王光平 倪娜娜 周曉偉 楊瑩 宋昊 溫斯健 陳浩 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所病理科

早期蕈樣肉芽腫微小RNA表達(dá)譜的研究

王光平 倪娜娜 周曉偉 楊瑩 宋昊 溫斯健 陳浩 徐秀蓮 孫建方

210042南京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所病理科

目的篩選與早期蕈樣肉芽腫（MF）相關(guān)的微小RNA（miRNA）。方法用高通量miRNA PCR芯片檢測(cè)6例早期MF與6例濕疹和扁平苔蘚皮損中miRNA的表達(dá)差異。針對(duì)差異表達(dá)的miRNA，進(jìn)行13例早期MF、13例濕疹和扁平苔蘚皮損組織及Myla細(xì)胞株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT?qPCR）驗(yàn)證。結(jié)果芯片結(jié)果示，相對(duì)于對(duì)照組，早期MF hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p顯著高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。皮損組織的RT?qPCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果一致。與正常人外周血T淋巴細(xì)胞相比，Myla細(xì)胞株中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107顯著上調(diào)，與芯片結(jié)果一致；未見(jiàn)hsa?miR?302c?3p的差異性表達(dá)。結(jié)論與炎癥性皮膚病相比，早期MF存在差異表達(dá)的miRNA表達(dá)譜。

微小RNAs；芯片分析技術(shù)；基因表達(dá)；蕈樣肉芽腫

蕈樣肉芽腫（mycosis fungoides，MF）發(fā)病機(jī)制尚不明確。經(jīng)典的MF呈惰性進(jìn)展，經(jīng)過(guò)斑片期、斑塊期，最終發(fā)展為腫瘤期，生存期可長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年。微小RNA（miRNA）是22個(gè)核苷酸非編碼RNA，通過(guò)與靶信使RNA互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖、分化和凋亡等過(guò)程［1］。我們應(yīng)用高通量miRNA PCR芯片技術(shù)，對(duì)6例早期MF的臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，篩選出顯著差異表達(dá)的miRNA，并進(jìn)行臨床標(biāo)本及CTCL細(xì)胞株的RT?qPCR驗(yàn)證。

資料與方法

一、臨床資料

1.臨床標(biāo)本：2014年11月至2015年11月，就診于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院皮膚科的早期MF及炎癥性皮膚?。詽裾罨虮馄教μ\）患者的皮損組織。根據(jù)表1的臨床、病理、免疫組化、基因重排4項(xiàng)中有≥2項(xiàng)，且得分總和≥4分，并排除淋巴結(jié)、血液、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，診斷為早期MF［2］，相當(dāng)于腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（tumor nodemetastasis，TNM）分期中ⅠA～ⅡA期。對(duì)照組為臨床診斷為慢性濕疹或扁平苔蘚的患者，組織病理表現(xiàn)為以淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的慢性皮炎或苔蘚樣皮炎。早期MF及濕疹、扁平苔蘚的診斷均由皮膚科醫(yī)生及病理科醫(yī)生共同確定。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

表1 早期蕈樣肉芽腫的診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］

6例早期MF及6例炎癥性皮膚病的皮損組織用于miRNA PCR芯片檢測(cè)。6例早期MF患者均為男性，年齡26～62歲，平均43.5歲；TNM分期ⅠA期1例，ⅠB期5例。對(duì)照組慢性濕疹和扁平苔蘚各3例，男5例，女1例，年齡45～82歲，平均60.5歲。另取早期MF及對(duì)照組（濕疹、扁平苔蘚）的皮損組織各7例，加上芯片所用的標(biāo)本兩組各13例用于RT?qPCR驗(yàn)證。早期MF組，男10例，女3例，年齡13～80歲，平均43.2歲；TNM分期ⅠA期2例、ⅠB期9例、ⅡA期2例。對(duì)照組慢性濕疹7例，扁平苔蘚6例；男9例，女4例，年齡12～82歲，平均49歲。

2.細(xì)胞來(lái)源：Myla細(xì)胞株由北京協(xié)和醫(yī)院皮膚科惠贈(zèng)。正常人淋巴細(xì)胞的制備：抽取健康志愿者外周血40m l，按照人外周血淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，再根據(jù)德國(guó)MiltenyiBiotec公司生產(chǎn)的CD3磁珠分選法獲得正常T淋巴細(xì)胞。

二、主要試劑

高通量miRNA PCR芯片檢測(cè)在上海啟因生物科技有限公司進(jìn)行，相關(guān)試劑由該公司實(shí)驗(yàn)室提供。hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?302c?3p、hsa?miR?107、U6引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo Scientific公司），Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），SYBR green Master Mix（High ROX Premixed）（南京諾唯贊生物科技有限公司），人外周血淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），CD3磁珠（德國(guó)MiltenyiBiotec公司）。

三、方法

1.RNA提取及檢測(cè)：將皮損標(biāo)本加入1 m l Trizol，置于-80℃冰箱儲(chǔ)存。研磨組織后，采用Trizol法提取組織總RNA，于分光光度計(jì)260、280 nm分別測(cè)定吸光度A值，檢測(cè)RNA濃度，變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)RNA純度及完整性。

2.高通量miRNA PCR芯片：用E.colipoly A為成熟的miRNA序列的3′端添加Poly A尾；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR（qPCR）。根據(jù)qPCR反應(yīng)曲線得到各樣本目的基因和內(nèi)參照Ct值（閾值循環(huán)數(shù)），采用△Ct進(jìn)行相對(duì)定量。△Ct=目的基因Ct值-同組內(nèi)參照Ct值，將兩組樣品的△Ct相除為表達(dá)倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C），再取2的對(duì)數(shù)即為log2FC，正值表示上調(diào)，負(fù)值表示下調(diào)。

3.RT?qPCR驗(yàn)證：Trizol法分別提取新鮮皮損組織、Myla細(xì)胞、正常人外周血T淋巴細(xì)胞的總RNA。設(shè)計(jì)需驗(yàn)證的miRNA及內(nèi)參U6的引物（表2），反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再用SYBR green染料法進(jìn)行RT?qPCR，反應(yīng)程序：95℃3min預(yù)變性1個(gè)循環(huán)；95℃、30 s變性和62℃、40 s共40個(gè)循環(huán)，最后熔解曲線分析判定PCR反應(yīng)的特異性?！鰿t=目的基因Ct值-同組內(nèi)參Ct值，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct。以對(duì)照組目的基因表達(dá)量為1，2?△△Ct即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對(duì)照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

表2 miRNA引物序列

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：高通量miRNA PCR芯片用R語(yǔ)言，通過(guò)limma分析后進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT?PCR驗(yàn)證的結(jié)果用Graphpad Prism統(tǒng)計(jì)軟件，兩組之間的差異比較采用Mann?Whitney檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、總RNA提取結(jié)果

各組總RNA的提取量2～30μg，平均9.6μg。A值1.72～2.04，平均1.96，說(shuō)明總RNA的提取量足夠，蛋白和核酸的污染很少，總RNA的提取質(zhì)量較高。變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)28S、18SRNA條帶比值≥1.5，表明RNA純度及完整性較好。

二、高通量miRNA PCR芯片結(jié)果

高通量miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。3個(gè)miRNA差異表達(dá)最顯著：hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p均表達(dá)上調(diào)，早期MF組較對(duì)照組的表達(dá)差異log2FC分別為7.93、3.57、3.08，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.019、0.046、0.029）。

三、組織標(biāo)本的RT?qPCR驗(yàn)證結(jié)果

溫度曲線、熔解曲線和電泳結(jié)果顯示，反應(yīng)過(guò)程順利，特異性良好，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，表明RT?qPCR結(jié)果可靠。驗(yàn)證結(jié)果（表3）顯示，早期MF組較對(duì)照組hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p均表達(dá)上調(diào)，與芯片結(jié)果一致，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1高通量miRNA PCR芯片結(jié)果火山圖橫坐標(biāo)為早期蕈樣肉芽腫組較對(duì)照組，每個(gè)miRNA表達(dá)倍數(shù)取2的對(duì)數(shù)（log2），值＜0，表達(dá)下調(diào)，越靠左，差異越顯著；橫坐標(biāo)值＞0，表達(dá)上調(diào)，越靠右，差異越顯著。縱坐標(biāo)為P值取-log10，越靠上，P值越小

表3 早期MF組和對(duì)照組組織標(biāo)本中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對(duì)表達(dá)量（2?△△Ct，±s）

表3 早期MF組和對(duì)照組組織標(biāo)本中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對(duì)表達(dá)量（2?△△Ct，±s）

注：MF：蕈樣肉芽腫。早期MF組和對(duì)照組各13例

組別早期MF組對(duì)照組P值hsa?miR?378a?5p 70.00±19.42 34.70±10.46 0.018 hsa?miR?107 14.09±5.90 2.48±0.80 0.004 hsa?miR?302c?3p 35.91±111.45 5.85±3.28 0.001

四、Myla細(xì)胞株的RT?qPCR驗(yàn)證結(jié)果

溫度曲線、熔解曲線和電泳結(jié)果顯示，反應(yīng)過(guò)程順利，特異性良好，沒(méi)有非特異性擴(kuò)增，表明RT?qPCR結(jié)果可靠。經(jīng)Mann?Whitney檢驗(yàn)，與正常T淋巴細(xì)胞比較，Myla細(xì)胞株中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107顯著上調(diào)，與芯片結(jié)果一致（P＜0.05）；hsa?miR?302c?3p無(wú)差異性表達(dá)（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

討論

miRNA是一類長(zhǎng)22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，并參與細(xì)胞分化、增殖、代謝及凋亡等幾乎所有生命活動(dòng)。目前收錄在mirBase數(shù)據(jù)庫(kù)（http://mirbase.org/）中的人類前體miRNA有1 881種、成熟miRNA2 588種。MF的早期皮損表現(xiàn)多種多樣，易被誤診而延誤治療。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA的功能失調(diào)對(duì)很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷及判斷預(yù)后起關(guān)鍵作用。

本研究用較新高通量miRNA PCR芯片，以良性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主的炎癥性皮膚?。裾睢⒈馄教μ\）為對(duì)照，hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p顯著高表達(dá)，相對(duì)差異倍數(shù)（log2FC）分別為7.93、3.57、3.08倍。進(jìn)一步收集新鮮組織及MF細(xì)胞株Myla進(jìn)行RT?qPCR驗(yàn)證，證實(shí)了hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107均高表達(dá)，同芯片結(jié)果一致。而hsa?miR?302c?3p在MF組織中顯著高表達(dá)，在Myla細(xì)胞株中則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2014年，Ralfkiaer等［3］用miRNA PCR芯片技術(shù)（含742個(gè)miRNA），以特應(yīng)性皮炎皮損為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)38個(gè)miRNA在T1期MF（斑片或斑塊占體表面積＜10%）中顯著差異性表達(dá)，而hsa?miR?302c上調(diào)表達(dá)的差異倍數(shù)最高；相對(duì)于T2期MF（斑片或斑塊占體表面積＞10%），36個(gè)miRNA在早期MF中顯著差異性表達(dá)，包含hsa?miR?107顯著性表達(dá)上調(diào)；相對(duì)于T3期（存在腫瘤性皮損）、T4期（紅皮?。㎝F和未定類原發(fā)性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤，26個(gè)miRNA顯著差異性表達(dá)，其中包括hsa?miR?378顯著性表達(dá)上調(diào)。另有文獻(xiàn)證實(shí)hsa?miR?107在腫瘤期MF中表達(dá)上調(diào)［4］。本研究檢測(cè)結(jié)果表明，早期MF組織hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p均表達(dá)上調(diào)。與國(guó)外文獻(xiàn)結(jié)果的差異，可能與人種差異和個(gè)體差異有關(guān)。

表4 Myla細(xì)胞株及正常T淋巴細(xì)胞中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對(duì)表達(dá)量（2?△△Ct，±s）

表4 Myla細(xì)胞株及正常T淋巴細(xì)胞中hsa?miR?378a?5p、hsa?miR?107、hsa?miR?302c?3p的相對(duì)表達(dá)量（2?△△Ct，±s）

注：n=3

組別Myla細(xì)胞株正常T淋巴細(xì)胞P值hsa?miR?378a?5p 93.62±23.42 2.80±1.39 0.029 hsa?miR?107 15.41±5.97 1.10±0.68 0.029 hsa?miR?302c?3p 1.14±0.31 0.76±0.24 0.686

檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，未檢索到上述3個(gè)差異表達(dá)的miRNA在MF發(fā)病機(jī)制中的研究文獻(xiàn)。Hsa?miR?378a?5p位于5號(hào)染色體，在惡性膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、非小細(xì)胞肺癌中具有一定的促癌作用［5?7］。Hsa?miR?107位于10號(hào)染色體，對(duì)肝癌、胃癌等可能具促癌作用［7?9］，對(duì)非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等具有預(yù)后價(jià)值［10?11］。Hsa?miR?302c?3p位于14號(hào)染色體，在生殖細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌等高表達(dá)［12?13］。

該研究的不足之處在于病例數(shù)偏少、miRNA PCR芯片包含的檢測(cè)miRNA有限。本結(jié)果為miRNA在早期MF發(fā)病中的分子機(jī)制研究提供了線索，對(duì)篩選出的差異miRNA進(jìn)行細(xì)胞和動(dòng)物層面的生物學(xué)行為分析和功能研究將是今后要開展的工作。

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2017中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)征文通知

經(jīng)中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)批準(zhǔn)，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)皮膚性病專業(yè)委員會(huì)定于2017年4月20-24日在珠海維景國(guó)際大酒店召開中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)。此次會(huì)議將發(fā)揚(yáng)歷次年會(huì)的優(yōu)良傳統(tǒng)，注重中西醫(yī)結(jié)合治療皮膚病的新方法及新的研究進(jìn)展等方面的學(xué)術(shù)交流，內(nèi)容密切聯(lián)系臨床，切合皮膚科醫(yī)師的實(shí)際需求，會(huì)議將邀請(qǐng)知名專家做特邀演講，闡述皮膚科相關(guān)領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，創(chuàng)造形式多樣、內(nèi)容充實(shí)、緊張熱烈、活躍互動(dòng)的學(xué)術(shù)交流形式，達(dá)到全國(guó)皮膚科中醫(yī)、西醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師共同展現(xiàn)才華、獲取知識(shí)和信息、增進(jìn)友誼的目的，欲參加會(huì)議者請(qǐng)仔細(xì)閱讀通知并在規(guī)定的時(shí)間按要求投稿。

一、投稿要求：①投稿內(nèi)容：皮膚科基礎(chǔ)研究論文、皮膚科臨床診斷和治療等方面的論文、典型與疑難病例等；②投稿方式：中文全文和400字以內(nèi)的中文摘要，請(qǐng)通過(guò)電子郵件投稿，Email：pfkxh@126.com。來(lái)稿請(qǐng)注明2017會(huì)議征文，截稿日期：2017年3月1日；③會(huì)議交流形式：特邀講演、大會(huì)發(fā)言、分會(huì)發(fā)言、書面交流。

二、聯(lián)系方式：上海市黃浦區(qū)成都北路500號(hào)峻嶺廣場(chǎng)19樓1908室，上海長(zhǎng)征醫(yī)院《中國(guó)真菌學(xué)雜志》編輯部，郵編：200003，Email：pfkxh@126.com，聯(lián)系人：施慧，021-81885497，手機(jī)：13764560811。

M icroRNA expression profiles in earlym ycosis fungoides

Wang Guangping,NiNana,Zhou Xiaowei,Yang Ying,Song Hao,Wen Sijian,Chen Hao,Xu Xiulian,Sun Jianfang

Department of Pathology,Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Xu Xiulian,Email:xxlqjl@sina.com.cn;Sun Jianfang,Email:fangmin5758@aliyun.com

Objective To screenmicroRNAs（miRNAs）related to earlymycosis fungoides（MF）.Methods A high?throughputmiRNA PCR array was used to determinemiRNA expression profiles in skin lesions of 6 patients with early MF（early MF group）and 6 patients with lichen planus（control group）,followed by screening of differentially expressedmiRNAs between the two groups.Then,real?time fluorescence?based quantitative PCR（RT?qPCR）was performed to verify the differentially expressed miRNAs in lesional specimens from 13 patientswith early MF and 13 patientswith eczema or lichen planus,aswell as in Myla cells and normal human T?lymphocytes.Results The high?throughputmiRNA PCR array showed that the expressions ofhsa?miR?378a?5p,hsa?miR?107 and hsa?miR?302c?3p were significantly higher in the early MF group than in the control group（allP＜0.05）.For skin lesions,the results from RT?qPCR were similar to those from themiRNA array assay.Compared with normal human peripheral blood T?lymphocytes,Myla cells showed significantly increased expressions of hsa?miR?378a?5p and hsa?miR?107,which was consistentwith the results from themiRNA array assay.However,no significant differencewas observed in the expression of hsa?miR?302c?3p between the two kinds of cells.Conclusion MiRNA expression profiles in early MFare different from those in inflammatory skin diseases.

MicroRNAs;Microchip analyticalprocedures;Gene expression;Mycosis fungoides

徐秀蓮，Email：xxlqjl@sina.com.cn；孫建方，Email：fangmin5758@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.11.06

國(guó)家自然科學(xué)基金（81272992）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK2012505）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新基金（2014?10023?1002?3010）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81272992）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012505）;Innovation Fund of Chinese Academy ofMedical Sciences and Peking Union MedicalCollege（2014?10023?1002?3010）

2016?04?08）

（本文編輯：吳曉初）