王彥紅，蘭天野，陳　婷，劉　平，林麗麗

?

·實(shí)驗(yàn)研究·

銀杏內(nèi)酯B對高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

王彥紅，蘭天野，陳婷，劉平，林麗麗

?METHODS: The high glucose-induced HLEC model was established. Different concentrations of ginkgolide B were intervened. Cell viability was assayed by MTT assay, morphology of cell apoptosis was observed by hochest33258 staining. Cell ultrastructural changes were detected by transmission electron microscopy. Expressions of apoptosis-related factors caspses-3 and caspase-9 were tested by colorimetric detection.

?RESULTS: High glucose inhibited the activity of HLECs, induced apoptosis reaction of HLECs, caused high expression of apoptosis factors in cells; while ginkgolide B inhibited the decrease of cell viability induced by high glucose, decreased the HLEC apoptosis and reduced the expression of apoptosis factors Caspase-3 and Caspase-9.

?CONCLUSION: Ginkgolide B may inhibit the expression of caspses-3 and caspase-9 then effectively inhibited high glucose-induced apoptosis in HLECs.

目的：探討銀杏內(nèi)酯B對高糖誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells，HLECs)凋亡的影響。

方法：建立高糖誘導(dǎo)的HLECs模型，用不同濃度的銀杏內(nèi)酯B干預(yù)，MTT比色法檢測細(xì)胞存活率，Hochest33258染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)變化，比色法檢測凋亡相關(guān)因子Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)。

結(jié)果：高濃度葡萄糖可抑制HLECs活性，誘導(dǎo)HLECs發(fā)生凋亡，引起細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9表達(dá)水平升高；銀杏內(nèi)酯B能明顯抑制高糖誘導(dǎo)的HLECs活力的下降，降低細(xì)胞凋亡率，減少高糖所致HLECs細(xì)胞內(nèi)Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)。

結(jié)論：銀杏內(nèi)酯B可能通過抑制Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)而有效抑制了高糖誘導(dǎo)的HLECs凋亡。

銀杏內(nèi)酯B；高糖；晶狀體上皮細(xì)胞；凋亡

引用：王彥紅，蘭天野，陳婷，等.銀杏內(nèi)酯B對高糖誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響.國際眼科雜志2016;16(7):1242-1244

0引言

糖尿病是一種因體內(nèi)胰島素分泌不足或相對缺乏而導(dǎo)致的一系列臨床綜合征。糖尿病慢性并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類健康，其中糖尿病性白內(nèi)障已成為糖尿病并發(fā)癥中僅次于視網(wǎng)膜病變的第二大眼病[1]。銀杏內(nèi)酯B(ginkgolide B，GB)為銀杏葉中的主要成分，是血小板活化因子和鈣通道拮抗劑，具有減輕栓塞及缺血所致的各類異常炎性反應(yīng)的作用，已應(yīng)用于治療心血管系統(tǒng)疾病[2-3]。有研究證實(shí)，銀杏內(nèi)酯B可對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠血管系統(tǒng)發(fā)揮保護(hù)作用[4]，在眼部，銀杏內(nèi)酯B通過抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡促進(jìn)其軸突生長，從而發(fā)揮視神經(jīng)保護(hù)作用[5]，但是對傳代培養(yǎng)的HLECs影響的研究很少。本研究通過體外培養(yǎng)HLECs，觀察銀杏內(nèi)酯B干預(yù)后高葡萄糖濃度下HLECs形態(tài)及生長情況的變化，探討銀杏內(nèi)酯B對HLECs凋亡的抑制作用，為糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制及防治提供新的途徑。

1材料和方法

1.1材料HLECs(ATCC公司)，銀杏內(nèi)酯B(北京索來寶科技有限公司，純度>99%)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)，MTT試劑盒(上海伯奧生物制品公司)，Hoechst33258試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)，Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2方法

1.2.1 HLECs培養(yǎng)HLECs培養(yǎng)在含鏈霉素100μg/mL、青霉素100U/mL的DMEM培養(yǎng)基中，胎牛血清濃度為10%，培養(yǎng)箱內(nèi)CO2體積分?jǐn)?shù)為5%，溫度為37℃，細(xì)胞接種密度為5×105/mL，維持細(xì)胞生長密度為80%～90%，每3～5d傳代1次。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)共分4組：(1)陰性對照組：以正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。(2)氧化損傷組：30mmol/L葡萄糖溶液作用12h。(3)銀杏內(nèi)酯B組：加入銀杏內(nèi)酯B作用24h之后，加入30mmol/L葡萄糖溶液作用12h，依銀杏內(nèi)酯B濃度不同分為兩個(gè)亞組(1mol/L和10mol/L)。

1.2.3 MTT比色法檢測各組HLECs細(xì)胞活力細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為1×105/mL，培養(yǎng)24h后，向各孔細(xì)胞中加入20μL MTT(5g/L)，溫育4h，去除培養(yǎng)液后加入200μL DMSO溶液，室溫下振蕩10min后，用酶標(biāo)儀測定各孔570nm的光密度值，細(xì)胞活力=(各組細(xì)胞光密度值/正常組細(xì)胞光密度值)×100%。

1.2.4透射電子顯微鏡觀察各組HLECs超微結(jié)構(gòu)的變化4℃下用2.5%戊二醛溶液固定各組細(xì)胞24h，1%鋨酸后固定，PBS洗滌細(xì)胞2次，醋酸鈾快染，乙醇-丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片機(jī)切片后用檸檬酸、醋酸鈾雙重染色，觀察細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)改變。

1.2.5 Hochest33258染色觀察HLECs凋亡細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)處理后用PBS洗滌細(xì)胞2次，在150μL的Binding Buffer中加入2μL Hoechst染液，避光、室溫反應(yīng)5min后置于熒光顯微鏡下觀察，正常細(xì)胞核表現(xiàn)為暗藍(lán)色，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核為亮藍(lán)色。

1.2.6比色法檢測各組HLECs中Caspase-3和Caspase-9的活性收集細(xì)胞并用1g/L胰酶消化，1200r/min離心10min，收集細(xì)胞并用PBS沖洗2次，每份樣品加30μL細(xì)胞裂解液，冰上孵育20min，10 000r/min離心10min，進(jìn)行Caspase-3和Caspase-9活性檢測，檢測方法按Caspase-3、Caspase-9活性檢測試劑盒進(jìn)行。Caspase活性=OD405nm/OD595nm。

2結(jié)果

2.1銀杏內(nèi)酯B對各組HLECs活性的影響陰性對照組細(xì)胞活性為98.67%±3.44%，葡萄糖干預(yù)后細(xì)胞活性下降到32.67%±3.63%，與陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.56，P<0.01)。用不同濃度銀杏內(nèi)酯B處理后，HLECs活性分別提高到48.67%±3.32%和59.00%±3.57%，與氧化損傷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.10、1.72，P<0.05，圖1)。

2.2各組HLECs超微結(jié)構(gòu)的變化陰性對照組HLECs形態(tài)完整，核膜連續(xù)，核仁呈橢圓形(圖2A)；30mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)的HLECs胞膜不清晰，細(xì)胞明顯膨脹，胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)空泡及變性，細(xì)胞核亦膨脹明顯(圖2B)；不同濃度的銀杏內(nèi)酯B處理后，HLECs超微結(jié)構(gòu)損害程度依次減輕，逐漸可看到細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，尤其是高劑量組作用明顯(圖2C～D)。

圖1MTT法檢測銀杏內(nèi)酯B對高糖誘導(dǎo)的HLECs活力的影響aP<0.05，bP<0.01vs氧化損傷組。

2.3銀杏內(nèi)酯B對高糖誘導(dǎo)HLECs凋亡的影響Hoechst33258核染色法顯示，陰性對照組未見明顯凋亡染色的細(xì)胞核；氧化損傷組凋亡細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞核熒光較強(qiáng)，呈致密濃染；給予不同濃度的銀杏內(nèi)酯B作用后凋亡細(xì)胞減少，與氧化損傷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.25、8.71，P<0.05)，且細(xì)胞核形態(tài)改善，熒光強(qiáng)度逐漸減弱(圖3、4)。

2.4銀杏內(nèi)酯B對高糖誘導(dǎo)HLECs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響由表1可知，HLECs經(jīng)葡萄糖處理后，Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)明顯增加，與陰性對照組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.17、1.66，P<0.01)。給予不同濃度銀杏內(nèi)酯B處理后，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)量下降，與氧化損傷組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.54、1.73，P<0.05)。

3討論

抗氧化劑銀杏內(nèi)酯B是一種天然抗氧化劑，在保護(hù)心肌、抗休克、改善腦缺血-再灌注、急性胰腺炎的救治方面發(fā)揮重要作用。國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實(shí)銀杏內(nèi)酯B能減輕細(xì)胞凋亡與損傷，清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化，從而發(fā)揮對組織的保護(hù)作用[6-7]。李爽樂等[8]曾經(jīng)報(bào)道過銀杏葉提取物通過增加Bcl-2蛋白表達(dá)，減少Bcl-2/Bax表達(dá)，阻止氧化損傷所致的SD大鼠晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。但是關(guān)于銀杏內(nèi)酯B對HLECs氧化損傷的保護(hù)作用鮮有報(bào)道。高糖是糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體混濁的主要誘發(fā)因素。研究證實(shí)，高糖環(huán)境促使機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)被嚴(yán)重削弱，晶狀體受到氧化劑的攻擊，致使晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生氧化損傷，最終發(fā)生晶狀體混濁[9]。本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞活力檢測結(jié)果顯示高糖處理的HLECs活力明顯降低，凋亡染色證實(shí)高糖明顯增加了HLECs凋亡數(shù)量；電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)顯示，經(jīng)高糖處理的細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)損傷明顯，但是經(jīng)過銀杏內(nèi)酯B預(yù)處理的細(xì)胞，其活力得到不同程度的改善，凋亡細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)逐漸改善，說明該藥物在一定程度上能夠抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而且對細(xì)胞的保護(hù)作用呈劑量依賴性。

Caspase-3和Caspase-9是細(xì)胞凋亡通路的重要啟動者和參與者[10]。我們的研究結(jié)果顯示，30mmol/L葡萄糖作用HLECs后，兩種凋亡因子的表達(dá)量均明顯上升，而予以銀杏內(nèi)酯B處理后，Caspase-3和Caspase-9表達(dá)減少，其下降趨勢與銀杏內(nèi)酯B的劑量呈正相關(guān)，表明銀杏內(nèi)酯B確實(shí)能抑制HLECs的凋亡，并且抗凋亡作用主要是通過抑制Caspase-3和Caspase-9激活實(shí)現(xiàn)的。

圖2透射電鏡觀察各組HLECs超微結(jié)構(gòu)改變A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：1mol/L銀杏內(nèi)酯B組；D：10mol/L銀杏內(nèi)酯B組。

圖3銀杏內(nèi)酯B對氧化損傷致HLECs凋亡的抑制作用(×200)A：陰性對照組；B：氧化損傷組；C：1mol/L銀杏內(nèi)酯B組；D：10mol/L銀杏內(nèi)酯B組。

圖4銀杏內(nèi)酯B對氧化損傷致HLECs凋亡抑制率的影響bP<0.01vs氧化損傷組。

表1　銀杏內(nèi)酯B對高糖致HLECs損傷Caspase-3和Caspase-9活性的影響，U/mL)

注：aP<0.05vs氧化損傷組；bP<0.01vs陰性對照組。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B對高糖誘導(dǎo)的HLECs凋亡具有一定的抑制作用，抑制效應(yīng)與藥物濃度有關(guān)，從而可能減少HLECs細(xì)胞凋亡及由此引起的病理損害。本研究結(jié)果提示了銀杏內(nèi)酯B在白內(nèi)障防治方面的運(yùn)用潛力，為氧化應(yīng)激相關(guān)晶狀體疾病的防治提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

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Effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell apoptosis

Yan-Hong Wang, Tian-Ye Lan, Ting Chen, Ping Liu, Li-Li Lin

National Natural Science Foundation of China (No.30973275)

Li-Li Lin. Department of Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China. liuping3958@163.com

2016-03-09Accepted：2016-06-03

?AIM: To study the effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell (HLEC) apoptosis.

ginkgolide B; high glucose; lens epithelial cells; apoptosis

國家自然科學(xué)基金(No.30973275)

(150001)中國黑龍江省哈爾濱市，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科

王彥紅，護(hù)師，研究方向：白內(nèi)障。

林麗麗，碩士，主管護(hù)師，研究方向：白內(nèi)障.liuping3958@163.com

2016-03-09

2016-06-03

Wang YH, Lan TY, Chen T,etal. Effect of ginkgolide B on high glucose-induced human lens epithelial cell apoptosis.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(7):1242-1244

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.7.09

Departmentof Ophthalmology, First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China