2.8 real-time PCR檢測(cè)骨鈣素（osteocalcin，OCN）表達(dá) 取第3代hPDLCs，以密度為每孔3×105個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%匯合后，按預(yù)先設(shè)置的分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，將提取的總RNA用分光光度計(jì)定量，A260/A280比值在1.9～2.1之間表明RNA純度較好，同時(shí)采用凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性，測(cè)定RNA濃度后取1 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，real-time PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志基因OCN mRNA的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。數(shù)據(jù)分析采用ΔΔCT法，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。實(shí)驗(yàn)引物序列如下。OCN上游引物序列：5’-CGCTACCTGTATCAATGGCTGG-3’，下游引物序列：5’-ATGTGGTCAGCCAACTCGTCA-3’。β-actin上游引物序列：5’-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3’，下游引物序列：5’-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3’。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件包的單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定

倒置顯微鏡下觀察到8～10 d內(nèi)細(xì)胞從組織塊中游出，可見(jiàn)組織塊周?chē)霈F(xiàn)梭形細(xì)胞，胞核清晰。繼續(xù)培養(yǎng)，組織塊周?chē)?xì)胞增多，圍繞組織塊成放射狀、旋渦狀（圖1）。細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可見(jiàn)，波形絲蛋白染色陽(yáng)性，表現(xiàn)為胞質(zhì)棕黃色著色；角蛋白染色陰性，未見(jiàn)著色（圖2），說(shuō)明細(xì)胞來(lái)源于中胚層。

圖 1 組織塊周?chē)霈F(xiàn)細(xì)胞 倒置顯微鏡 × 40Fig 1 Cells grew around the tissue inverted microscope × 40

2.2 丹酚酸B對(duì)hPDLCs增殖活性的影響

通過(guò)MTT法檢測(cè)丹酚酸B對(duì)hPDLCs增殖活性有無(wú)影響，結(jié)果顯示在丹酚酸B濃度為0.1、0.5、1、5 μmol·L-1時(shí)其對(duì)hPDLCs增殖活性無(wú)影響（圖3）。

2.3 丹酚酸B提高h(yuǎn)PDLCs的ALP活性

ALP是hPDLCs成骨分化的標(biāo)志，ALP讀數(shù)和染色能反映其活性。Con組，OIM組，0.1、0.5、1、5 μmol·L-1Sal B+OIM組ALP檢測(cè)結(jié)果分別為（0.933± 0.029）、（1.110±0.037）、（1.140±0.023）、（1.362± 0.022）、（1.307±0.084）、（1.451±0.057）金氏單位·gprot-1。結(jié)果表明在礦化誘導(dǎo)條件下，丹酚酸B能增加hPDLCs的ALP活性，OIM組ALP表達(dá)較Con組高（P＜0.05），且當(dāng)?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時(shí)其ALP活性讀數(shù)與OIM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ALP活性隨丹酚酸B濃度升高而增加，5 μmol·L-1與0.5 μmol·L-1組、1 μmol·L-1組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。ALP染色顯示Sal B+OIM組與Con組和OIM組比較胞質(zhì)藍(lán)染較深且較多，與ALP活性讀數(shù)有相似規(guī)律（圖4）。

圖 2 波形絲蛋白染色陽(yáng)性（左），角蛋白染色陰性（右） 免疫組織化學(xué)染色 × 200Fig 2 Positive expression of vimentin(left), negative expression of keratin(right) immunohistochemistry × 200

圖 3 不同濃度丹酚酸B對(duì)hPDLCs活性的影響Fig 3 Effects of Sal B on hPDLCs activity

2.4 丹酚酸B促進(jìn)hPDLCs礦化

細(xì)胞培養(yǎng)20 d后茜素紅染色結(jié)果顯示Con組未見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)形成，OIM組可見(jiàn)散在礦化結(jié)節(jié)。而當(dāng)?shù)し铀酈濃度為0.5、1、5 μmol·L-1時(shí)的Sal B+OIM組可見(jiàn)大量礦化結(jié)節(jié)，且礦化結(jié)節(jié)數(shù)量較OIM組明顯提高（圖5），上述結(jié)果提示一定濃度的丹酚酸B可以促進(jìn)hPDLCs成骨分化形成礦化結(jié)節(jié)。

2.5 丹酚酸B提高h(yuǎn)PDLCs的OCN mRNA表達(dá)

hPDLCs在不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)第10天的OCN mRNA表達(dá)（圖6）。OIM組OCN mRNA表達(dá)較Con組高（P＜0.05），丹酚酸B各濃度組在礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)液中均能促進(jìn)OCN mRNA的表達(dá)，與Con組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），0.5、1、5 μmol·L-1Sal B+OIM組與OIM組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。當(dāng)?shù)し铀酈濃度為5 μmol·L-1時(shí)OCN mRNA表達(dá)最高，但5 μmol·L-1組與0.5 μmol·L-1組、1 μmol·L-1組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖 4 hPDLCs在不同條件下誘導(dǎo)7 d時(shí)ALP染色結(jié)果 ALP染色 × 200Fig 4 ALP staining results of hPDLCs under different conditions for 7 d ALP staining × 200

圖 5 hPDLCs在不同條件下誘導(dǎo)20 d時(shí)茜素紅染色結(jié)果 茜素紅染色 × 100Fig 5 Alizarin red staining results of hPDLCs under different conditions for 20 d alizarin red staining × 100

圖 6 不同濃度丹酚酸B對(duì)OCN mRNA表達(dá)的影響Fig 6 Effects of different concentrations Sal B on OCN mRNA ex- pression

3 討論

丹參是一味古老的具有活血化瘀作用的中草藥，具有抗氧化、改善微循環(huán)防止血栓形成等多種功能。近年發(fā)現(xiàn)丹參可促進(jìn)骨愈合，在預(yù)防股骨頭壞死及骨質(zhì)疏松治療中有很好的療效。在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)丹參可減輕牙周組織在矯治中的損傷，包括缺氧性損傷與炎癥性損傷，另一方面，丹參可以提高牙周組織的修復(fù)能力，包括清除變性壞死組織的能力和形成新生牙周組織的功能，丹參還能促進(jìn)牙周膜成纖維細(xì)胞增殖及成骨分化增加其骨保護(hù)素分泌[10]。有研究[11]指出丹參提取物能有效地治療由糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨質(zhì)疏松。

丹酚酸B是丹參中的一種有效的提取物，分子式為C36H30O16，相對(duì)分子質(zhì)量為718，呈淡黃色絮狀結(jié)晶，為三分子丹參素與一分子咖啡酸縮合而成，為丹參中含量最高活性最強(qiáng)的水溶性單體成分，具有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過(guò)氧化和清除自由基作用。研究表明丹酚酸B能促進(jìn)多種組織細(xì)胞增殖，具有抗氧化[3]和細(xì)胞保護(hù)等作用，其可通過(guò)介導(dǎo)多種途徑對(duì)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)，減少其凋亡[2]。有研究表明丹酚酸B能通過(guò)ET途徑對(duì)鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)[4]，且能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和促進(jìn)內(nèi)皮依賴性血管舒張改善血管功能[5]，這使其能被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療，而且使其成為治療內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的心血管疾病的一個(gè)有力的候選物質(zhì)。研究[6-7]表明丹酚酸B具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用且發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)活性經(jīng)由抗炎和抗氧化作用，并且丹酚酸B可以是阿爾茨海默氏病治療的潛在候選物資，不僅如此它還能防止肝纖維化。有學(xué)者[8]研究發(fā)現(xiàn)丹酚酸B通過(guò)刺激成骨、骨髓血管生成和抑制脂肪形成起到防止糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松的作用，另有學(xué)者[9]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)其刺激成骨能力進(jìn)行研究表明，它能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。而牙周炎的主要病理改變是牙槽骨吸收和牙周袋形成，恢復(fù)附著喪失形成牙周新附著一直是治療牙周病的最終目標(biāo)。hPDLCs是構(gòu)成牙周膜的細(xì)胞群，實(shí)驗(yàn)表明其具有干細(xì)胞特性，有成骨分化能力，丹酚酸B刺激間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨能力如能作用于hPDLCs將對(duì)牙周炎中根周病理性吸收的牙槽骨的再生治療提供新的思考和方向，本實(shí)驗(yàn)對(duì)丹酚酸B對(duì)hPDLCs成骨分化能力的影響研究結(jié)果顯示，丹酚酸B還具有促進(jìn)hPDLCs成骨分化的作用。

為了評(píng)價(jià)丹酚酸B對(duì)hPDLCs成骨分化的影響，筆者首先檢測(cè)了hPDLCs的ALP活性，ALP作為早期成骨分化的標(biāo)志物，其活性能反映成骨細(xì)胞成熟狀態(tài)[12-15]。其可使局部鈣、磷濃度升高，有助于礦化機(jī)制的進(jìn)行，是促進(jìn)骨間質(zhì)礦化的重要酶。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)?shù)し铀酈濃度在0.5、1、5 μmol·L-1時(shí)能有效提高h(yuǎn)PDLCs的ALP活性，從而增強(qiáng)其成骨活性，且在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)其ALP活性隨丹酚酸B濃度升高而提高。

OCN是成骨細(xì)胞合成分泌的一種非膠原蛋白，是反映成骨細(xì)胞分化成熟的指標(biāo)，能表示成骨細(xì)胞的活性，它能準(zhǔn)確反映成骨細(xì)胞的成骨功能[16-17]。其主要生理作用是反映骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)，當(dāng)骨形成和骨吸收解偶聯(lián)時(shí)，OCN是反映骨形成的特異指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，hPDLCs在加入了0.5、1、5 μmol·L-1丹酚酸B的礦化培養(yǎng)液中培養(yǎng)能被顯著增強(qiáng)OCN mRNA的表達(dá)，且在濃度為5 μmol·L-1時(shí)表達(dá)最強(qiáng)，但在此實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)無(wú)明顯濃度依賴性。丹酚酸B能有效促進(jìn)hPDLCs成骨分化，從而在牙周組織再生中起到重要作用，而OCN作為骨形成的重要指標(biāo)其mRNA表達(dá)增加有利于發(fā)揮它在生物礦化中的特有作用。

筆者對(duì)丹酚酸B對(duì)hPDLCs礦化能力的影響進(jìn)行了檢測(cè)。鈣鹽沉積是中晚期的成骨指標(biāo)[18]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在丹酚酸B濃度為0.5、1、5 μmol·L-1這幾個(gè)有效濃度下hPDLCs較未加丹酚酸B的普通礦化培養(yǎng)基下的hPDLCs更早出現(xiàn)細(xì)胞聚集，并出現(xiàn)了更多和更大的礦化結(jié)節(jié)。這表明丹酚酸B能顯著提高h(yuǎn)PDLCs的礦化能力，促進(jìn)其形成礦化結(jié)節(jié)。

綜上所述，適宜濃度的丹酚酸B能夠有效促進(jìn)hPDLCs成骨分化，且有可能是通過(guò)提高h(yuǎn)PDLCs的ALP活性和促進(jìn)其OCN mRNA表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究丹酚酸B對(duì)牙周炎的治療作用奠定了重要基礎(chǔ)，有助于牙周炎組織再生的實(shí)現(xiàn)，但其具體機(jī)制及應(yīng)用于體內(nèi)模型中的作用與方法尚待深入研究。筆者將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中研究其體外促進(jìn)成骨機(jī)制且采用動(dòng)物模型模擬牙周炎時(shí)骨缺損狀態(tài)用以進(jìn)一步探討丹酚酸B的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

[1] Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J]. Lancet, 2004, 364(9429):149-155.

[2] 王鳳美, 陳軍輝, 李磊, 等. 高純度丹酚酸B的制備工藝研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2005, 16(6):3-5.

Wang FM, Chen JH, Li L, et al. Study on the preparation of salvianolic acid B of high purity[J]. LiShiZhen Med Mater Med Res, 2005, 16(6):3-5.

[3] Lu B, Ye Z, Deng Y, et al. MEK/ERK pathway mediates cytoprotection of salvianolic acid B against oxidative stressinduced apoptosis in rat bone marrow stem cells[J]. Cell Biol Int, 2010, 34(11):1063-1068.

[4] He H, Shi M, Zeng X, et al. Cardioprotective effect of salvianolic acid B on large myocardial infarction mediated by reversing upregulation of leptin, endothelin pathways, and abnormal expression of SERCA2a, phospholamban in rats [J]. J Ethnopharmacol, 2008, 118(1):35-45.

[5] Joe Y, Zheng M, Kim HJ, et al. Salvianolic acid B exerts vasoprotective effects through the modulation of heme oxygenase-1 and arginase activities[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2012, 341(3):850-858.

[6] Kim DH, Park SJ, Kim JM, et al. Cognitive dysfunctions induced by a cholinergic blockade and Aβ 25-35 peptide are attenuated by salvianolic acid B[J]. Neuropharmacology, 2011, 61(8):1432-1440.

[7] Lee YW, Kim DH, Jeon SJ, et al. Neuroprotective effects of salvianolic acid B on an Aβ25-35 peptide-induced mouse model of Alzheimer’s disease[J]. Eur J Pharmacol, 2013, 704(1/2/3):70-77.

[8] Cui L, Li T, Liu Y, et al. Salvianolic acid B prevents bone loss in prednisone-treated rats through stimulation of osteogenesis and bone marrow angiogenesis[J]. PLoS ONE, 2012, 7(4):e34647.

[9] Xu D, Xu L, Zhou C, et al. Salvianolic acid B promotes osteogenesis of human mesenchymal stem cells through activating ERK signaling pathway[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2014, 51:1-9.

[10] 杜紅江， 陳學(xué)鵬， 嚴(yán)洪海. 丹參對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞骨保護(hù)素表達(dá)的影響[J]. 上?？谇会t(yī)學(xué), 2010, 19(5):530-533.

Du HJ, Chen XP, Yan HH. Effect of salvia miltiorrhiza bunge on expression of osteoprotegerin in cultured human periodontal ligament fibroblasts[J]. Shanghai J Stomatol, 2010, 19(5):530-533.

[11] 于瓊, 崔燎, 吳鐵. 三種丹參水提有效部位群對(duì)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠的影響[J]. 中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志, 2012, 18(8):695-699.

Yu Q, Cui L, Wu T. The effect of three effective fractions of water extract of Danshen on glucocorticoid-induced osteoporosis in rats[J]. Chin J Osteoporos, 2012, 18(8):695-699.

[12] Orimo H. The mechanism of mineralization and the role of alkaline phosphatase in health and disease[J]. J Nippon Med Sch, 2010, 77(1):4-12.

[13] Orimo H, Shimada T. The role of tissue-nonspecific alkaline phosphatase in the phosphate-induced activation of alkaline phosphatase and mineralization in SaOS-2 human osteoblastlike cells[J]. Mol Cell Biochem, 2008, 315(1/2):338-345.

[14] Lv XC, Bi LJ, Jiang Y, et al. Effects of icariin on the alkline phosphatase activity of human periodontal ligament cells inhibited by lipopolysaccharide[J]. 2013, 8(5):1411-1415.

[15] Ikeda H, Sumita Y, Ikeda M, et al. Engineering bone formation from human dental pulp- and periodontal ligamentderived cells[J]. Ann Biomed Eng, 2011, 39(1):26-34.

[16] Guo S, Guo W, Ding Y, et al. Comparative study of human dental follicle cell sheets and periodontal ligament cell sheets for periodontal tissue regeneration[J]. Cell Transplant, 2013, 22(6):1061-1073.

[17] Gordon JA, Tye CE, Sampaio AV, et al. Bonesialoprotein expression enhances osteoblast differentiation and matrix mineralization in vitro[J]. Bone, 2007, 41(3):462-473.

[18] Wada N, Maeda H, Hasegawa D, et al. Semaphorin 3A induces mesenchymal-stem-like properties in human periodontal ligament cells[J]. Stem Cells Dev, 2014, 23(18):2225-2236.

（本文編輯 杜冰）

Effects of salvianolic acid B on osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells

Ma Yue1,2, Ren Aishu1,2, Fu Gang3.
(1. Dept. of Orthodontics, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401147, China; 2. Chongqing Key Laboratory of Oral Diseases and Biomedical Sciences, Chongqing 401147, China; 3. Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Chongqing 401147, China)

Supported by: Scientific and Technological Research Program of Chongqing Yuzhong (20140128); Project Supported by Health Bureau of Chongqing (2011-2-180); Program for Innovation Team Building at Institutions of Higher Education in Chongqing in 2013 (KJTD201314). Correspondence: Ren Aishu, E-mail: rasras@163.com.

Objective This study investigated the effects of salvianolic acid B (Sal B), a major bioactive component of the Chinese medicine salvia miltiorrhiza, on osteogenic differentiation of human periodontal ligament cells (hPDLCs). Methods Third passage PDLCs were used in this experiment. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) method was employed to observe the effects of different Sal B concentrations on proliferation activity of hPDLCs. Alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralization capability were measured, and mRNA expression of osteocalcin (OCN) was detected to investigate the effects of Sal B on osteogenesis of hPDLCs. Results Sal B did not influence the viability of hPDLCs. The ALP activity and OCN mRNA expression levels of hPDLCs were both significantly improved (P<0.05) under treatment with different Sal B concentrations （0.5， 1， and 5 μmol·L-1) compared with those in OIM group. Moreover, the number of mineralized nodules formed by hPDLCs were considerably higher under treatment with different Sal B concentrations （0.5， 1， and 5 μmol·L-1) than that in the OIM group. Conclusion Appropriate Sal B concentration can improve the osteogenic differentiation of hPDLCs.

salvianolic acid B; human periodontal ligament cells; osteogenic differentiation; alkaline phosphatase activity; mineralized nodules

R 781.4

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.007

2016-01-06；

2016-07-12

重慶市渝中區(qū)科委基金（20140128）；重慶市衛(wèi)生局基金資助項(xiàng)目（2011-2-180）；2013年重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（KJTD201314）

馬玥，碩士，E-mail：yaotong6@hotmail.com

任嬡姝，副教授，博士，E-mail：rasras@163.com