李敏 周乃慧 宋琳毅 楊子良 王淼淼 余秀琴

215006蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科

彈性假黃色瘤一例ABCC6基因突變分析

李敏 周乃慧 宋琳毅 楊子良 王淼淼 余秀琴

215006蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科

目的報(bào)告1例彈性假黃色瘤，并檢測(cè)ABCC6基因突變情況。方法分析1例彈性假黃色瘤先證者的臨床資料，并收集其父母、兒子及100例無親緣關(guān)系的健康對(duì)照的外周血，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增ABCC6基因編碼區(qū)31個(gè)外顯子，并進(jìn)行DNA直接測(cè)序與ABCC6編碼蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)。結(jié)果先證者父母及兒子表型均正常?；蛲蛔兎治鲲@示，先證者存在ABCC6基因c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）的復(fù)合雜合突變，先證者母親為c.3703C＞T（p.R1235W）雜合突變攜帶者，先證者父親和兒子為c.373G＞A（p.E125K）雜合突變攜帶者，而100例無親緣關(guān)系的健康對(duì)照均未檢測(cè)到該兩種突變。物種間序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，ABCC6編碼蛋白質(zhì)第125位谷氨酸和第1235位精氨酸為進(jìn)化高度保守的序列，SIFT和Polyphen?2軟件預(yù)測(cè)c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）突變?yōu)橛泻ψ儺愇稽c(diǎn)。結(jié)論ABCC6基因c.373G＞A（p.E125K）和c.3703C＞T（p.R1235W）的復(fù)合雜合突變可能是該例彈性假黃色瘤患者發(fā)病的原因。

彈性假黃瘤；DNA突變分析；皮膚表現(xiàn)；雜合子；基因，ABCC6

彈性假黃色瘤（pseudoxanthoma elasticum，PXE）是一種主要累及彈性纖維、并可侵犯人體多種器官和系統(tǒng)的少見遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為皮膚、眼和心血管系統(tǒng)損害［1?2］，發(fā)病率1∶50 000 ～ 1∶70 000，女性多于男性［3］。已經(jīng)證實(shí)，PXE的致病基因?yàn)锳BCC6［4］。現(xiàn)報(bào)告1例PXE，并分析其ABCC6基因突變情況。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

先證者女，47歲，已婚，蘇州人。因左眼視力下降9月余，加重2個(gè)月于2014年12月至蘇州大學(xué)附屬理想眼科醫(yī)院就診。既往近視20年，戴鏡矯正。在3歲時(shí)家人即發(fā)現(xiàn)其頸部、腋下、下腹、腹股溝處膚色及略呈黃色的鵝卵石樣丘疹，隨年齡增長皮疹稍有增多，無明顯自覺癥狀，未引起重視。否認(rèn)系統(tǒng)性疾病史，父母體健，非近親結(jié)婚；育有1子，家族中無類似疾病及遺傳病史。體檢：先證者各系統(tǒng)檢查未見異常。皮膚科檢查：頸部、腋下、下腹及腹股溝處膚色或略呈黃色的丘疹，沿皮紋分布，外觀似鵝卵石樣（圖1）。頸部皮損組織病理：表皮大致正常，真皮中部見較多斷裂、腫脹、呈集簇藍(lán)染的嗜堿性碎片狀或顆粒狀物（圖2）。彈性纖維染色（間苯二酚法）：真皮中部深藍(lán)黑色彈性纖維腫脹、斷裂，呈破毛線團(tuán)狀，而正常皮膚組織真皮中部深藍(lán)黑色彈性纖維較長，呈波浪狀，走向與表皮平行。鈣染色（von Kossa法）：真皮中部可見棕褐色顆粒狀和碎片狀鈣沉積。視力檢查：右眼0.05，矯正-2.5DS/-3.0DC*85=0.5+；左眼 0.04，矯正-1.75DS/*85=0.04。眼底檢查：雙眼視盤周圍呈一環(huán)形條紋，由此向各個(gè)方向放射狀發(fā)出數(shù)條不規(guī)則細(xì)條紋，右眼細(xì)條紋未侵及黃斑，左眼一細(xì)條紋侵及黃斑區(qū)。眼底熒光造影：雙眼眼底血管樣條紋，以左眼受累明顯，其中左眼血管樣條紋侵及黃斑區(qū)。實(shí)驗(yàn)室檢查：血尿常規(guī)、生化全套、胸部X線片、心臟彩超、雙下肢血管超聲及頸部血管超聲未見明顯異常。

圖1 先證者皮損表現(xiàn) 頸部（1A）及腹股溝處（1B）可見膚色或略呈黃色的鵝卵石樣排列的丘疹

圖2 先證者頸部皮損組織病理 表皮大致正常，真皮中部見較多斷裂、腫脹、呈集簇藍(lán)染的嗜堿性碎片狀或顆粒狀物（2A：HE×100；2B：HE×400）

先證者父母及兒子各系統(tǒng)檢查、皮膚科檢查、眼底檢查、心臟彩超、雙下肢血管超聲及頸部血管超聲均未見異常。

在征得先證者及其家屬同意后，采集先證者、先證者父母及兒子外周血各5 ml，并采集100例無親緣關(guān)系的健康人外周血5 ml作為對(duì)照。

二、DNA測(cè)序

1.DNA提?。河肈NA提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取基因組DNA。

2.Touch?down PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序：通過http：//www.ncbi.nlm.nih.gov檢索ABCC6基因mRNA序列，序列對(duì)比得到ABCC6基因的全基因組序列，應(yīng)用DNAMAN軟件分別設(shè)計(jì)覆蓋ABCC6基因31個(gè)外顯子的29對(duì)引物（表1）。PCR反應(yīng)體系（50 μl）：模板DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，TaqDNA聚合酶2.5 U，dNTP（10 mmol/L）1 μl，Taq緩沖液5 μl，MgCl2（25 mmol/L）5 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火30 s，退火溫度63～58℃，前10個(gè)循環(huán)每個(gè)循環(huán)降低0.5℃，降至58℃以后每循環(huán)維持退火58℃，72℃延伸40～50 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃修復(fù)延伸5～8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，純化回收，ABI3730XL測(cè)序儀測(cè)序。

3.ABCC6編碼蛋白質(zhì)序列保守性分析及蛋白功能預(yù)測(cè)：對(duì)人、小鼠、大鼠、牛、狗、家兔、大熊貓、猩猩、家貓和鴨嘴獸10種物種的ABCC6編碼蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，分析蛋白序列的保守性。應(yīng)用SIFT和Polyphen?2軟件預(yù)測(cè)p.E125K和p.R1235W兩個(gè)突變點(diǎn)是否為有害突變。

結(jié) 果

一、表型分析

根據(jù)PXE的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］，先證者診斷為PXE，除皮膚及眼受累外，未見心血管系統(tǒng)及胃腸道受累。先證者父母及兒子表型均正常（圖3）。

表1 ABCC6基因外顯子PCR擴(kuò)增引物及產(chǎn)物長度

圖3 彈性假黃色瘤家系圖

二、DNA直接測(cè)序

將DNA直接測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫公布的ABCC6基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)先證者ABCC6基因第4號(hào)外顯子第373位堿基由G突變成A，造成125位氨基酸由谷氨酸變成賴氨酸［c.373G＞A（p.E125K）］；同時(shí)第26號(hào)外顯子第3703位堿基由C變成T，造成1235位氨基酸由精氨酸變成色氨酸［c.3703C＞T（p.R1235W）］。該先證者存在ABCC6基因c.373G ＞ A（p.E125K）和c.3703C ＞ T（p.R1235W）的復(fù)合雜合突變，先證者母親為c.3703C＞T（p.R1235W）雜合突變攜帶者，先證者父親和兒子為c.373G＞A（p.E125K）雜合突變攜帶者（圖4），而100例健康對(duì)照中均未檢測(cè)到該兩種突變（基因序列版本：GRCh37/hg19）。

三、ABCC6編碼蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)

物種間序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，ABCC6編碼蛋白質(zhì)第125位谷氨酸和第1235位精氨酸序列為進(jìn)化高度保守的序列。SIFT軟件對(duì)p.E125K突變和p.R1235W突變的功能預(yù)測(cè)結(jié)果為Affect Protein Function，其 score分別為0.01和 0.00。Polyphen?2軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果為可能有害，p.E125K突變和p.R1235W突變的score分別為0.918和1.00。SIFT和 Polyphen?2軟件預(yù)測(cè)p.E125K突變和p.R1235W突變均為有害變異位點(diǎn)，可能影響蛋白質(zhì)功能。

討 論

PXE是一種少見的常染色體隱性遺傳性疾病，主要累及彈性組織，可侵犯人體多個(gè)器官和系統(tǒng)，臨床上主要表現(xiàn)為皮膚、眼和心血管系統(tǒng)的損害［1?3］。PXE尚可合并胃腸道損害，其中以消化道出血最為嚴(yán)重。本研究中，先證者為1例散發(fā)病例，結(jié)合其皮損表現(xiàn)、皮損組織病理學(xué)特點(diǎn)及眼底血管樣條紋可明確診斷，但未見明顯心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)損害。

已證實(shí)PXE發(fā)病與ABCC6基因突變有關(guān)［4］。ABCC6基因定位于染色體16p13.1，屬于跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATP結(jié)合基因家族，包含31個(gè)外顯子，其mRNA編碼由1 503個(gè)氨基酸組成的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白即多藥抗藥性相關(guān)蛋白（multidrug?resistance associated protein 6，MRP6）［6］。ABCC6 編碼蛋白質(zhì)在人肝臟和腎臟中表達(dá)最高，皮膚、血管壁和視網(wǎng)膜等組織中僅低水平表達(dá)。ABCC6基因突變可引起常染色體隱性遺傳性PXE，推測(cè)PXE屬于代謝性疾病，ABCC6基因編碼蛋白質(zhì)MRP6能夠?qū)⒏闻K的代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)至血循環(huán)和外周組織，ABCC6基因突變后，具有正常功能的MRP6蛋白減少甚至缺失，引起與彈性纖維有高親和力的物質(zhì)在組織內(nèi)蓄積，使彈性纖維發(fā)生異常鈣化、變性、腫脹或斷裂等，從而導(dǎo)致PXE患者出現(xiàn)皮膚、眼和心血管等多器官、多系統(tǒng)的損害。但目前ABCC6基因突變后導(dǎo)致PXE發(fā)病的確切機(jī)制尚不完全明確［7?10］。迄今已報(bào)道ABCC6致病性突變位點(diǎn)300余個(gè)，其中高加索患者以c.3421C ＞ T（p.R1141X）突變和del23?29（23?29號(hào)外顯子之間的大片段缺失）突變最為常見，占所有突變的30%以上［11］。而中國PXE患者ABCC6基因突變的研究較少。2008年，楊梅等［12］報(bào)道1例散發(fā)PXE患者ABCC6基因第28號(hào)外顯子c.3940C＞T（p.R1314W）突變。2015年，Jin等［13］對(duì)22例中國PXE患者ABCC6基因突變分析后發(fā)現(xiàn)包括錯(cuò)義突變、插入突變和缺失突變?cè)趦?nèi)的17種致病性突變，但該兩項(xiàng)研究均未發(fā)現(xiàn)中國PXE患者存在ABCC6基因c.3421C＞T（p.R1141X）突變和del23?29突變，提示PXE患者ABCC6基因突變可能存在一定的種族差異。

本研究對(duì)1例典型的PXE散發(fā)患者的ABCC6基因的31對(duì)外顯子進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)先證者存在第4號(hào)外顯子c.373G＞A（p.E125K）和第26號(hào)外顯子c.3703C＞T（p.R1235W）的復(fù)合雜合突變，分別來自其父母，其兒子僅存在c.373G＞A（p.E125K）雜合突變，其父母及兒子均為單個(gè)雜合突變攜帶者，仍有一個(gè)拷貝正常，故未發(fā)病，表型均正常；本例先證者符合常染色體隱性遺傳模式。查閱文獻(xiàn)，患者存在的c.373G＞A（p.E125K）突變和c.3703C＞T（p.R1235W）突變先后分別以純合和復(fù)合雜合的形式在PXE患者中有相關(guān)報(bào)道［13］，但未檢索到PXE患者同時(shí)存在c.373G ＞A（p.E125K）和c.3703C ＞T（p.R1235W）復(fù)合雜合突變的報(bào)道。ABCC6編碼蛋白質(zhì)的第125位谷氨酸為極性帶負(fù)電荷的氨基酸（酸性氨基酸），p.E125K突變后賴氨酸是極性帶正電荷的氨基酸（堿性氨基酸）；第1235位精氨酸為極性帶正電荷的氨基酸（堿性氨基酸），p.R1235W突變后色氨酸是非極性氨基酸（疏水氨基酸）。另外，物種間序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ABCC6編碼蛋白質(zhì)的第125位谷氨酸和第1235位精氨酸這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)屬于進(jìn)化高度保守的序列，SIFT和Polyphen?2軟件預(yù)測(cè)p.E125K和p.R1235W均為有害變異位點(diǎn)。本文結(jié)果提示，c.373G ＞A（p.E125K）和c.3703C ＞T（p.R1235W）的復(fù)合雜合突變很可能影響了ABCC6編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，從而導(dǎo)致PXE，但具體機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步的功能學(xué)研究證實(shí)。這些結(jié)果進(jìn)一步豐富了PXE致病基因ABCC6的突變譜，為今后對(duì)PXE患者進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷奠定了一定的基礎(chǔ)。

志謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院病理科曾學(xué)思教授、蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科蔡琴華主任醫(yī)師、李龍標(biāo)主任醫(yī)師、蘇州市立醫(yī)院東區(qū)皮膚科馮雨苗副主任醫(yī)師

［1］Uitto J,Li Q,Jiang Q.Pseudoxanthoma elasticum:molecular genetics and putative pathomechanisms［J］.J Invest Dermatol,2010,130（3）:661?670.DOI:10.1038/jid.2009.411.

［2］Uitto J,Jiang Q,Váradi A,et al.Pseudoxanthoma elasticum:diagnostic features,classification and treatment options［J］.Expert Opin Orphan Drugs,2014,2（6）:567?577.

［3］Faria CS,Li Q,Guo H,et al.Clinical phenotypes and ABCC6 gene mutationsin Brazilian familieswith pseudoxanthoma elasticum［J］.Acta Derm Venereol,2013,93（6）:739?740.DOI:10.2340/00015555?1570.

［4］Chassaing N,Martin L,Calvas P,et al.Pseudoxanthoma elasticum:a clinical,pathophysiological and genetic update including 11 novel ABCC6 mutations［J］.J Med Genet,2005,42（12）:881 ?892.DOI:10.1136/jmg.2004.030171.

［5］Akoglu G,Li Q,Gokoz O,et al.Clinical and histopathological characteristics of a family with R1141X mutation of pseudoxan?thoma elasticum?presymptomatic testing and lack of carrier phenotypes［J］.Int J Dermatol,2014,53（6）:692 ?698.DOI:10.1111/ijd.12008.

［6］Le SO,Urban Z,Tschuch C,et al.Mutations in a gene encoding an ABC transporter cause pseudoxanthoma elasticum［J］.Nat Genet,2000,25（2）:223?227.DOI:10.1038/76102.

［7］UittoJ,Pulkkinen L,RingpfeilF.Moleculargeneticsof pseudoxanthoma elasticum:a metabolic disorder at the environ?ment?genome interface?［J］.Trends Mol Med,2001,7（1）:13?17.

［8］Marques GF,Nakandakari S,Coelho AP,et al.Pseudoxanthoma elasticum:report of two cases［J］.An Bras Dermatol,2014,89（5）:812?815.

［9］Váradi A,Szabó Z,Pomozi V,et al.ABCC6 as a target in pseudoxanthoma elasticum［J］.Curr Drug Targets,2011,12（5）:671?682.

［10］Jansen RS,Duijst S,Mahakena S,et al.ABCC6?mediated ATP secretion by the liver is the main source of the mineralization inhibitor inorganic pyrophosphate in the systemic circulation?brief report［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2014,34（9）:1985?1989.DOI:10.1161/ATVBAHA.114.304017.

［11］Pfendner EG,Vanakker OM,Terry SF,et al.Mutation detection in the ABCC6 gene and genotype?phenotype analysis in a large international case series affected by pseudoxanthoma elasticum［J］.J Med Genet,2007,44（10）:621 ?628.DOI:10.1136/jmg.2007.051094.

［12］楊梅,高敏,肖風(fēng)麗,等.彈性纖維假黃瘤ABCC6基因突變檢測(cè)［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,43（2）:206?207.Yang M,Gao M,Xiao FL,et al.Detection of ABCC6 gene mutation in pseudoxanthoma elasticum［J］.Acta Universitatis Medicinalis Anhui,2008,43（2）:206?207.

［13］Jin L,Jiang Q,Wu Z,et al.Genetic heterogeneity of pseudo?xanthoma elasticum:the Chinese signature profile of ABCC6 and ENPP1 mutations［J］.J Invest Dermatol,2015,135（5）:1294 ?1302.DOI:10.1038/jid.2015.10.

Mutation analysis of the ABCC6 gene in a patient with pseudoxanthoma elasticum

LiMin,Zhou Naihui,Song Linyi,Yang Ziliang,Wang Miaomiao,Yu Xiuqin
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215006,China Corresponding author:Zhou Naihui,Email:zhounaihui@163.com

ObjectiveTo report a case of pseudoxanthoma elasticum,and to analyze mutations of the ABCC6 gene in the family with pseudoxanthoma elasticum.MethodsClinical data were obtained from a female patient with pseudoxanthoma elasticum and analyzed.Blood samples were collected from the proband,her parents and son,as well as 100 unrelated healthy human controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 31 exons of the ABCC6 gene followed by direct DNA sequencing.The function of the protein encoded by the ABCC6 gene was predicted.ResultsThe phenotypes of the patient′s parents and son were all normal.Mutation analysis of the ABCC6 gene revealed compound heterozygous mutations c.373G＞A（p.E125K）and c.3703C＞T（p.R1235W）in the proband,a heterozygous mutation c.3703C ＞ T（p.R1235W）in the proband′s mother,and a heterozygous mutation c.373G ＞ A（p.E125K）in the proband′s father and son.However,neither of the above mutations was found in the 100 unrelated healthy controls.Interspecific sequence alignment showed that glutamic acid at position 125 and arginine at position 1235 of the protein encoded by the ABCC6 gene were highly evolutionarily conserved.As SIFT and Polyphen?2 softwares showed,the mutations c.373G ＞ A（p.E125K）and c.3703C ＞ T（p.R1235W）were both predicted to be detrimental variations.ConclusionThe compound heterozygous mutations c.373G＞A（p.E125K）and c.3703C ＞ T（p.R1235W） in the ABCC6 gene may be responsible for the occurrence of pseudoxanthoma elasticum in this patient.

Pseudoxanthoma elasticum;DNA mutational analysis;Skin manifestations;Heterozygote;Genes,ABCC6

周乃慧，Email：zhounaihui@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2016.12.002

江蘇省自然科學(xué)基金（BK20140294、BK20130267）

Fund program:Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK20140294,BK20130267）

2016?05?23）

（本文編輯：吳曉初）