郭睿 劉原君 鄭蕾 王生 魏世娟 劉全忠

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科

沙眼衣原體多形外膜蛋白PmpI的原核表達(dá)、純化、抗體制備及鑒定

郭睿 劉原君 鄭蕾 王生 魏世娟 劉全忠

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科

目的克隆、表達(dá)沙眼衣原體多形外膜蛋白I（Pmp I）基因，并進(jìn)行免疫原性鑒定，分析其生物學(xué)特征。方法用生物信息軟件分析沙眼衣原體多形外膜蛋白Pmp I的基因序列并預(yù)測(cè)PmpI蛋白的B細(xì)胞抗原表位。以D型沙眼衣原體DNA為模板，PCR擴(kuò)增PmpI基因N端90～1464堿基序列，構(gòu)建原核載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。Ni離子親合層析柱純化重組蛋白，制備Pmp I多克隆抗體并用Western印跡法檢測(cè)其免疫原性。結(jié)果對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和柔性區(qū)、氨基酸的親水性、抗原指數(shù)和表面可及性預(yù)測(cè)結(jié)果綜合分析，推測(cè)該蛋白含有8個(gè)優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位。PCR擴(kuò)增D型沙眼衣原體Pmp I基因核苷酸序列長(zhǎng)度為1 375 bp。成功構(gòu)建pET28a?PmpI原核表達(dá)重組體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)、親和層析純化后獲得了相對(duì)分子質(zhì)量為50 000的重組蛋白并制備其多克隆抗體。結(jié)論成功克隆并表達(dá)了D型沙眼衣原體多形外膜蛋白N?Pmp I，為研究該蛋白的生物學(xué)功能奠定了一定基礎(chǔ)。

沙眼衣原體；細(xì)菌外膜蛋白質(zhì)類；克隆，分子；多形外膜蛋白

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）是一種常見(jiàn)的性傳播疾病感染源，尤其在青少年人群中多發(fā)［1］，共分為15～19個(gè)主要血清型。多形外膜蛋白（polymorphicmembrane protein，Pmp）是衣原體特有的外膜蛋白，包含9個(gè)型（PmpA～I(xiàn)），功能可能與宿主細(xì)胞的粘附、自我轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)。Pmp蛋白具有與自我轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相似的3個(gè)功能區(qū)域，即N端信號(hào)肽、娩出域（passenger domain）和C端易位區(qū)（translocation unit）［2］。Pmp蛋白依賴包含多個(gè)保守的短重復(fù)4肽基序GGA（I，L，V）和FXXN的N端娩出域易位到細(xì)菌表面，因此此類蛋白可介導(dǎo)衣原體感染上皮或內(nèi)皮細(xì)胞［3］。本課題組與美國(guó)馬里蘭大學(xué)衣原體研究中心合作研究表明，CtPmp I可能是衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1粘附并結(jié)合到Ct表面的位點(diǎn)。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用生物信息學(xué)方法對(duì)Pmp I基因及其編碼蛋白的特性及B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，以D型Ct為對(duì)象，對(duì)CtPmp IN端進(jìn)行表達(dá)、純化及免疫原性研究，為進(jìn)一步了解噬菌體粘附Ct的機(jī)制及作用提供依據(jù)。

資料與方法

一、資料

1.基因序列號(hào)：19種血清型（A～K，Ba，Da，Ia，Ja，L1，L2，L2a，L3）Ct多形外膜蛋白I全長(zhǎng)基因序列基因庫(kù)登陸號(hào)分別為AY299427.1～AY299445.1，其氨基酸序列基因庫(kù)登陸號(hào)分別為AAQ74443.1～AAQ74461.1

2.菌株、質(zhì)粒、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：D型CtUW?3標(biāo)準(zhǔn)株由美國(guó)馬里蘭大學(xué)衣原體研究中心提供。質(zhì)粒pET?28a，菌株E.coliDH5α、BL21（DE3），EasyTaq擴(kuò)增酶，DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（全式金公司）。高保真擴(kuò)增酶I?5?（美國(guó)MCLab公司）。NdeⅠ、SalⅠ核酸內(nèi)切酶（美國(guó)Thermo公司）。T4DNA連接酶（日本Takara公司）。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（美國(guó)Axygen公司）。D36mm透析袋（截流范圍8 000～14 000，北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司）。His融合標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（His·Bind Purification Kit，德國(guó)Merck公司），實(shí)驗(yàn)用新西蘭大白兔購(gòu)自北京市海淀區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心［合格證號(hào)SCXK?（京）2011?0006］，研究單位動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（京）2011?0018。

二、方法

（一）CtPmp I基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析：

1.Pmp I同源家族成員多序列比對(duì)［4］：在基因庫(kù)中檢索出包含19種Ct不同血清型的PmpI全長(zhǎng)基因序列，并用Megalign軟件Cluster方法（參數(shù)選擇Default）進(jìn)行核酸序列比對(duì)分析。

2.信號(hào)肽預(yù)測(cè)：用SignalP?4.1 gram?predictions軟件，對(duì)19種Ct不同血清型Pmp I基因的氨基酸序列分別進(jìn)行信號(hào)肽分子的預(yù)測(cè)。

3.Pmp I氨基酸保守區(qū)預(yù)測(cè)：用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/預(yù)測(cè)氨基酸序列保守區(qū)，參數(shù)設(shè)置：Data source：CDSEARCH/cdd v3.14，E?Value cut?off：0.01。

4.Pmp I二級(jí)結(jié)構(gòu)及柔性區(qū)域預(yù)測(cè)［5?7］：用LaserGene軟件中的Protean程序，分別按Karplus?Schulz、Chou?Fasman和Garnier?Robson方案，分析Pmp I二級(jí)結(jié)構(gòu)中的柔性區(qū)域、轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲易形成區(qū)。

5.Pmp IB細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)［8?10］：用LaserGene軟件中的Protean程序，按Kyte?Doolittle方案預(yù)測(cè)Pmp I氨基酸的親水性，按Jameson?Wolf方案預(yù)測(cè)抗原指數(shù)，利用Emini方案預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的表面可及性。3種方案指數(shù)均較高的區(qū)域（親水性指數(shù)＞1.0；抗原指數(shù)＞1.5；表面可及性指數(shù)＞3.7）同時(shí)其內(nèi)部或附近又為柔性區(qū)，則B抗原表位很有可能位于或鄰近其區(qū)段。

（二）D型Ct多形外膜蛋白N?Pmp I的克隆、表達(dá)、純化及免疫原性鑒定：

1.引物設(shè)計(jì)與合成：根據(jù)基因庫(kù)提供的CtD型UW?3標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)mp I基因，通過(guò)軟件分析去除信號(hào)肽序列，擴(kuò)增N端90～1464堿基序列，共1 375個(gè)堿基。引物由上海捷瑞生物工程有限公司北京分公司合成，序列如下：上游引物P1（下劃線為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）5′?GGAATTCCATATGGAAACCGCCCTCCT CAC?3′，下游引物P2（下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn)）5′?ACGCGTCGACAGAAAGGTTAGGGGCGTGG?3′。

2.rpET28a?Pmp I重組質(zhì)粒的構(gòu)建：取50μl提純的Ct，按試劑盒說(shuō)明提取目的基因作為模板。模板1μl，引物各2μl，I?5?（高保真擴(kuò)增酶）25μl，滅菌蒸餾水20μl，共50μl體系作為PCR反應(yīng)體系，98℃2min預(yù)變性；98℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min為反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后切膠回收純化，操作步驟按Axygen膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)。將PCR產(chǎn)物純化后，用NdeⅠ、SalⅠ雙酶切，將酶切后的Pmp I基因在T4DNA連接酶作用下連接pET?28a載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒。反應(yīng)體系組成如下：10×T4緩沖液1μl，pET?28a 1μl，Pmp I基因7μl，T4 DNA連接酶1μl。反應(yīng)條件為22℃，2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株E.coliDH5α后，涂布于含卡那霉素抗性LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑單克隆于4ml卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜，次日抽提質(zhì)粒，NdeⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，基因片段大小正確的送北京金唯智公司測(cè)序。

3.pET28a?PmpI重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化：將測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3），涂卡那霉素抗性LB平板，放置于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化成功的單克隆菌落接種于10m l卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌過(guò)夜。次日將菌液加入400m l卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌培養(yǎng)至A600為0.5～0.8之間，加入終濃度0.5mmol/L的IPTG（異丙基?β?D?硫代半乳糖苷），37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)3 h，同時(shí)設(shè)未誘導(dǎo)組及陰性對(duì)照組。收集菌體后加入PBS重懸并加入終質(zhì)量濃度為4 g/L的溶菌酶與終濃度3%的Triton?X?100（聚乙二醇辛基苯基醚），冰育15min。超聲碎菌后低溫離心，收集上清液與沉淀分別SDS?PAGE凝膠電泳。用His融合標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，步驟按說(shuō)明書(shū)操作，純化后進(jìn)行SDS?PAGE凝膠電泳鑒定。將上述收集的純化蛋白裝入D36mm透析袋中，4℃下透析到Tris?NaCl緩沖液（50mmol/L Tris，150mmol/LNaCl，4mmol/LGSH，0.4mmol/LGSSG，0.4mol/L L?精氨酸，2 mmol/L EDTA，pH 8.0）中復(fù)性約24 h后，將蛋白最終透析于儲(chǔ)存液0.01mol/L PBS（pH7.2～7.4）6～8 h。結(jié)束后，上清液用0.22μm濾器過(guò)濾后分裝，將復(fù)性蛋白進(jìn)行定量后將其凍存至-80℃。

4.兔抗Pmp I多克隆抗體的制備、純化及其鑒定：以此純化復(fù)性后蛋白為抗原，加弗氏佐劑免疫2只新西蘭兔，各取1m l血清進(jìn)行Protein G純化，并且通過(guò)BCA蛋白定量法測(cè)定抗體濃度，ELISA檢測(cè)新西蘭白兔的免疫滴度，并通過(guò)Western印跡鑒定免疫原性。

結(jié)果

一、CtPmp I基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

1.Pmp I基因序列的比對(duì)分析：經(jīng)Cluster方法比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Ct各型Pmp I基因非常保守，序列間的一致性在99.0%以上?；诖私Y(jié)果，本研究選取D型Ct Pmp I蛋白的氨基酸序列作為B抗原表位預(yù)測(cè)分析對(duì)象。D型Pmp I氨基酸序列登陸號(hào)為AAQ74447.1。

2.信號(hào)肽預(yù)測(cè)：鑒于上述多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，同源序列間的相似性極高，而且前25個(gè)氨基酸完全一致。經(jīng)過(guò)所有19個(gè)血清型PmpI氨基酸序列的信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析，結(jié)果均為N端前25個(gè)氨基酸為預(yù)測(cè)信號(hào)肽區(qū)域，其序列為MRPDHMNFCCLCAAILSSTAVLFGQ。

3.蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)：由于19種血清型Ct Pmp I蛋白序列的高度保守性，其氨基酸保守區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果是一致的。通過(guò)NCBI網(wǎng)站預(yù)測(cè)到Pmp I蛋白的C端易位區(qū)可能位于607～878氨基酸。

4.Pmp I二級(jí)結(jié)構(gòu)及其柔性區(qū)域預(yù)測(cè)：綜合分析Pmp I蛋白娩出域（除信號(hào)肽和C端易位區(qū)）的二級(jí)結(jié)構(gòu)柔性區(qū)，位于N端的26～28、37～39、73～74、111～114、117、124～126、132～135、145～148、170～176、187～189、202～204、215～216、225～226、228～231、240～243、279～280、287～301、308、316～319、321～322、346～347、359～362、366、368、376～379、390～391、399、410、438～441、443、496～499、514、531～533、542～544、551～553、564～566、571～572、585～587。

5.Pmp IB細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)：Pmp I娩出域中極有可能的B抗原表位區(qū)段位于N端的26～29、36～39、110～118、120～128、131～136、170～177、228～229、239～246。

二、D型Ct多形外膜蛋白N?PmpI的克隆、表達(dá)、純化及免疫原性鑒定

圖1 Pmp I基因PCR擴(kuò)增結(jié)果M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

1.Pmp I基因擴(kuò)增：取5μl PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳，在約1 500 bp位置可見(jiàn)一明顯特異性條帶，片段大小與預(yù)期一致（圖1）。

2.pET28a?Pmp I重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NdeⅠ、SalⅠ雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，pET28a?Pmp I重組質(zhì)粒被酶切為約1 500 bp和5 500 bp兩個(gè)片段（圖2），證明

圖2重組質(zhì)粒pET28a?Pmp INdeⅠ、SalⅠ雙酶切驗(yàn)證結(jié)果M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：pET28a?PmpI重組質(zhì)粒雙酶切重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定分析并與基因庫(kù)中Ct D型UW?3標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)mp I基因N端序列（90～1 464 bp）（登陸號(hào)：AY299431.1）對(duì)比分析表明，插入的Pmp I基因片段沒(méi)有堿基缺失、突變，插入方向及讀碼框均正確無(wú)誤，說(shuō)明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

3.重組蛋白的表達(dá)、純化：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）表達(dá)宿主菌，挑選陽(yáng)性重組菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)SDS?PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)其表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量50 000處有一特異性條帶，與蛋白預(yù)期相對(duì)分子量大小相符，而誘導(dǎo)前無(wú)此條帶，說(shuō)明重組工程菌株構(gòu)建成功。誘導(dǎo)溫度37℃，時(shí)間為3 h時(shí)蛋白表達(dá)量最大，且表達(dá)的重組蛋白N?Pmp I主要以包涵體形式存在于沉淀中（圖3、4）。將純化的包涵體蛋白透析復(fù)性后采用BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度為1.2 g/L。

4.重組蛋白多克隆抗體鑒定及濃度測(cè)定：Western印跡結(jié)果顯示，兔抗Pmp I多克隆抗體可特異性結(jié)合重組Pmp I蛋白，而不識(shí)別對(duì)照組BSA蛋白（圖5）。ELISA結(jié)果顯示，此多克隆抗體滴度為1∶100 000。經(jīng)測(cè)定，此多抗?jié)舛葹?.7 g/L。

圖3重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21（DE3）中0.5 mmol/L IPTG不同時(shí)間、溫度誘導(dǎo)表達(dá)的SDS?PAGE結(jié)果M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：未誘導(dǎo)對(duì)照；2：37℃誘導(dǎo)3h；3：15℃誘導(dǎo)過(guò)夜；4：28℃誘導(dǎo)過(guò)夜

討論

蛋白質(zhì)具有許多功能，對(duì)于這些功能的預(yù)測(cè)仍然是生物物理學(xué)與生物信息學(xué)的主要挑戰(zhàn)之一。隨著新技術(shù)的進(jìn)步，X射線晶體衍射、核磁共振NMR技術(shù)以及冷凍電子顯微鏡技術(shù)等為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能解析提供了廣闊的平臺(tái)。但由于X線衍射與NMR均存在樣品純度與分子量大小、分辨率等局限，使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)應(yīng)運(yùn)而生，并逐步成為結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。在蛋白相應(yīng)晶體結(jié)構(gòu)尚不明晰的情況下，通過(guò)生物信息工具分析二級(jí)結(jié)構(gòu)及抗原表位，推測(cè)蛋白功能，逐漸成為蛋白功能學(xué)研究的有效手段。本實(shí)驗(yàn)成功預(yù)測(cè)了PmpI蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)及B抗原表位，分析序列中蘊(yùn)含的結(jié)構(gòu)功能信息，將會(huì)推動(dòng)衣原體Pmp蛋白相關(guān)功能學(xué)研究的進(jìn)展。

Ct的PmpA～I(xiàn)蛋白氨基酸序列及相對(duì)分子質(zhì)量都不相同，表現(xiàn)為多形性，其平均遺傳距離在0.1%（PmpA）～7%（PmpF）之間。Gomes等［11］推測(cè)，pmp基因在結(jié)構(gòu)或功能上的此種變化會(huì)促進(jìn)抗原及粘附受體多樣性，可能與衣原體免疫逃逸和不同組織嗜性相關(guān)。近年研究顯示，Pmp蛋白可能在誘導(dǎo)機(jī)體CD4＋T細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性免疫的過(guò)程中發(fā)揮重要作用［12］，從而成為衣原體疫苗的研究方向。Tanzer和Hatch［13］研究表明，所有的Pmp蛋白在Ct感染后2 h均開(kāi)始表達(dá)，感染12 h后表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，此與網(wǎng)狀體發(fā)育時(shí)間一致，表達(dá)量在36 h達(dá)到最高峰，其中PmpF蛋白表達(dá)量最高。Stothard等［14］通過(guò)DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在9種Pmp蛋白中，Pmp I基因序列最為保守，在15種Ct的血清型中只有不超過(guò)1%的Pmp I基因序列有所不同。本實(shí)驗(yàn)Pmp I同源家族成員多序列比對(duì)與此結(jié)論接近。氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)高度保守的蛋白一般能穩(wěn)定遺傳且難以替代，因此推測(cè)此高度保守的Pmp I基因所編碼Pmp I蛋白

圖4重組N?Pmp I蛋白包涵體純化結(jié)果M：標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：8 mol/L尿素溶解離心后上清液；2：8 mol/L尿素溶解上清液同IDAHis·Bind樹(shù)脂孵育后流出液；3～9：不同咪唑濃度（50、100、200、400、600、800、1 000mmol/L）的蛋白洗脫液（目的蛋白）

圖5重組蛋白多克隆抗體的Western印跡檢測(cè)結(jié)果1：未純化的PmpI蛋白；2：純化的Pmp I蛋白；3：對(duì)照組BSA蛋白可能具有重要功能。

劉原君等［15］通過(guò)Far?Western印跡技術(shù)研究證實(shí)，衣原體噬菌體phiCPGl衣殼蛋白Vp1能特異結(jié)合D型Ct標(biāo)準(zhǔn)株的外膜蛋白Pmp I，而不結(jié)合其他多形外膜蛋白（PmpA～H）及主要外膜蛋白（MOMP蛋白）。因此提出，Vp1蛋白可能通過(guò)與Ct外膜蛋白Pmp I結(jié)合從而特異性地與Ct結(jié)合發(fā)揮其功能。通過(guò)研究Pmp I蛋白的自我轉(zhuǎn)運(yùn)與孔道形成機(jī)制以及Pmp I蛋白粘附噬菌體前后的構(gòu)象改變，將會(huì)促進(jìn)對(duì)衣原體噬菌體作用機(jī)制的探究，有望使噬菌體治療成為解決難治性衣原體感染的有效手段。

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第八屆泛亞太皮膚屏障功能研究學(xué)會(huì)年會(huì)通知

第八屆泛亞太皮膚屏障功能研究學(xué)會(huì)年會(huì)定于2017年4月26日與美國(guó)皮膚研究學(xué)會(huì)（SID）年會(huì)同期召開(kāi)。會(huì)議地點(diǎn)是Oregon Convention Center，777NEMartin Luther King Jr Blvd.Portland,Oregon 97232，United States。

一、投稿要求

①投稿內(nèi)容：沒(méi)正式發(fā)表過(guò)、與表皮通透屏障功能相關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究論文；②投稿方式：按SID會(huì)議要求寫(xiě)英文摘要（https://sidnet.site?ym.com/page/AnnualMeeting），請(qǐng)投稿至Joan.wakefield@va.gov，收件人Ms.JoanWakefield。截稿日期2017年1月4日；③會(huì)議交流形式：特邀講演、大會(huì)發(fā)言、壁報(bào)交流。

二、會(huì)議注冊(cè)

如果您注冊(cè)參加SID會(huì)議可以免費(fèi)參加本次會(huì)議，否則現(xiàn)場(chǎng)支付注冊(cè)費(fèi)，每位50美元，學(xué)生和住院醫(yī)師每位25美元。

聯(lián)系人：Ms.Joan Wakefield（Joan.wakefield@va.gov），蔄茂強(qiáng)（mqman@hotmail.com）。有關(guān)會(huì)議其他事宜可查詢https://sidnet.siteym.com/page/AnnualMeeting和中華皮膚科雜志網(wǎng)站https://www.pifukezazhi.com的通知欄目。注冊(cè)表請(qǐng)用英文填寫(xiě)，內(nèi)容包括姓名、職位、Email、工作單位、提交論文題目、是否注冊(cè)SID會(huì)議、會(huì)議交流形式是口頭發(fā)言還是壁報(bào)交流。

Polym orphic m embrane protein I ofChlamydia trachomatis:prokaryotic expression,purification,antibody preparation and identification

Guo Rui,Liu Yuanjun,Zheng Lei,Wang Sheng,WeiShijuan,Liu Quanzhong

DepartmentofDermatology and Venereology,Tianjin MedicalUniversity GeneralHospital,Tianjin 300052,China

Liu Quanzhong,Email:liuquanzhong@medmail.com.cn

Objective To clone and express the polymorphicmembrane protein I（Pmp I）gene ofChlamydia trachomatis（Ct）,and to assess the immunogenicity and biological characteristics of PmpI.M ethods A bioinformatic software was used to analyze the sequence of the PmpIgene of Ct,and to predict B cell epitopes in PmpI.With Ct serovar DDNA as the template,PCRwas performed to amplify the N?terminal region（from position 90 to 1464）of the PmpIgene,whichwas cloned into a prokaryotic expression vector pET28a to express the recombinant protein Pmp I.A Ni?ion affinity chromatography column was used to purify the recombinant protein,which was used to immunize New Zealand rabbits for preparation of polyclonal antibodies.Western blot analysis was conducted to evaluate the immunogenicity of this protein.Results A comprehensive analysis was carried out on the secondary structure,flexible regions,hydrophilicity plot,antigenic index and surface probability plot of the protein,which suggested that PmpIhad 8 dominant B?cell epitopes.The product of PCR targeting the Pmp Igene of Ct serovar D showed a total length of1375 bp.The recombinantprokaryoticexpression vectorpET28a?PmpIwassuccessfullyconstructed.A recombi?nantproteinwith a relativemolecularmassof approximately 50 000 was successfully expressed after isopropylβ?d?1?thiogalactopyranoside（IPTG）induction,and purified by affinity chromatography.Polyclonal antibodies against the recombinant protein were successfully prepared.Conclusion The N?Pmp I protein of Ct serovar D is cloned and expressed successfully,layinga foundation for further studieson itsbiological functions.

Chlamydia trachomatis;Bacterial outer membrane proteins;Cloning,molecular;Polymorphic membrane protein

劉全忠，Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.11.010

國(guó)家自然科學(xué)基金（31370211）

Fund program:NationalNatural Science Foundation ofChina（31370211）

2016?04?08）

（本文編輯：吳曉初）