黎　黎，鄭　璇，王雙梅，高　鴿，康前雁

?

·實(shí)驗(yàn)論著·

雄激素調(diào)節(jié)小鼠淚膜功能與角膜上皮細(xì)胞Mucins表達(dá)的體內(nèi)研究

黎黎1，鄭璇2，王雙梅3，高鴿3，康前雁1

?METHODS:Withorchiectomyoperation,wesetupmicemodel.Andserumandrogenconcentrationofmicewasdetectedbyradioimmunoassay.Break-uptime(BUT)oftearfilmwastestedinthedifferentexperimentalpoints.MicecornealepitheliawerepeeledandMUC1andMUC4mRNAandproteinlevelsweremeasuredbyRT-PCRandWesternblot.

?RESULTS:Theserumandrogenconcentrationreducedto0ng/μLat1wkafterorchiectomy.TheBUTvalueswere68.33±12.86s, 62.47±3.75s, 58.67±10.03s, 47.17±7.64s, 39.51±3.39s, 32.67±3.88sand31.00±2.36sinthenormalcontrolgroup,shamgroupandinorchectomygroupat1, 2, 4, 6and8wk,respectively,andtheBUTsweresignificantlyshorterintheorchectomyat2, 4, 6and8wkgroupsthanthoseinthenormalcontrolgroup(allatP<0.05).MUC1andMUC4mRNAandproteinslevelsdecreasedwithandrogenlevellowering(P<0.05).Mucin1levelwasthelowestat2wkafterorchiectomy,andthelowestMucin4levelwasfoundat1wkafterorchiectomy.

?CONCLUSION:In vivo,androgenregulatesMucinsexpressionsinmicecornealepithelialcells,makesBUTshorter，andinfluencethestabilityoftearfilm.

目的：探討去勢小鼠干眼模型中雄激素濃度對小鼠淚膜穩(wěn)定性以及角膜上皮細(xì)胞Mucins表達(dá)的影響。

方法：通過雙側(cè)睪丸切除去勢手術(shù)，改變體內(nèi)雄激素水平，觀察淚膜破裂時(shí)間的變化，同時(shí)在不同時(shí)間點(diǎn)采用RT-PCR法與Western-Blot法分別檢測小鼠角膜上皮細(xì)胞中Muc1和Muc4的mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。

結(jié)果：去勢1wk后小鼠睪酮質(zhì)量濃度下降至0ng/μL；正常對照組、偽手術(shù)組及去勢術(shù)后1、2、4、6、8wk組小鼠BUT分別為68.33±12.86、62.47±3.75、58.67±10.03、47.17±7.64、39.51±3.39、32.67±3.88、31.00±2.36s，其中術(shù)后2、4、6、8wk組小鼠淚液BUT值較正常對照與偽手術(shù)組均明顯縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。Muc1與Muc4的mRNA與蛋白水平表達(dá)，隨雄激素濃度下降，表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，Muc1在去勢后第2wk表達(dá)最低，而Muc4在去勢后第1wk表達(dá)降至最低。

結(jié)論：在體內(nèi)，雄激素可調(diào)控小鼠角膜上皮Mucins表達(dá)，并縮短淚膜破裂時(shí)間，參與淚膜穩(wěn)定性的維持。

雄激素；淚膜破裂時(shí)間；黏蛋白；角膜上皮細(xì)胞

引用：黎黎，鄭璇，王雙梅，等.雄激素調(diào)節(jié)小鼠淚膜功能與角膜上皮細(xì)胞Mucins表達(dá)的體內(nèi)研究.國際眼科雜志2016;16(7):1228-1231

0引言

干眼是一類因淚液量或質(zhì)異常導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定，伴眼部不適，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致眼表組織結(jié)構(gòu)病變的疾病總稱。干眼的發(fā)病由多因素參與，近年研究發(fā)現(xiàn)性激素分泌失衡也參與干眼的發(fā)生和發(fā)展[1-2]。已有研究證實(shí)，雄激素水平的改變可以調(diào)控瞼板腺、淚腺功能，進(jìn)而影響淚膜的穩(wěn)定性[3]，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)雄激素水平影響體外小鼠角膜上皮細(xì)胞Muc1和Muc4表達(dá)[4]，同時(shí)去勢小鼠的淚膜穩(wěn)定性也明顯下降[5]，然而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，雄激素濃度改變是否可以調(diào)節(jié)Muc1和Muc4的表達(dá)，是我們本研究希望了解的內(nèi)容。本研究擬建立去勢小鼠模型，觀察在體內(nèi)小鼠角膜上皮細(xì)胞Muc1和Muc4表達(dá)的變化，并觀察淚膜穩(wěn)定性的重要指標(biāo)——淚膜破裂時(shí)間(break-uptime，BUT)的表化。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級6～8周齡BALB/c雄性小鼠56只，無眼部疾病，體質(zhì)量20±2g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。本研究中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和喂養(yǎng)遵循國家科學(xué)技術(shù)部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2主要試劑及儀器設(shè)備Muc1兔抗鼠多克隆抗體(ab15481，美國Abcam公司)，Muc4兔抗鼠多克隆抗體(sc-20117，英國Santa公司)；TrizolReagent(美國Gibco公司)。反轉(zhuǎn)錄Real-timePCR試劑盒(大連寶生物制品公司)；酚紅棉線(天津晶明醫(yī)用器材公司)；熒光素鈉(廣州白云山明興制藥有限公司)。眼前節(jié)照相系統(tǒng)(蘇州66視覺科技股份有限公司)；游標(biāo)卡尺(上海儀器一廠)。

1.2方法

1.2.1干眼模型的建立及分組按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為正常對照組、偽手術(shù)組、術(shù)后1wk組、術(shù)后2wk組、術(shù)后4wk組、術(shù)后6wk組和術(shù)后8wk組，每組各8只小鼠。手術(shù)組小鼠全身麻醉(鹽酸氯胺酮100mg/kg)，無菌條件下經(jīng)陰囊正中切口，摘除小鼠雙側(cè)睪丸，立即縫合創(chuàng)口，肌內(nèi)注射青霉素G0.1mL。偽手術(shù)組小鼠麻醉，無菌條件下剪開陰囊正中皮膚但不摘除睪丸，術(shù)后處理同手術(shù)組。

1.2.2競爭放射免疫法檢測小鼠外周血睪酮濃度正常對照組、偽手術(shù)組于術(shù)后1wk、手術(shù)組于術(shù)后1、2、4、6、8wk脫頸法處死小鼠，摘除小鼠右眼眼球(每組8只)，同時(shí)采集血液500μL以上，室溫下靜置2～3h，待血液凝固后收集析出的血清，轉(zhuǎn)移至1mL離心管中，置于-20℃冰箱內(nèi)保存。加樣前融化搖勻，采用競爭放射免疫法檢測并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中睪酮濃度。

1.2.3角膜上皮細(xì)胞取材正常對照組、偽手術(shù)組于術(shù)后1wk、手術(shù)組于術(shù)后1、2、4、6、8wk脫頸法處死小鼠，無菌條件下摘除眼球，并放置于D-Hank液(含300μg/mL青-鏈霉素)中漂洗2遍。顯微鏡下鈍性分離角膜上皮組織待用。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測各組小鼠Muc1和Muc4mRNA的表達(dá)每組2個(gè)角膜上皮樣本，TrizolReagent提取細(xì)胞的總RNA，測總RNA濃度及波長260nm與280nm處的吸光度(A)值的比值(260/280)，-70℃保存?zhèn)溆?。引物設(shè)計(jì)：在Genbank中查出MUC基因和內(nèi)對照基因(β-Actin)的cDNA序列，用軟件Primer6.0設(shè)計(jì)引物。所用引物序列由大連寶生物制品公司合成。Muc1引物序列：上游5’-CCAGGACACCTACCATCCTATGAG-3’，下游5’-TCACCACAGCTGGGTTGGTATAAG-3’。Muc4引物序列：上游5’-AGGCCAATGCAAGCACCTG-3’，下游5’-AGTGTTCGCCCGAGGATGTA-3’。以總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行Real-time PCR檢測。

表1　各組小鼠淚膜破裂時(shí)間的比較±s，s)

注：P值為各組與正常對照組比較。

1.2.5 Western-Blot檢測各組小鼠Muc1和Muc4蛋白水平的表達(dá)每組6個(gè)小鼠角膜上皮樣本，液氮研磨，加入RIPA緩沖液和PMSF，獲得細(xì)胞裂解液，進(jìn)行Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度，以20～50μg總蛋白量上樣，12% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，漂洗后室溫封閉1h，一抗1∶1000室溫孵育1h，漂洗后二抗孵育1h，漂洗后ECL顯色，拍照，利用Image J軟件分析條帶的灰度值。以β-Actin作為內(nèi)參。

1.2.6各組小鼠淚膜破裂時(shí)間測定正常對照組、偽手術(shù)組于術(shù)后1wk、手術(shù)組分別于術(shù)后1、2、4、6、8wk用微量注射器將1%熒光素鈉1μL滴入各組小鼠下穹隆部，瞬目后可使熒光素鈉均勻分布于眼表面。在裂隙燈顯微鏡的鈷藍(lán)光下進(jìn)行觀察，記錄小鼠出現(xiàn)第一個(gè)淚膜破裂斑所需的時(shí)間，即BUT，重復(fù)觀察3次，取其平均值。

2結(jié)果

2.1去勢手術(shù)對血清睪酮濃度的影響正常對照組、偽手術(shù)組小鼠血清睪酮質(zhì)量濃度分別為573.87±6.74、579.74±8.24ng/μL，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。手術(shù)組小鼠去勢術(shù)后1wk開始血清睪酮濃度下降至0ng/μL，與正常組和偽手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2各組小鼠淚膜破裂時(shí)間比較正常對照組與偽手術(shù)組測定BUT分別為68.33±12.86、62.47±3.75s，各組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.762，P=0.119)。與正常對照組比較，術(shù)后1wk組小鼠BUT差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但術(shù)后2wk組、術(shù)后4wk組、術(shù)后6wk組和術(shù)后8wk組小鼠BUT逐漸縮短，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3去勢后小鼠角膜上皮Muc1和Muc4 mRNA表達(dá)的影響與正常對照組比較，去勢后各組角膜上皮細(xì)胞中Muc1mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；去勢2wk時(shí)，Muc1mRNA表達(dá)降低至最低，去勢4、6、8wk后Muc1mRNA表達(dá)緩慢增加，但仍低于正常對照組表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。與正常對照組比較，去勢后各組角膜上皮細(xì)胞中Muc4 mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；去勢1wk時(shí)，Muc4 mRNA表達(dá)降低至最低，去勢2、4、6、8wk后Muc4 mRNA表達(dá)緩慢增加，但仍低于正常對照組表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1去勢后小鼠角膜上皮Muc1mRNA的表達(dá)變化aP<0.05vs正常對照組。

2.4去勢后小鼠角膜上皮Muc1和Muc4蛋白水平表達(dá)的影響去勢后Muc1與Muc4蛋白水平表達(dá)也有下降(圖3～5)，變化規(guī)律基本與其mRNA水平的變化一致。Muc1在去勢后第2wk表達(dá)最低，而Muc4在去勢后第1wk表達(dá)降至最低。

3討論

世界干眼研究小組(DEWS)根據(jù)臨床以及基礎(chǔ)研究證據(jù)，已經(jīng)闡明女性是干眼的易患因素[6-7]，女性干眼患者也高于男性，這與雄激素的保護(hù)作用有關(guān)。淚膜是一層僅為7μm的動(dòng)態(tài)薄膜，覆蓋于眼表，對于維持眼表微環(huán)境意義重大。目前已知淚膜可分為三層，分別為脂質(zhì)層、水樣層、黏蛋白層，各層對維持淚膜穩(wěn)定性均很重要；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雄激素可明顯減少瞼板腺分泌量，引起淚膜的脂質(zhì)層功能異常，淚膜穩(wěn)定性下降[8-9]；另有研究通過對去勢后的雄兔眼表及淚膜的變化進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)雄激素水平降低，淚腺上皮細(xì)胞萎縮，導(dǎo)致淚液分泌減少[10]。而淚膜中黏蛋白層，尤其是膜結(jié)合型Mucins，其與角膜上皮細(xì)胞微絨毛形態(tài)對維持淚膜的穩(wěn)定性具有更為重要的意義，膜結(jié)合型Mucins為極化跨膜大分子物質(zhì)，疏水端跨膜固定于角膜上皮的微絨毛上，而親水端形成一個(gè)長尾巴，游離在淚膜中，以此方式將疏水性的角膜上皮細(xì)胞與親水性的淚膜水樣層聯(lián)系起來，二者共同作用才將淚膜通過瞬目運(yùn)動(dòng)均勻地涂布在角膜表面，同時(shí)保護(hù)上皮細(xì)胞免受瞬目摩擦帶來的損傷，維持角膜上皮細(xì)胞的非角化特性[11]。眼表主要的膜結(jié)合型Mucins為Muc1與Muc4。有關(guān)雄激素對黏蛋白表達(dá)的影響已在體內(nèi)多種組織細(xì)胞中得到證實(shí)，如在男性泌尿生殖道上皮細(xì)胞中表達(dá)多種黏蛋白，且受雄激素調(diào)節(jié)[12]，此外DHT可上調(diào)前列腺癌細(xì)胞(PC-3)Muc1 mRNA表達(dá)[13]。在眼部的研究相對較少。而本研究發(fā)現(xiàn)，去勢后雄激素水平驟降，接近0μg/mL，小鼠角膜上皮中Muc1和Muc4，無論是基因水平還是蛋白水平，均有下降；這與本課題組之前的體外研究結(jié)果一致[4]；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，隨著去勢時(shí)間的延長，Mucins表達(dá)逐漸回升，我們考慮是存在其他途徑的調(diào)控有關(guān)。

本研究利用BUT作為評價(jià)淚膜穩(wěn)定性的指標(biāo)，采用熒光素染色觀察BUT，該方法簡便經(jīng)濟(jì)，適用于體內(nèi)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。我們的結(jié)果顯示，去勢后體內(nèi)睪酮含量幾乎消失，BUT明顯縮短，并且隨時(shí)間延長而加重；目前臨床中主要用于評價(jià)淚膜穩(wěn)定性的方法有：(1)BUT：BUT的檢查包括利用淚膜鏡測得的非侵犯性BUT及利用熒光素的BUT，操作簡便，適合初步篩查以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；(2)角膜地形圖[14]，該檢測方法可以一定程度上對淚膜分布的情況作一描述，在淚膜分布出現(xiàn)異常或者波動(dòng)時(shí)表現(xiàn)出異常的散光增加。在干眼患者的檢測中發(fā)現(xiàn)，其角膜表面的規(guī)則相關(guān)性參數(shù)較正常人增高，并且隨著干眼造成的眼表損傷程度的加重，參數(shù)增高，但由于采樣面積等因素，預(yù)實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與重復(fù)性不佳，故在本研究中未被采用。淚膜穩(wěn)定性是對淚膜功能的一個(gè)綜合評定，并且常與臨床表現(xiàn)直接相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在體內(nèi)雄激素濃度下降后，BUT明顯縮短，同時(shí)Muc1和Muc4表達(dá)也下降。因此，推測雄激素可能通過影響角膜上皮細(xì)胞Mucins表達(dá)，最終影響淚膜穩(wěn)定性，其中的具體機(jī)制需要進(jìn)一步探索。我們知道BUT是一個(gè)綜合性指標(biāo)，而淚膜三層結(jié)構(gòu)(脂質(zhì)層、水樣層、黏蛋白層)的任何一個(gè)或多個(gè)異常，均會(huì)影響B(tài)UT，而本研究并未考慮到脂質(zhì)層與水樣層的差異，這是本文的不足之處，需要進(jìn)一步補(bǔ)充研究。

圖2去勢后小鼠角膜上皮Muc4mRNA的表達(dá)變化aP<0.05vs正常對照組。

圖3去勢后小鼠角膜上皮Muc1蛋白水平的表達(dá)變化。

圖4去勢后小鼠角膜上皮Muc4蛋白水平的表達(dá)變化。

圖5去勢后小鼠角膜上皮Muc1和Muc4蛋白水平表達(dá)的柱形圖aP<0.05vs正常對照組。

綜上所述，在體內(nèi)雄激素可調(diào)控小鼠角膜上皮黏蛋白表達(dá)，并且雄激素水平變化影響B(tài)UT與淚膜穩(wěn)定性。對以上現(xiàn)象的作用機(jī)制進(jìn)行深入探索，將可能為干眼的研究和臨床治療開辟新的方向。

1胡道德，顧磊，劉焰，等.干眼癥的研究進(jìn)展. 眼科新進(jìn)展 2007；27(5):380-382

2張宏，馬俊旗，安曉，等.圍絕經(jīng)期干眼患者眼表CXCR3表達(dá)與性激素的相關(guān)性分析.眼科新進(jìn)展 2013；33(9):839-842

3 Schirra F, Suzuki T, Dickinson DP,etal. Identification of steroidogenic enzyme mRNAs in the human lacrimal gland, meibomian gland, cornea, and conjunctiva.Cornea2006；25(4):438-442

4黎黎，高鴿，鄭璇，等. 二氫睪酮對小鼠角膜上皮細(xì)胞Mucins表達(dá)的影響.眼科新進(jìn)展2014；34(8):701-704

5黎黎，王雙梅，鄭璇，等. 去勢雄性小鼠淚膜功能異常及角膜上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變. 中華實(shí)驗(yàn)眼科 2016；34(2):103-107

6 The epidemiology of dry eye disease: report of the epidemiology subcommittee of the international Dry Eye WorkShop.OculSurf2007;5(2):93-107

7 Yazdani C，McLaughlin T，Smeeding JE，etal. Prevalence of treated dry eye disease in a managed care population.ClinTher2001；23(10):1672-1682

8 Suzuki T, Kinoshita Y, Tachibana M,etal. Expression of sex steroid hormone receptors in human cornea.CurrEyeRes2001;22(1):28-33

9 Schirra F, Suzuki T, Richard SM,etal. Androgen control of gene expression in the mouse meibomian gland.InvestOphthalmolVisSci2005；46(10):3666-3675

10羅豐年，張汗承，孫敘清，等.去勢雄兔淚液分泌及淚膜穩(wěn)定性的改變.中華眼科雜志2001；37(6):458-461

11 Ashutosh S. Energetics of corneal epithelial cell-ocular mucus-tear film interactions: some surface-chemical pathways of corneal defense.BiophysChem1993；47(1)：87-99

12 Russo CL, Spurr-Michaud S, Tisdale A,etal. Mucin gene expression in human male urogenital tract epithelia.HumReprod2006；21(11):2783-2793

13 Evanqelou A, Letarte M, Marks A,etal. Androgen modulation of adhesion and antiadhesion molecules in PC-3 prostate cancer cells expressing androgen receptor.Endocrinoloqy2002；143(10):3897-3904

14李劼，趙懇，孫明，等.干眼癥對角膜地形圖角膜厚度檢測結(jié)果的影響.國際眼科雜志 2011；11(4):735-736

Effect of androgen on mice tear film stability and Mucins expressions in mice corneal epithelial cells in vivo

Li Li1, Xuan Zheng2, Shuang-Mei Wang3, Ge Gao3, Qian-Yan Kang1

NationalScienceFoundationofChina(No.81100647)

Qian-YanKang.DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaoTongUniversity,Xi’an710061,ShaanxiProvince,China.eyelili2010@mail.xjtu.edu.cn

2016-03-06Accepted：2016-06-15

?AIM:Tostudyin vivotheeffectofandrogenonmicetearfilmstabilityandMucinsexpressionsincornealepithelialcellsinBALB/cmiceafterorchectomy.

androgen;tearfilmbreaktime;mucins:cornealepitheliumcell

國家自然科學(xué)青年基金(No.81100647)

1(710061)中國陜西省西安市，西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科；2(710002)中國陜西省西安市第一醫(yī)院眼科；3(710004)中國陜西省西安市第四醫(yī)院眼科

黎黎，畢業(yè)于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院，眼科學(xué)博士，主治醫(yī)師，助理研究員，講師，研究方向：眼表疾病。

康前雁，畢業(yè)于西安交通大學(xué)，博士，主任醫(yī)師，研究方向：眼組織損傷修復(fù).eyelili2010@mail.xjtu.edu.cn

2016-03-06

2016-06-15

1DepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaoTongUniversity,Xi’an710061,ShaanxiProvince,China；2DepartmentofOphthalmology,Xi’anNo.1Hospital,Xi’an710002,ShaanxiProvince,China；3DepartmentofOphthalmology,Xi’anNo.4Hospital,Xi’an710004,ShaanxiProvince,China

LiL,ZhengX,WangSM, et al.EffectofandrogenonmicetearfilmstabilityandMucinsexpressionsinmicecornealepithelialcellsin vivo. Guoji Yanke Zazhi(Int Eye Sci) 2016;16(7):1228-1231

10.3980/j.issn.1672-5123.2016.7.06