邢　潔，李立欣，王　強，馬　放

(1.黑龍江省環(huán)境科學研究院，哈爾濱 150056; 2.黑龍江科技大學 環(huán)境與化工學院，哈爾濱 150022；3.哈爾濱工業(yè)大學 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱 150090)

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微生物絮凝劑產(chǎn)生菌J-1的生長發(fā)酵動力學模型

邢潔1，李立欣2，王強1，馬放3

(1.黑龍江省環(huán)境科學研究院，哈爾濱 150056; 2.黑龍江科技大學 環(huán)境與化工學院，哈爾濱 150022；3.哈爾濱工業(yè)大學 城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱 150090)

為提高微生物絮凝劑的產(chǎn)量，選取自主篩選的優(yōu)勢菌種克雷伯氏菌J-1，研究其生長發(fā)酵過程，探索菌體生長與產(chǎn)物生成之間的內(nèi)在規(guī)律,得到產(chǎn)絮菌J-1的生長動力學模型及其產(chǎn)物生成動力學模型。結(jié)果表明：產(chǎn)絮菌J-1代謝產(chǎn)物的生成與其菌體總量相關(guān)，保證充足的營養(yǎng)和生物量，微生物絮凝劑的合成速率得到有效提高。當產(chǎn)絮菌J-1發(fā)酵至15 h時，絮凝率最高為94.97%。

微生物絮凝劑； 產(chǎn)絮菌； 生長動力學； 產(chǎn)物生成動力學

0　引　言

2015年，國務院正式發(fā)布《水污染防治行動計劃》，系統(tǒng)推進水污染防治、水生態(tài)保護和水資源管理。這意味著我國水污染現(xiàn)狀和水資源保護工作已經(jīng)引起政府與公眾的高度重視。水污染防治的嚴峻形勢對水處理技術(shù)提出了新的要求，其綠色化進程將被提速。開發(fā)功能齊備、環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展的綠色水處理劑，已經(jīng)成為水污染處理領(lǐng)域的研究熱點。絮凝劑是水處理劑中最常用的一種藥劑，其發(fā)展經(jīng)歷了無機低/高分子絮凝劑、有機低/高分子絮凝劑和微生物絮凝劑三大階段[1]。要達到生產(chǎn)過程和使用過程均綠色化的目標，微生物絮凝劑成為絮凝劑綠色化進程中的主流研究方向。微生物絮凝劑是利用微生物的生長代謝特點，積累有益代謝產(chǎn)物，并對其進行分離提取后獲得的產(chǎn)品。整個生產(chǎn)過程安全無毒、無二次污染，可以有效克服無機和有機絮凝劑殘留時間長、無法生物降解而對環(huán)境造成再次污染的缺點[2]。歷經(jīng)30余年，國內(nèi)外科研工作者對微生物絮凝劑展開了廣泛研究，在菌種資源方面獲得顯著成果[3]。然而，由于微生物特有的生理周期震蕩性和遺傳變異性，微生物絮凝劑的發(fā)酵尚存在不穩(wěn)定性[4]，所以，需要不斷開發(fā)新的高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌(以下簡稱產(chǎn)絮菌)，來補充完善菌種資源。通過菌體生長動力學來客觀地掌握其生理特征，通過產(chǎn)物生成動力學明確產(chǎn)物生成條件，為調(diào)控產(chǎn)絮菌的發(fā)酵過程，促進微生物絮凝劑生產(chǎn)發(fā)酵機械化、智能化，最終提高微生物絮凝劑產(chǎn)率奠定基礎(chǔ)。筆者研究的產(chǎn)絮菌J-1為自主篩選的優(yōu)勢菌種克雷伯氏菌(Klebsiella sp．)[5]。為了優(yōu)化調(diào)控產(chǎn)絮菌J-1的發(fā)酵過程，擴大微生物絮凝劑的產(chǎn)量，特對產(chǎn)絮菌J-1的生長發(fā)酵動力學進行了初步研究。

1　材料與方法

1.1實驗材料

菌種：產(chǎn)絮菌J-1是從活性污泥中分離馴化的菌種，經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)，菌種保藏號為CGMCC NO.6243。

培養(yǎng)條件：每100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中接種6.5 mL產(chǎn)絮菌J-1種子液，pH值為7.5，溫度為35 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min。

培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，K2HPO45.0 g，KH2PO42.0 g，NaCl 0.1 g，尿素 0.5 g，Mg(SO4)·7H2O 0.2 g，酵母膏 0.5 g，蒸餾水 1.0 L。調(diào)節(jié)pH至 7.2～7.5，在112 ℃下滅菌 30 min。

儀器：ZR4-6混凝攪拌儀，青島明博環(huán)保科技有限公司；721可見分光光度計，上海棱光技術(shù)有限公司；ALC-210.4電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；8037-SGS滅菌鍋，長春百奧；DH-9053A鼓風干燥箱，上海益恒實驗儀器有限公司；ZHWY-211B恒溫振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；ZHJH-1109超凈臺，上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.2實驗方法

生長曲線選用比濁法和干重法測定[6]。

(1)比濁法。產(chǎn)絮菌液體發(fā)酵33 h，每3 h取六個平行樣，其中三個平行樣經(jīng)無菌水適度稀釋，用分光光度計在600 nm波長下測吸光度。

(2)干重法。產(chǎn)絮菌液體發(fā)酵33 h，每3 h取六個平行樣，其中三個平行樣經(jīng)低溫離心，去除上清液，將沉淀干燥至恒重，用電子天平測其重量。

絮凝活性采用絮凝率來評價，使用混凝攪拌法[7]測定。

2　結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)絮菌的生長發(fā)酵及其絮凝活性

微生物絮凝劑作為產(chǎn)絮菌的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，其絮凝活性與產(chǎn)絮菌的生長情況有很強的關(guān)聯(lián)性，觀測產(chǎn)絮菌J-1在33 h內(nèi)的生長變化情況，結(jié)果見圖1。

圖1　產(chǎn)絮菌J-1的絮凝活性隨其生長狀態(tài)的變化

Fig.1Change of flocculation activity of J-1 with growth curves state

由圖1可知，在0～12 h，產(chǎn)絮菌J-1處于對數(shù)生長期，理論上，其絮凝率k應隨著菌體的快速生長而逐漸升高，但實際卻在0～6 h內(nèi)出現(xiàn)下降現(xiàn)象。這是由于絮凝劑液體培養(yǎng)基造成的誤差[8]?？瞻着囵B(yǎng)基具有一定的絮凝效果，隨著營養(yǎng)成分供菌體生長而消耗，絮凝率呈下降趨勢。6 h后隨著菌體生長接近最高值，開始不斷分泌代謝產(chǎn)物，絮凝率開始上升。12～27 h內(nèi)，產(chǎn)絮菌J-1處于穩(wěn)定期，菌體量保持穩(wěn)定狀態(tài)，代謝產(chǎn)物大量積累，在15 h時，菌量積累到最大值為2.05 g/L，絮凝率達到94.97%。21 h后產(chǎn)絮菌J-1處于穩(wěn)定期后期，培養(yǎng)基提供的營養(yǎng)不足以供給菌體生長，代謝產(chǎn)物的分泌呈減緩趨勢。27 h后，部分代謝產(chǎn)物被用來彌補培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的缺失，產(chǎn)絮菌J-1進入衰亡期，絮凝率繼續(xù)下降。綜上所述，絮凝率的變化趨勢符合產(chǎn)絮菌J-1的生長代謝規(guī)律。

為進一步驗證產(chǎn)絮菌J-1的絮凝活性與其生長代謝規(guī)律的關(guān)聯(lián)性，對發(fā)酵15 h的產(chǎn)絮菌J-1傳代培養(yǎng)10次，觀測其菌濁與絮凝率的變化，見圖2。

圖2　產(chǎn)絮菌J-1絮凝活性與菌濁的穩(wěn)定性

Fig.2Stability of flocculation activity and bacteria cloud for flocculating bacteria J-1

由圖2可知，傳代次數(shù)n為10，產(chǎn)絮菌J-1的絮凝率均保持在95%左右，其菌濁也保持在最高水平。這不僅驗證了產(chǎn)絮菌J-1的絮凝活性與其生長代謝規(guī)律的關(guān)聯(lián)性，同時證明了產(chǎn)絮菌J-1遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良。

2.2產(chǎn)絮菌的生長動力學模型

為更加科學、客觀地掌握產(chǎn)絮菌J-1生長變化的內(nèi)在規(guī)律，觀測其33 h內(nèi)的菌量變化規(guī)律，選擇Logistic方程建立產(chǎn)絮菌J-1的生長動力學模型[9]。

對Logistic方程積分計算后，得到：

(1)

式中：ρ0——初始生物量，g/L，產(chǎn)絮菌J-1的ρ0為0.28 g/L；

ρm——最大生物量，g/L，產(chǎn)絮菌J-1的ρm為2.05 g/L；

K——最大比生長速率，h-1；

t——時間，h；

Y——菌體干重，g/L。

將ρ0和ρm值代入式(1)：

(2)

產(chǎn)絮菌J-1的培養(yǎng)時間t為自變量，菌體干重Y為因變量，進行非線性擬合，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，Logistic方程基本可以反映產(chǎn)絮菌J-1的生長變化規(guī)律。衰亡期菌量的預測值低于實驗值，這是由于實驗中菌量的測定采取了菌體干重法，既有活菌又有死菌，而Logistic方程對菌量的預測值為活菌量。兩者平均殘差為0.008，擬合度R2為0.98。利用該擬合曲線，求得K值為0.441，代入式(2)，獲得產(chǎn)絮菌J-1的生長動力學模型：

(3)

圖3　生長動力學擬合曲線

產(chǎn)絮菌J-1的比生長速率0.441，高于實驗室已有的高效產(chǎn)絮菌的比生長速率0.253[10]，說明產(chǎn)絮菌J-1代時相對較短，為微生物絮凝劑的發(fā)酵節(jié)約了時間成本。

2.3產(chǎn)絮菌的產(chǎn)物生成動力學模型

圖1表明，產(chǎn)絮菌J-1的絮凝活性由其代謝產(chǎn)物確定，且穩(wěn)定期絮凝率最高，此時菌體生長也達到最高值，比生長速率減緩，菌體生長與產(chǎn)物形成屬于部分偶聯(lián)型，故選取Luedeking-Piret方程進行模擬[9]。

對Luedeking-Piret方程積分計算后，得到：

(4)

式中：α——產(chǎn)物生成常數(shù)(關(guān)聯(lián)菌體生長)；

β——產(chǎn)物生成常數(shù)(關(guān)聯(lián)菌體量);

P——產(chǎn)物生成量，g/L。

代入K值，有

(5)

產(chǎn)絮菌J-1的培養(yǎng)時間t為自變量，產(chǎn)物生成量P為因變量，進行非線性擬合，結(jié)果見圖4。

圖4　發(fā)酵動力學擬合曲線

由圖4可知，Luedeking-Piret方程可以較好地反映產(chǎn)絮菌J-1的代謝規(guī)律。代謝產(chǎn)物的實驗值與預測值的平均殘差為0.016，擬合度R2為0.97。利用該擬合曲線，求得α值為1.29，β值為-0.010，代入式(5)，得到產(chǎn)絮菌J-1的產(chǎn)物生成動力學模型：

(6)

當α≠0、β=0時，發(fā)酵類型屬于生長偶聯(lián)型；α=0、β≠0時，發(fā)酵類型屬于非生長偶聯(lián)型；α≠0、β≠0時，發(fā)酵類型屬于部分生長偶聯(lián)型。由式(6)可見，當α值越大，β值越小時，產(chǎn)物生成量越高。再次證明了產(chǎn)絮菌J-1發(fā)酵微生物絮凝劑的過程為部分偶聯(lián)型。

綜上所述，菌體生長與產(chǎn)物形成屬于部分偶聯(lián)型，所以產(chǎn)絮菌J-1代謝產(chǎn)物的生成與其菌體總量相關(guān)，而與菌體生長關(guān)聯(lián)較小。因此，在微生物絮凝劑大量合成前，若比生長速率較大，保證充足的營養(yǎng)和生物量，菌體快速繁殖，菌體總量大量積累，產(chǎn)絮菌J-1代謝產(chǎn)物的合成速率可以得到有效提高。

3　結(jié)　論

(1)產(chǎn)絮菌J-1絮凝活性的變化趨勢符合其生長代謝規(guī)律。當發(fā)酵時間為15 h時，即產(chǎn)絮菌J-1的穩(wěn)定期，絮凝活性最高為94.97%，且連續(xù)傳代10次，保持穩(wěn)定。

(2)利用Logistic方程模擬產(chǎn)絮菌J-1的生長變化規(guī)律。實驗中菌量測選值與Logistic方程預測值的平均殘差為0.008，根據(jù)生長動力學擬合曲線，求得K值為0.441，獲得產(chǎn)絮菌J-1生長動力學模型。

(3)利用Luedeking-Piret方程可以較好地反映產(chǎn)絮菌J-1的代謝規(guī)律。代謝產(chǎn)物實驗值與預測值的平均殘差為0.016，根據(jù)發(fā)酵動力學擬合曲線，獲得產(chǎn)絮菌J-1的產(chǎn)物生成動力學模型。

[1]易允燕,葉勁松,俞志敏,等.高效絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究[J].蚌埠學院學報,2016,5(1):21-26.

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[3]張海,曲睿娟,李日強.高效絮凝劑產(chǎn)生菌的分離選育及培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].山西農(nóng)業(yè)科學,2016,44(2):222-228.

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(編輯王冬)

Growth and fermentation kinetics model of bioflocculant producing strain J-1

XING Jie1,LI Lixin2,WANG Qiang1,MA Fang3

(1.Heilongjiang Provincial Research Institute of Environmental Sciences,Harbin 150056,China; 2.School of Environmental &Chemical Engineering,Heilongjiang University of Science &Technology,Harbin 150022,China; 3.State Key Laboratory of Urban Water Resource &Environment,Harbin Institute of Technology,Harbin 150090,China)

This paper is an attempt to improve the yield of microbial flocculants.The study starting with growth characteristics and flocculation activity of bioflocculant producing strain J-1 works towards the growth and fermentation kinetics of bioflocculant;and the law underlying the association between strain growth and product formation.This results in the growth kinetics model and product formation kinetics model of strain J-1.The results reveal that there is an association between the product formation of bioflocculant producing strain J-1 and the total amount of bacteria;an effective improvement in the synthesis rate of bioflocculant is possible with the presence of adequate nutrition and biomass;and the fermentation time of 15 h ensures the maximum flocculating rate of up to 94.97%.

bioflocculant;bioflocculant producing strain;growth kinetics;product formation kinetics

2016-04-25

水體污染控制與治理科技重大專項(2014ZX07201-012-01)；國家自然科學基金項目(51408200);哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項資金項目(2015RQQXJ015)

邢潔(1983-)，女，湖北省廣濟人，工程師，博士，研究方向：流域水環(huán)境，E-mail：18686885851@163.com。

10.3969/j.issn.2095-7262.2016.03.014

X703

2095-7262(2016)03-0300-04

A