唐輝 閆洪濤 陳年 楊航 楊桂紅 伍津津

400042重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科

不同灌注流速對復(fù)方殼多糖組織工程真皮生長代謝的影響

唐輝 閆洪濤 陳年 楊航 楊桂紅 伍津津

400042重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院皮膚科

目的探討三維動態(tài)培養(yǎng)條件下不同灌注流速對復(fù)方殼多糖組織工程真皮生長代謝的影響。方法 將人真皮成纖維細(xì)胞（HDF）以2×104/ml的終濃度接種到復(fù)方殼多糖膠原凝膠中，采用自制的灌注培養(yǎng)裝置，培養(yǎng)基分別以50、100和200 ml/min的流速灌注培養(yǎng)12 d，以靜態(tài)培養(yǎng)為對照。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，MTT法檢測細(xì)胞活力，葡萄糖及乳酸測試盒檢測細(xì)胞代謝特性，HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)和分布，羥脯氨酸測試盒檢測膠原合成，同時(shí)用改進(jìn)后的高敏度小張力膜狀生物材料力學(xué)檢測裝置檢測最大抗張強(qiáng)度。統(tǒng)計(jì)分析采用重復(fù)測量方差分析、單因素方差分析及LSD?t檢驗(yàn)。結(jié)果灌注組細(xì)胞比對照組更密集，第8天時(shí)100 ml/min灌注組細(xì)胞幾乎全部融合成片，200 ml/min灌注組細(xì)胞約達(dá)80%融合，且有沿培養(yǎng)基流動方向生長的趨勢。MTT結(jié)果顯示，4組細(xì)胞增殖活性（A值）都隨培養(yǎng)時(shí)間的延長先持續(xù)上升后逐漸下降（P＜0.05），其中灌注組的細(xì)胞增殖活性均明顯高于對照組，100 ml/min灌注組的最大細(xì)胞增殖活性是對照組的1.67倍，且顯著高于其他組（均P＜0.05）。各組培養(yǎng)基中葡萄糖含量隨培養(yǎng)時(shí)間延長均下降（P＜0.05），第12天時(shí)100 ml/min灌注組的葡萄糖含量（1.604±0.038 mmol/L）顯著低于對照組（2.205±0.020 mmol/L）、50 ml/min灌注組（1.939±0.037 mmol/L）及200 ml/min灌注組（2.047±0.039 mmol/L），均P＜0.05。各組乳酸含量隨時(shí)間變化的趨勢與葡萄糖含量的變化相反，均緩慢上升（P＜0.05），但其最大值對真皮內(nèi)HDF影響不明顯。培養(yǎng)第12天，100 ml/min灌注組的羥脯氨酸含量及最大抗張強(qiáng)度均顯著高于其余3組，且組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=61.512、694.216，均P＜0.05）。培養(yǎng)第6、10天，灌注培養(yǎng)條件下細(xì)胞在支架中的分布比靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)均勻，胞核較大、長，且灌注組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組（均P＜0.05），其中100 ml/min灌注組的細(xì)胞數(shù)量最多，顯著高于其他灌注組（均P＜0.05）。結(jié)論 100 ml/min的灌注流速更適合培養(yǎng)復(fù)方殼多糖組織工程真皮，此流速下的細(xì)胞活力、細(xì)胞分布、代謝速度、膠原合成及最大抗張強(qiáng)度都優(yōu)于其他組。

殼多糖；組織工程；培養(yǎng)技術(shù)；成纖維細(xì)胞

組織工程皮膚作為最早應(yīng)用于臨床的工程化組織，為急性創(chuàng)傷和慢性潰瘍的愈合和修復(fù)提供了一種較好的治療方案。目前國外已批準(zhǔn)組織工程皮膚用于治療燒傷和糖尿病皮膚潰瘍，并已有超過百萬的患者接受了人工植皮［1?2］。生物反應(yīng)器是工程化組織體外發(fā)育、成熟和擴(kuò)大生產(chǎn)的關(guān)鍵設(shè)備，其中灌注式生物反應(yīng)器的培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于其他非灌注式生物反應(yīng)器［3］。工程皮膚灌注培養(yǎng)的特殊要求是氣液界面、低應(yīng)力環(huán)境，加之對工程化皮膚體外生長代謝狀況知之甚少，不能針對其生長特性及生長要求合理控制并優(yōu)化灌注培養(yǎng)條件。我們擬采用前期自制的灌注式生物反應(yīng)裝置，通過探討不同灌注流速培養(yǎng)條件下組織工程真皮生長代謝情況，為體外皮膚灌注培養(yǎng)模型的建立和工程化皮膚的擴(kuò)大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、主要試劑及儀器

Ⅱ型膠原酶、胰蛋白酶、小牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國Life Technologies公司）；分離酶（瑞士Roche公司）；殼多糖、6硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸（美國Sigma?Aldrich公司）；噻唑藍(lán)（MTT）（北京索萊寶科技有限公司）；PBS（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；葡萄糖測試盒、乳酸測試盒、羥脯氨酸測試盒（南京建成生物工程研究所）；改進(jìn)后的高敏度小張力膜狀生物材料力學(xué)檢測裝置［4］。

二、灌注裝置

本實(shí)驗(yàn)室自主研制，并已獲得專利授權(quán)［5］。見圖1。裝置由蠕動泵、無菌硅膠管、儲液瓶、生物反應(yīng)盒及培養(yǎng)盤構(gòu)成，其中培養(yǎng)盤置于生物反應(yīng)盒內(nèi)。培養(yǎng)盤主要由靜壓槽、截流板、培養(yǎng)室、培養(yǎng)板、后溢流臺和泄流溝組成。工作原理是培養(yǎng)基在蠕動泵的帶動下從儲液瓶進(jìn)入靜壓槽，并在此將動壓轉(zhuǎn)換成穩(wěn)定靜壓，再經(jīng)截流板進(jìn)口流入培養(yǎng)室，在培養(yǎng)室中形成均勻平面流場，隨后培養(yǎng)基經(jīng)后溢流臺從泄流溝進(jìn)入下一層培養(yǎng)盤的靜壓槽或反應(yīng)盒，再通過蠕動泵帶動返回儲液瓶，如此反復(fù)循環(huán)。

三、細(xì)胞培養(yǎng)及組織構(gòu)建

1.培養(yǎng)基的配制：用D?Hanks液稀釋常規(guī)DMEM培養(yǎng)基至終濃度為20%，添加10%小牛血清和100 U/ml青霉素及鏈霉素，0.22 μm微孔濾膜過濾待用。

圖1 灌注裝置示意圖 a：儲液瓶；b：無菌硅膠管；c：蠕動泵；d：生物反應(yīng)盒；e：培養(yǎng)盤；箭頭指示培養(yǎng)基流動方向及蠕動泵轉(zhuǎn)動方向

2.人真皮成纖維細(xì)胞（human dermal fibroblasts，HDF）的分離和培養(yǎng)：第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院泌尿外科無皮膚病變的包皮環(huán)切術(shù)患者（年齡6～18歲），征得其法定監(jiān)護(hù)人知情同意后，切取包皮放入PBS溶液中，并迅速進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)［6］，以后每隔3 d換液1次，觀察細(xì)胞融合至90%用胰酶消化傳代。采用第3～7代HDF進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.復(fù)方殼多糖組織工程真皮構(gòu)建：按本研究組建立的方法構(gòu)建復(fù)方殼多糖組織工程真皮［7］：在冰浴條件下，按比例加入濃縮DMEM、酸溶性鼠尾膠原、殼多糖、6硫酸軟骨素以及透明質(zhì)酸，充分混勻后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7.2～7.4，取HDF懸液，按2×104/ml的終濃度與凝膠混勻，將該混合液接種到底部有微孔的24孔板中，每孔2 ml，待凝膠凝固后行灌注培養(yǎng)。按培養(yǎng)基的灌注流速不同，實(shí)驗(yàn)分為50、100和200 ml/min灌注組，每隔11.5 h灌注1次，每次灌注0.5 h。三維靜態(tài)培養(yǎng)為對照組，其培養(yǎng)環(huán)境及條件與灌注組一致。

四、MTT法檢測細(xì)胞活力

每隔2 d取各組培養(yǎng)的復(fù)方殼多糖組織工程真皮，37℃下避光并在5 g/L MTT中孵育4 h，濾紙吸干水份并用DMSO溶解，于490 nm波長處檢測樣品吸光度（A值），制作細(xì)胞生長曲線。

五、細(xì)胞代謝特性檢測

每2 d取各組的培養(yǎng)基0.5 ml于-80℃保存?zhèn)溆?，按葡萄糖測試盒及乳酸測試盒說明書分別于505 nm、530 nm波長處檢測樣品吸光度。

六、羥脯氨酸含量測定

取各組培養(yǎng)第12天的復(fù)方殼多糖組織工程真皮，于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥至衡重，稱量樣品干重，按羥脯氨酸測試盒樣本堿水解法處理樣本，并于550 nm處檢測樣品吸光度。

七、最大抗張強(qiáng)度檢測

取各組培養(yǎng)第12天的復(fù)方殼多糖組織工程真皮，于高敏度小張力膜狀生物材料力學(xué)檢測裝置上檢測最大抗張強(qiáng)度，具體步驟參見文獻(xiàn)［8］。

八、蘇木素?伊紅（HE）染色及細(xì)胞計(jì)數(shù)

各組在第6天和第10天取材后，用4%多聚甲醛溶液固定24 h以上，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色，顯微鏡觀察照相，每組各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。除特別說明外，每份檢測樣本均為3個(gè)獨(dú)立重復(fù)，計(jì)量資料以±s表示。羥脯氨酸及最大抗張強(qiáng)度數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，其余數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析，組間比較采用LSD?t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、HDF形態(tài)比較

培養(yǎng)至第8天，HDF呈長梭形，各灌注組細(xì)胞均比對照組密集（圖2）。100 ml/min灌注組細(xì)胞幾乎全部融合成片，200 ml/min灌注組細(xì)胞約達(dá)80%融合，且有沿水流方向生長的趨勢，而50 ml/min灌注組和對照組的細(xì)胞間隙較大。

二、細(xì)胞生長代謝情況比較

不同灌注流速下復(fù)方殼多糖組織工程真皮中細(xì)胞生長代謝情況見圖3。4組細(xì)胞增殖活性（A值）都隨培養(yǎng)時(shí)間的延長先持續(xù)上升后逐漸下降（F時(shí)間=653.918，P＜0.05），且不同灌注流速對細(xì)胞增殖影響的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組別=952.096，P＜0.05），培養(yǎng)時(shí)間與灌注流速分組存在交互作用（F交互=22.567，P＜0.05）。200 ml/min灌注組細(xì)胞增殖活性（0.142±0.002）和對照組（0.108±0.001）于培養(yǎng)第8天達(dá)到最大，而50 ml/min灌注組（0.128±0.005）和100 ml/min組（0.180±0.005）于第10天達(dá)到最大。灌注組的細(xì)胞增殖活性均明顯高于對照組，其中100 ml/min灌注組的最大細(xì)胞增殖活性是對照組的1.67倍，且顯著高于其他組（均P＜0.05）。

圖2 培養(yǎng)基在不同灌注流速下培養(yǎng)第8天復(fù)方殼多糖組織工程真皮中人真皮成纖維細(xì)胞生長情況（×200） 三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞呈長梭形，灌注組細(xì)胞比對照組更密集，100 ml/min灌注組細(xì)胞幾乎全部融合成片，200 ml/min灌注組細(xì)胞達(dá)80%融合。標(biāo)尺=100 μm

培養(yǎng)前，4組培養(yǎng)基的葡萄糖含量均為2.548 mmol/L，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，其含量均緩慢降低（F時(shí)間=257.108，P＜0.05），且不同灌注流速對培養(yǎng)基中葡萄糖含量變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組別=88.182，P＜0.05），培養(yǎng)時(shí)間與灌注流速分組存在交互作用（F交互=57.778，P＜ 0.05）。LSD?t檢驗(yàn)顯示，培養(yǎng)第12天，100 ml/min灌注組的葡萄糖含量顯著低于其他3組（均P＜0.05）。見圖3。

各組乳酸含量隨時(shí)間變化的趨勢與葡萄糖含量的變化相反，均緩慢上升（F時(shí)間=81.301，P＜0.05），且不同灌注流速對培養(yǎng)基中乳酸含量變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F組別=14.618，P＜0.05），培養(yǎng)時(shí)間與灌注流速分組不存在交互作用（F交互=1.600，P＞0.05）。LSD?t檢驗(yàn)顯示，各組不同時(shí)間點(diǎn)間乳酸含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。除第4天外，其余時(shí)間點(diǎn)的組間乳酸含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。第12天，100 ml/min灌注組的乳酸含量達(dá)到最高，且顯著高于其他組（P＜0.05）。見圖3。

三、羥脯氨酸含量及最大抗張強(qiáng)度比較

培養(yǎng)第12天，100 ml/min灌注組的羥脯氨酸含量（49.156±1.025 mg/g）顯著高于50 ml/min灌注組（34.002±3.392 mg/g）、200 ml/min灌注組（40.568±0.827 mg/g）及對照組（29.105± 1.207 mg/g），且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=61.512，P＜0.05）。100 ml/min灌注組的最大抗張強(qiáng)度（8.845±0.096 kPa）顯著高于50 ml/min灌注組（4.503±0.121 kPa）、200 ml/min灌注組（5.535±0.118 kPa）及對照組（3.718±0.224 kPa），且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=694.216，P＜ 0.05）。

四、HDF在復(fù)方殼多糖組織工程真皮內(nèi)的分布

MTT結(jié)果顯示，第10天細(xì)胞活力最好，故選擇第10天作為取材時(shí)間，且為了進(jìn)一步驗(yàn)證MTT結(jié)果，同時(shí)檢測了第6天工程真皮內(nèi)HDF的分布情況，其HE染色結(jié)果見圖4。灌注培養(yǎng)條件下，細(xì)胞在支架中的分布比靜態(tài)培養(yǎng)時(shí)均勻，胞核較大、長，但隨著灌注流速增大，胞核變圓、變短、變大（200 ml/min組）。各組隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示（表1），4組細(xì)胞數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間延長均有所增加（F時(shí)間=197.149，P＜0.05），不同灌注組的細(xì)胞數(shù)量存在顯著差異（F組別=625.151，P＜0.05），培養(yǎng)時(shí)間與灌注流速分組存在交互作用（F交互=83.823，P＜ 0.05），與MTT結(jié)果一致。LSD?t檢驗(yàn)顯示，灌注組細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組（均P＜0.05），其中100 ml/min組細(xì)胞數(shù)量最多，顯著高于其他灌注組（均P＜0.05）。

討 論

工程化組織中細(xì)胞生長面臨的最大問題是為支架材料內(nèi)部區(qū)域提供充足的營養(yǎng)［9］。傳統(tǒng)的靜態(tài)三維培養(yǎng)依賴擴(kuò)散方式傳遞養(yǎng)分，存在擴(kuò)散受限的缺點(diǎn)，有代謝活性的細(xì)胞在超過100 μm深的支架區(qū)域就不能獲得足夠的營養(yǎng)，形成組織“空化”現(xiàn)象［10］，而有流體流動的灌注式生物反應(yīng)器是解決營養(yǎng)傳遞受限最有效的方法［11?12］。培養(yǎng)基連續(xù)流經(jīng)工程組織內(nèi)部或周圍的灌注培養(yǎng)能給予厚度超過500 μm區(qū)域以可靠的營養(yǎng)［13］。除增強(qiáng)養(yǎng)分傳遞外，灌注液流產(chǎn)生的剪切力能提供機(jī)械刺激，有利于構(gòu)建物的發(fā)育和成熟。灌注培養(yǎng)使工程化組織一直處于新鮮的培養(yǎng)液中，不僅避免了代謝產(chǎn)物的非生理性累積，而且避免了細(xì)胞因子的旁分泌過度，這樣低親和力分子被排除，而高親和力分子的濃度可以相對較高［14］。因此，灌注培養(yǎng)是增強(qiáng)細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞生長和基質(zhì)合成的有效手段。灌注培養(yǎng)的灌注速度直接影響支架內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)速度及液流對細(xì)胞產(chǎn)生的力學(xué)刺激［15］，而灌注速度隨組織類型、細(xì)胞種類、細(xì)胞支架復(fù)合物成分和生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)不同而變化。因此，本研究在前期自制灌注培養(yǎng)裝置的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究不同灌注流速對復(fù)方殼多糖組織工程真皮中HDF生長代謝的影響，以期尋求最佳灌注培養(yǎng)流速，為體外皮膚灌注培養(yǎng)模型的建立奠定基礎(chǔ)，也為下一步擴(kuò)大化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

圖4 培養(yǎng)基不同灌注流速下第6、10天復(fù)方殼多糖組織工程真皮中人真皮成纖維細(xì)胞分布情況（HE×100） 與對照組相比，灌注組細(xì)胞分布更均勻，胞核更大、更長；200 ml/min灌注組胞核較圓、較短、較大。標(biāo)尺=200 μm

表1 培養(yǎng)基不同灌注流速下第6天和第10天復(fù)方殼多糖組織工程真皮中人真皮成纖維細(xì)胞數(shù)量比較（±s）

表1 培養(yǎng)基不同灌注流速下第6天和第10天復(fù)方殼多糖組織工程真皮中人真皮成纖維細(xì)胞數(shù)量比較（±s）

注：n=5。經(jīng)Mauchly球形檢驗(yàn)計(jì)算W=0.069，P=0.186，接受球形假設(shè)；a：交互效應(yīng)

組別對照組50 ml/min灌注組100 ml/min灌注組200 ml/min灌注組F值P值第6天30.400±1.817 34.200±0.837 65.000±2.236 61.200±2.864 337.287 0.000第10天39.200±2.588 48.800±2.588 92.600±3.050 54.200±3.033 344.351 0.000 F值5.753 11.332 13.698 3.853 83.823a P值0.005 0.000 0.000 0.018 0.000a

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3個(gè)不同大小的灌注流速，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌注培養(yǎng)可增強(qiáng)細(xì)胞活力，但過低的流速（50 ml/min）細(xì)胞活力較低且增殖緩慢，過高的流速（200 ml/min）不僅降低其活力，還會使真皮細(xì)胞提前進(jìn)入衰退期，并在一定程度上影響細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)灌注流速為100 ml/min時(shí)細(xì)胞活力最高。Kalyanaraman等［16］在其自制的反應(yīng)器中對組織工程皮膚進(jìn)行熟化培養(yǎng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，灌注流速為5 ml/min和15 ml/min時(shí)能增強(qiáng)工程皮膚細(xì)胞活力并維持表皮屏障功能，更適合移植；但流速為50 ml/min時(shí)細(xì)胞只有少量增殖。在較低的灌注流速下（50 ml/min），養(yǎng)分供應(yīng)不充足加之支架中積累的代謝廢物滯留時(shí)間相對較長，影響了真皮細(xì)胞的活力及生長速度；而較高的流速會產(chǎn)生較高的流體剪切力，一定強(qiáng)度的剪切力會刺激細(xì)胞生長和胞外基質(zhì)合成，但過高的剪切力會影響細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性及胞外基質(zhì)沉積［17］。因此，200 ml/min灌注組其細(xì)胞活力和胞外羥脯氨酸的含量均較100 ml/min組低。100 ml/min的灌注流速在增強(qiáng)傳質(zhì)的同時(shí)，可有效地平衡養(yǎng)分供應(yīng)、代謝廢物的排除與力學(xué)刺激，因此細(xì)胞活力、細(xì)胞分布、胞外膠原合成能力及物理抗張強(qiáng)度都最佳。

值得注意的是，采用常規(guī)的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的組織工程真皮細(xì)胞容易遷移并聚集到皮片邊緣形成“包衣”結(jié)構(gòu)，過厚的這種結(jié)構(gòu)會阻礙養(yǎng)分的傳遞，影響組織工程真皮內(nèi)部細(xì)胞的生長。因此，我們前期降低營養(yǎng)濃度到20%后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的邊緣移行情況有明顯好轉(zhuǎn)，故本文采用20%DMEM完全培養(yǎng)基。葡萄糖和乳酸含量檢測結(jié)果表明，100 ml/min灌注組消耗的葡萄糖最多，積累的乳酸也最多，說明其細(xì)胞代謝最旺盛。有報(bào)道稱，當(dāng)乳酸的積累量超過22～55 mmol/L時(shí)會負(fù)面影響培養(yǎng)的細(xì)胞［18］，本實(shí)驗(yàn)檢測到乳酸的最大值為（1.512±0.058）mmol/L，故對真皮內(nèi)HDF影響不明顯。

組織工程皮膚作為皮膚替代物，不僅要具備良好的生物學(xué)特性，還應(yīng)具有良好的力學(xué)特性以適應(yīng)臨床移植，因此抗張強(qiáng)度是評價(jià)其力學(xué)性能的重要指標(biāo)。軟組織的張力強(qiáng)度主要與膠原密度、膠原結(jié)構(gòu)排列、平均膠原纖維直徑和膠原交聯(lián)程度等相關(guān)［19］。本研究組研制的復(fù)方殼多糖組織工程真皮主要由膠原構(gòu)成。在體外培養(yǎng)過程中，HDF不斷合成分泌膠原蛋白形成膠原纖維，因此具有良好的韌性，可任意剪切和縫合。本實(shí)驗(yàn)測定了不同灌注流速對復(fù)方殼多糖組織工程真皮抗張強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明灌注組的最大抗張強(qiáng)度比對照組大，其中100 ml/min灌注組最大抗張強(qiáng)度最大、200 ml/min灌注組次之，50 ml/min灌注組最小，這一結(jié)果與細(xì)胞活力和羥脯氨酸測量結(jié)果一致。說明灌注培養(yǎng)能增強(qiáng)工程真皮的力學(xué)性能，但過高的流速（200 ml/min）由于影響了HDF活力，降低了細(xì)胞合成分泌膠原的能力，使其抗張強(qiáng)度有所降低。因此，100 ml/min灌注組較其他組更適合工程真皮力學(xué)特性的塑造。

綜上所述，灌注培養(yǎng)條件下，復(fù)方殼多糖組織工程真皮細(xì)胞生長代謝及物理特性都優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)，但不同灌注流速產(chǎn)生的培養(yǎng)效果不同。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)定的流速條件下，100 ml/min的培養(yǎng)效果最好，細(xì)胞活力、細(xì)胞分布、代謝速度、膠原合成及抗張強(qiáng)度都優(yōu)于其他組，但是否有更適合組織工程真皮培養(yǎng)的灌注模式仍需進(jìn)一步研究。

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Effects of different medium perfusion rates on the growth and metabolism of composite chitosan?based tissue?engineered dermi

s
Tang Hui,Yan Hongtao,Chen Nian,Yang Hang,Yang Guihong,Wu Jinjin
Department of Dermatology,Daping Hospital,The Third Military Medical University,Chongqing 400042,China Corresponding author:Wu Jinjin,Email:wjjjj@163.com

ObjectiveTo evaluate effects of different medium perfusion rates on the growth and metabolism of composite chitosan?based tissue?engineered dermis in a dynamic three?dimensional culture system.MethodsHuman dermal fibroblasts（HDFs）at a density of 2 × 104/ml were inoculated onto chitosan?collagen composite hydrogels,and then cultured in a self?made perfusion culture device with the medium perfusion rates being 50,100 or 200 ml/min for 12 days（perfusion culture groups）,and statically cultivated HDFs served as the control group.An inverted microscope was used to observe morphological changes of HDFs,and methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was conducted to evaluate proliferative activity of HDFs.Test kits were used to determine glucose and lactate levels to evaluate cellular metabolic activity,and hydroxyproline content was measured to estimate collagen synthesis.An improved highly sensitive mechanical testing device was used to measure the tensile strength of the tissue?engineered dermis,and hematoxylin and eosin（HE）staining was performed to observe the morphology and distribution of HDFs.Statistical analysis was carried out by repeated?measures analysis of variance,one?way analysis of variance and the least significant difference（LSD）?ttest.ResultsCompared with the control group,HDFs were distributed more densely in the perfusion culture groups.After 8?day culture,HDFs,which tended to grow along the direction of medium flow,grew to almost complete confluence in the 100?ml/min perfusion culture group,and to 80%confluence in the 200?ml/min group.As MTT assay showed,the proliferative activity of HDFs（expressed as absorbance［A］value）increased initially,but then gradually decreased over time in all the above 4 groups（allP＜0.05）.Moreover,perfusion culture groups all showed significantly higher cellular proliferative activity compared with the control group,and the maximum cellular proliferative activity in the 100?ml/min group was 1.67 times that in the controlgroup,andsignificantlyhigherthanthatintheotherperfusionculturegroups（bothP＜ 0.05）.Thelevelsofglucose in the 4 groups all decreased over time（allP＜ 0.05）,and the 100?ml/min group（1.604 ± 0.038 mmol/L）showed significantly lower levels of glucose compared with the control group（2.205 ± 0.020 mmol/L,P＜ 0.05）,50?ml/min group（1.939 ± 0.037 mmol/L,P＜ 0.05）and 200?ml/min group（2.047 ± 0.039 mmol/L,P＜ 0.05）after 12?day culture.However,in contrast to glucose,the levels of lactate changed in the opposite direction,and increased gradually over time in all the 4 groups（P＜ 0.05）,but even the maximum level of lactate had no obvious effect on HDFs in the dermis.On day 12,the 100?ml/min group showed significantly higher hydroxyproline levels and maximum tensile strength compared with the other three groups（F=61.512,694.216,respectively,bothP＜ 0.05）.On days 6 and 10,all the perfusion culture groups showed increased quantities（allP＜ 0.05）of more evenly distributed HDFs with larger and longer nuclei in scaffolds compared with the control group.Moreover,the amounts of cells were significantly larger in the 100?ml/min group than in the other perfusion culture groups（bothP＜ 0.05）.Conclusions The medium perfusion rate of 100 ml/min is optimal for the culture of composite chitosan?based tissue?engineered dermis.At this medium perfusion rate,cellular proliferative activity,cell distribution,metabolic rates,collagen synthesis and the maximum tensile strength were more favourable compared with those at other perfusion rates.

Chitin;Tissue engineering;Culture techniques;Fibroblasts

伍津津，Email：wjjjj@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.12.008

國家自然科學(xué)基金（31570975）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（31570975）

2016?04?01）

（本文編輯：周良佳 顏艷）