李丙生　許岸高　甘愛(ài)華　張曉慧　黃文峰　余中貴　陳曉龍

?

·基礎(chǔ)研究論著·

HRM探討IL-23R/IL-17基因多態(tài)性與大腸腫瘤關(guān)聯(lián)性研究

李丙生許岸高甘愛(ài)華張曉慧黃文峰余中貴陳曉龍

目的運(yùn)用高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)(HRM) 探討IL-23/IL-17炎癥軸中IL-23R、IL-17基因多態(tài)性(GP)與大腸腫瘤的相關(guān)性。方法采用病例對(duì)照研究，選擇大腸癌組(CRC組)、大腸腺瘤組(AA組)和健康對(duì)照組(HC組)各50例患者，用HRM方法檢測(cè)組織 IL-23R(rs6682925、rs1884444、rs10889677)、IL-17 rs763780的GP，比較其在各組的分布差異。結(jié)果3組的IL-23R rs10889677基因型頻率分布存在差異(P=0.028)。CRC組和HC組間，在不喝酒亞組中，IL-23R rs6682925位點(diǎn)CC基因型患CRC風(fēng)險(xiǎn)比TT增加9.73倍(校正OR=10.73，95%CI1.02～112.50)；在吸煙亞組中，rs1884444位點(diǎn)TT基因型比TG患CRC風(fēng)險(xiǎn)增加4.47倍(校正OR=5.47，95%CI1.08～27.6)；在男性患者中，rs10889677位點(diǎn)AA基因型患CRC風(fēng)險(xiǎn)比AC基因型增加3.15倍(校正OR=4.15，95%CI1.02～16.91)，另外病變部位在結(jié)腸亞組中，攜帶rs10889677位點(diǎn)AA基因型的患者比攜帶AC基因型的患者患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了2.18倍(校正OR=3.18，95%CI1.04～9.71)；AA組和HC組間，IL-23R rs10889677位點(diǎn)攜帶AA基因型比攜帶AC基因型患者患AA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.40倍(校正OR=3.40，95%CI1.38～8.37)；在RCR組和AA組中，以上多態(tài)性基因位點(diǎn)基因頻率分布及分層分析結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-17 rs763780的GP在3組的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論IL-23R基因多態(tài)性與大腸癌、大腸腺瘤的發(fā)病相關(guān)，而IL-17基因多態(tài)性與大腸癌、大腸腺瘤均無(wú)關(guān)。

白介素-23R；白介素-17；基因多態(tài)性；大腸腫瘤

我國(guó)大腸癌的發(fā)病率及病死率呈逐年上升的趨勢(shì)。近年來(lái)，炎癥與大腸癌的關(guān)系越來(lái)越受到重視。發(fā)現(xiàn)許多炎癥因子的基因多態(tài)性(GP)參與大腸癌的發(fā)病進(jìn)程[1-8]。因此尋找出更多同大腸癌相關(guān)的細(xì)胞因子的GP位點(diǎn)，將可為大腸癌防治提供新的思路。已有不少研究發(fā)現(xiàn)IL-23/IL-17炎癥軸的相關(guān)細(xì)胞因子與腺瘤、大腸癌密切相關(guān)[9-12]，但目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)系統(tǒng)探討IL-23/IL-17炎癥軸中的關(guān)鍵細(xì)胞因子GP與大腸癌、腺瘤的易感性關(guān)聯(lián)性研究報(bào)道。高分辨率熔解曲線(xiàn)分析(HRM)是新近開(kāi)發(fā)的一種醫(yī)學(xué)分子診斷技術(shù)，具有高通量、經(jīng)濟(jì)、快捷、簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)[13]。因此，本研究將采用HRM法探討IL-23/IL-17炎癥軸中關(guān)鍵的細(xì)胞因子IL-23R、IL-17F位點(diǎn)的GP與大腸癌、大腸腺瘤的關(guān)聯(lián)性。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

連續(xù)收集2013年10月至2014年6月惠州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科和胃腸外科就診的大腸癌組(CRC組)、大腸腺瘤組(AA組)、健康對(duì)照組(HC組)各50例的組織標(biāo)本并抽提基因組DNA，同時(shí)收集患者的相關(guān)臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理組織學(xué)檢查(均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的胃腸道病理學(xué)專(zhuān)家閱片判定)確診為大腸癌與大腸腺瘤患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①家族性或遺傳性結(jié)直腸腺瘤或腫瘤；②其他系統(tǒng)或器官腫瘤；③大腸癌或大腸腺瘤患者同時(shí)患有炎癥性腸??；④術(shù)前有放射治療或化學(xué)治療史；⑤妊娠或有嚴(yán)重肝腎功能不全者；⑥非原發(fā)癌灶者及不能確診等其他情況。病例組患者均經(jīng)腸鏡及活檢病理或手術(shù)活檢病理確診為大腸癌或大腸腺瘤性息肉。其中CRC組男23例、女27例，年齡(58.5±15.6)歲；AA組男33例、女17例，年齡(55.7±14.3)歲。HC組為健康體檢人群，其中男24名、女26名，年齡(57.2±13.9)歲，3組的性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。納入研究人員均簽訂知情同意書(shū)，本研究通過(guò)倫理委員會(huì)審查。

二、PCR-HRM檢測(cè)

根據(jù) NCBI 的IL-23R、IL-17的參考基因序列,使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(IL-23Rrs6682925, F: GCCCAAACATGGAAATAACATT, R:CCTTCCT-TTTTATGGCTGCAT; IL-23Rrs1884444, F: GTCTT-TTCCTGCTTCCAGACAT, R: ACACCATACCTCCAT-GACACCA；IL-23Rrs10889677, F: GCTCCATGCC-TTTTTAATTTTAG, R: CCTTCGGGACCTTAATTC-TCTA; IL-17rs763780, F: AGCTGAGTGGATATGCA-CCTCT, R: TGGAGAAGGTGCTGGTGACT), 引物由上海生工生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增與HRM檢測(cè)均在LightCycler480 PCR儀上操作。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 10 min; 95℃變性10 s, 60/61℃退火/延伸30 s共40個(gè)循環(huán)；HRM分析95℃ 5 min,40℃ 1 min,65℃ 1 s,95℃。每秒檢測(cè)熒光25次；冷卻40℃ 30 s 進(jìn)行反應(yīng)。

三、DNA測(cè)序

為了驗(yàn)證PCR方法的準(zhǔn)確性，我們按照每個(gè)位點(diǎn)不同的熔解曲線(xiàn)所分出的基因型，挑選不同熔解曲線(xiàn)所對(duì)應(yīng)的樣本各2～3個(gè)的PCR產(chǎn)物送至廣州英濰捷基公司測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果確定各組曲線(xiàn)的基因型。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用χ2檢驗(yàn)比較人口學(xué)特征和 Hardy-Weinberg平衡定律；使用χ2檢驗(yàn)分析病例組與對(duì)照組的基因頻率及等位基因頻率分布差異，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)；SNP與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系采用Logistic回歸分析，用校正性別、年齡、發(fā)病部位、吸煙和喝酒狀況后的OR和95%CI表示。P<0.05或校正后P<0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

一、CRC組、AA組和HC組一般資料比較

CRC組、AA組及HC組的性別、年齡、發(fā)病部位、吸煙、飲酒比例比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。IL-23R(rs6682925、rs1884444、rs10889677)、IL-17 rs763780的GP在正常對(duì)照組基因型分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，具有群體代表性。

表1CRC組、AA組和HC組的一般情況比較

項(xiàng) 目CRC組(50例)AA組(50例)HC組(50名)P值年齡(歲)<50121213≥503838370.965性別男233324女2717260.649吸煙a吸煙212120不吸2929300.923飲酒b喝酒192218不喝3128320.695部位直腸293628結(jié)腸2114220.199

注：a吸煙史陽(yáng)性的定義為每天至少吸煙1支，連續(xù)吸煙1年以上，長(zhǎng)期吸煙或者戒煙少于半年；b飲酒史陽(yáng)性定義為平均每日酒精攝入量>25 g,長(zhǎng)期飲酒持續(xù)時(shí)間>1年或者戒酒時(shí)間<3個(gè)月

二、CRC組、AA組和HC組IL-23R、IL-17的4個(gè)位點(diǎn)基因型頻率分布比較

3組的IL-23R rs6682925、rs1884444、IL-17F rs763780的基因型頻率分布比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，IL-23R rs10889677基因型頻率分布存在差異(χ2=7.18，P=0.028)，經(jīng)過(guò)兩兩比較，僅AA組與HC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.90，P=0.009)。A/C等位基因分布，在AA組與HC組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.01，P=0.025，OR=2.20, 95%CI1.04～4.44)，見(jiàn)表2。

三、IL-23R位點(diǎn)GP與CRC、AA患病易感關(guān)聯(lián)性分析

通過(guò)調(diào)整年齡、性別、吸煙、飲酒、病變部位因素的進(jìn)一步分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在男性患者與在病變位于結(jié)腸亞組中，與AC基因型相比，AA基因型是大腸癌危險(xiǎn)因素；IL-23R rs1884444位點(diǎn)GP在吸煙人群中，與TG基因型相比，TT基因型是大腸癌危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表2　CRC組、AA組和HC組IL-23R、IL-17的4個(gè)位點(diǎn)基因型頻率分布比較　例(%)

討　　論

大量研究證據(jù)表明，促炎細(xì)胞因子對(duì)維持慢性炎癥，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生成，腫瘤微環(huán)境擴(kuò)張以及抑制腫瘤免疫監(jiān)視具有重要作用[14]。其中，IL-23/IL-17炎癥軸中的關(guān)鍵細(xì)胞因子與腫瘤關(guān)系備受關(guān)注。已有研究發(fā)現(xiàn)IL-23、IL-17促炎癥細(xì)胞因子GP與消化道腫瘤密切相關(guān)，但與大腸腫瘤的相關(guān)性研究報(bào)道少見(jiàn)[15]。因此，深入全面探討IL-23/IL-17炎癥軸中關(guān)鍵的細(xì)胞因子GP與大腸腫瘤的關(guān)系非常重要。

目前，Chen[16]等在一項(xiàng)包含了1 043例胃癌患者和1 089例健康對(duì)照的病例對(duì)照研究中發(fā)現(xiàn)IL-23R rs6682925位點(diǎn)GP與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性，但rs1884444的G等位基因可以降低腸型胃癌的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.75，95%CI0.65～0.87)；Chu等[12]研究表明IL-23R rs6682925的TC/CC基因型和rs1884444位點(diǎn)TG/GG基因型和食管癌的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)。但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)探討IL-23R rs6682925 GP與大腸腫瘤相關(guān)性研究報(bào)道，本研究我們首次發(fā)現(xiàn)，在不喝酒人群中，與HC組比，攜帶rs6682925 CC基因型患者患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加9.73倍，這與Chu等[12]的研究結(jié)果相類(lèi)似，但我們的研究并未顯示該位點(diǎn)GP在AA發(fā)病的相關(guān)性，也沒(méi)有在大腸癌與AA組間發(fā)現(xiàn)他們間的相關(guān)性；在吸煙人群中rs1884444 TT基因型患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加4.47倍。但未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)GP在AA的發(fā)病及在“腺瘤-大腸癌”的過(guò)程中的作用。鑒于目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)研究數(shù)據(jù)，因此，我們的研究結(jié)果率先提供非常有意義的理論依據(jù)，但由于地域的局限性及樣本量的不足，尚需更強(qiáng)論證強(qiáng)度的大樣本量研究深入探討。

表3　IL-23R位點(diǎn)SNP與CRC、AA患病易感關(guān)聯(lián)性分析

Nemati等[15]研究發(fā)現(xiàn)，IL-23R rs10889677位點(diǎn)的GP與大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)相關(guān)性，但I(xiàn)L-17A rs2275913攜帶AG基因型可以增加患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)，相反，rs763780攜帶TT基因型或T等位基因可以顯著降低患大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在男性患者中，CRC組比HC組攜帶IL-23R rs10889677AA基因型患大腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加3.15倍，在發(fā)病部位位于結(jié)腸患者中，攜帶該基因型比攜帶AC基因型大腸癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加2.18倍，但A/C等位基因間未能表現(xiàn)相關(guān)性；AA組比HC組攜帶該基因型患AA的風(fēng)險(xiǎn)增加2.40倍，這提示rs10889677位點(diǎn)GP與AA的發(fā)病存在相關(guān)性，進(jìn)一步對(duì)該位點(diǎn)的等位基因進(jìn)行分析結(jié)果提示，與攜帶C等位基因相比，攜帶A等位基因可以增加大腸腺瘤性息肉的風(fēng)險(xiǎn)。未發(fā)現(xiàn)IL-23R rs10889677位點(diǎn)GP在其他組間相關(guān)性。這與Nemati等[15]的研究結(jié)果不同，其可能的原因是不同地域的人群大腸癌易感基因型不同，另外還可能的原因是樣本量不足。然而，在我們的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果中，IL-23R rs10889677 AA即是大腸癌的易感基因，又是大腸腺瘤的易感基因，根據(jù)前面提到的大腸癌發(fā)展的模式“早期腺瘤-晚期腺瘤-癌”來(lái)看，我們推測(cè)IL-23R rs10889677 AA可能在大腸腺瘤性息肉發(fā)展為大腸癌的過(guò)程中起到作用，但我們的數(shù)據(jù)卻未提供這方面的證據(jù)，而是得出該基因型與該進(jìn)程無(wú)關(guān)的結(jié)果，這可能需要更大的樣本量的數(shù)據(jù)來(lái)尋找并證明該基因型與上述腫瘤進(jìn)程的關(guān)系。

對(duì)于IL-17F基因外顯子區(qū)域的rs763780位點(diǎn)，本研究結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與大腸癌或大腸腺瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，這與 Nemati等[15]的研究結(jié)果不同。出現(xiàn)上述兩個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果與類(lèi)似研究人員研究結(jié)果不同的可能原因是：①基因分型檢測(cè)方法結(jié)果不準(zhǔn)確，出現(xiàn)假陽(yáng)性，而本研究采用HRM基因分析技術(shù)，準(zhǔn)確率較高，假陽(yáng)性率較低，并經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證部分樣本，結(jié)果更可信；②不同種族人群的遺傳差異也可能導(dǎo)致研究結(jié)果不一致；③樣本量偏小導(dǎo)致結(jié)果的偏倚。

綜上所述，本研究探討IL-23R rs6682925 GP與大腸腫瘤相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)IL-23R rs6682925、rs1884444、rs10889677位點(diǎn)與大腸腫瘤遺傳易感相關(guān)，而IL-17基因多態(tài)性與大腸癌、大腸腺瘤均無(wú)關(guān)。

[1]Landi S, Bottari F, Gemignani F, Gioia-Patricola L, Guino E, Osorio A, de Oca J, Capella G, Canzian F, Moreno V; Bellvitge Colorectal Cancer Study Group. Interleukin-4 and interleukin-4 receptor polymorphisms and colorectal cancer risk. Eur J Cancer，2007，43(4):762-768.

[2]Azimzadeh P, Romani S, Mohebbi SR, Kazemian S, Vahedi M, Almasi S, Fatemi SR, Zali MR. Interleukin-16 (IL-16) gene polymorphisms in Iranian patients with colorectal cancer. J Gastrointestin Liver Dis，2011，20(4):371-376.

[3]Castro FA, F?rsti A, Buch S, Kalthoff H, Krauss C, Bauer M, Egberts J, Schniewind B, Broering DC, Schreiber S, Schmitt M, Hampe J, Hemminki K, Schafmayer C. TLR-3 polymorphism is an independent prognostic marker for stage Ⅱ colorectal cancer. Eur J Cancer，2011，47(8):1203-1210.

[5]Yannopoulos A, Nikiteas N, Chatzitheofylaktou A, Tsigris C. The (-590 C/T) polymorphism in the interleukin-4 gene is associated with increased risk for early stages of corolectal adenocarcinoma. In Vivo，2007，21(6):1031-1035.

[6]Wu X, Zeng Z, Chen B, Yu J, Xue L, Hao Y, Chen M, Sung JJ, Hu P. Association between polymorphisms in interleukin-17A and interleukin-17F genes and risks of gastric cancer. Int J Cancer，2010，127(1):86-92.

[7]Poole EM, Curtin K, Hsu L, Duggan DJ, Makar KW, Xiao L, Carlson CS, Caan BJ, Potter JD, Slattery ML, Ulrich CM. Genetic variability in IL23R and risk of colorectal adenoma and colorectal cancer. Cancer Epidemiol，2012，36(2):e104- e110.

[8]肖勇, 陳維, 曹維克, 褚紅軍, 郭偉, 潘善東, 姜潔, 董靜, 胡志斌, 沈洪兵. IL23R基因多態(tài)與食管癌遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)， 2011，31(4)513-516，521.

[9]Wu S, Rhee KJ, Albesiano E, Rabizadeh S, Wu X, Yen HR, Huso DL, Brancati FL, Wick E, McAllister F, Housseau F, Pardoll DM, Sears CL. A human colonic commensal promotes colon tumorigenesis via activation of T helper type 17 T cell responses. Nat Med, 2009，15(9):1016-1022.

[10]王建升, 張立志, 帖彥清, 呂元鵬, 宋津曉. 結(jié)直腸息肉、結(jié)直腸腺瘤和結(jié)直腸癌患者外周血中Th17和Tc17細(xì)胞的變化. 天津醫(yī)藥，2014，42(4)：312-314.

[11]Sandler RS, Halabi S, Baron JA, Budinger S, Paskett E, Keresztes R, Petrelli N, Pipas JM, Karp DD, Loprinzi CL, Steinbach G, Schilsky R. A randomized trial of aspirin to prevent colorectal adenomas in patients with previous colorectal cancer. N Engl J Med，2003，348(10):883-890.

[12]Chu H, Cao W, Chen W, Pan S, Xiao Y, Liu Y, Gu H, Guo W, Xu L, Hu Z, Shen H. Potentially functional polymorphisms in IL-23 receptor and risk of esophageal cancer in a Chinese population. Int J Cancer，2012，130(5):1093-1097.

[13]Krypuy M, Ahmed AA, Etemadmoghadam D, Hyland SJ, DeFazio A, Fox SB, Brenton JD, Bowtell DD, Dobrovic A. High resolution melting for mutation scanning of TP53 exons 5-8. BMC Cancer，2007，7:168.

[14]曾慶理, 李少麗, 周燕斌. 白細(xì)胞介素-32在炎癥與腫瘤中的研究進(jìn)展. 新醫(yī)學(xué)，2013，44(11)：733-738.

[15]Nemati K, Golmoghaddam H, Hosseini SV, Ghaderi A, Doroudchi M. Interleukin-17FT7488 allele is associated with a decreased risk of colorectal cancer and tumor progression. Gene，2015，561(1):88-94.

[16]Chen J, Lu Y, Zhang H, Ding Y, Ren C, Hua Z, Zhou Y, Deng B, Jin G, Hu Z, Xu Y, Shen H. A nonsynonymous polymorphism in IL23R gene is associated with risk of gastric cancer in a Chinese population. Mol Carcinog，2010，49(10):862-868.

(本文編輯：楊江瑜)

Application of high resolution melting assay to explore the correlation between the single nucleotide polymorphisms of IL-23/IL-17 gene and colorectal cancer

LiBingsheng,XuAngao,GanAihua,ZhangXiaohui,HuangWenfeng,YuZhonggui,ChenXiaolong.

HuizhouFirstHospital，Huizhou516003,China

,XuAngao，E-mail：angao62@21cn.com

ObjectiveTo explore the correlation between the gene polymorphisms (GP) of IL-23R/IL-17 gene, which is located in the IL-23/IL-17 axis, and the risk of colorectal cancer by using the high resolution melting (HRM) assay. MethodsIn this case-control study, 50 patients with colorectal cancer (CRC group), 50 with colorectal adenoma (AA group) and 50 healthy controls (HC group) were recruited. The GP and distribution of IL-23R (rs6682925, rs1884444 and rs10889677) and IL-17 rs763780 were detected and statistically compared among three groups using HRM assay. ResultsAmong three groups, the genotype frequency of IL-23R rs10889677 significantly differed (P=0.028). In the non-drinking subgroup between the CRC and HC groups, the risk of CRC in subjects with IL-23R rs6682925 CC genotype was 10.73 times higher than that of their counterparts with TT genotype (adjustedOR=10.73, 95%CI1.02-112.50). In the smoking subgroup, the risk of CRC in patients with rs1884444 TT genotype was 5.47 times higher compared with that of their counterparts with TG genotype (adjustedOR=5.47, 95%CI1.08-27.6). For male subjects, the risk of CRC with rs10889677 AA genotype was 4.145 times higher than that of their counterparts with AC genotype (adjustedOR=4.15, 95%CI1.02-16.91). In the colon cancer subgroup, the risk of CRC with rs10889677 AA genotype was 3.175 times higher than that of AC genotype counterparts (adjustedOR=3.18, 95%CI1.04-9.71). Comparing between the AA and HC groups, the risk of AA in subjects with rs10889677 AA genotype was 3.40 times higher compared with that in those with AC genotype (adjustedOR=3.40, 95%CI1.38-8.37). No significant difference was documented in the gene frequency and distribution between the CRC and AA groups.There was no significant difference in the distribution of IL-17 rs763780 GP among the three groups. ConclusionIL-23R GP is correlated with the incidence of CRC and AA, but IL-17 GP is not a relevant factor.

Interleukin-23R; Interleukin-17; Gene polymorphism; Colorectal cancer

10.3969/j.issn.0253-9802.2016.10.003

廣東省自然基金(2015A030310057)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2103B021800079)；廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)基金(A2014812)

516003 惠州，惠州市第一人民醫(yī)院

，許岸高，E-mail：angao62@21cn.com

2016-06-06)