陳先銳，王肇悅，何秀萍

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酵母菌合成2-苯乙醇的研究進展

陳先銳，王肇悅，何秀萍

中國科學院微生物研究所中國科學院微生物生理與代謝工程重點實驗室，北京 100101

2-苯乙醇是一種具有令人愉悅的玫瑰風味的芳香醇，在食品、化妝品和藥品等領域具有廣泛的應用。本文對酵母菌合成2-苯乙醇的代謝途徑及其調控過程、以及提高2-苯乙醇產量的國內外研究進展進行了綜述，并對通過微生物轉化法合成2-苯乙醇目前存在的不足及進一步研究方向進行了討論。

酵母，2-苯乙醇，代謝途徑，基因，調控

2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)，也稱β-苯乙醇、2-苯基乙醇，分子式為C8H10O，是1種具有玫瑰風味的芳香醇，存在于玫瑰、茉莉等多種植物精油中，也是葡萄酒、黃酒、啤酒和面包等多種發(fā)酵食品的天然風味物質，是決定發(fā)酵食品品質的關鍵因素之一。2-苯乙醇的香氣頗受人們歡迎，是國際香精香料的主流風格，在食品和日化用品等領域具有非常廣泛的應用。2-苯乙醇對革蘭氏陰性菌、球菌、桿菌和部分真菌有抑菌作用，在醫(yī)藥衛(wèi)生領域有重要應用；同時其對果實、鮮花具有保護作用，可以用作植物保鮮劑[1-2]。2-苯乙醇也可以作為底物合成其他高附加值的香味化合物或者藥物，比如乙酸苯乙酯，既可以作為香料又可以配制神經(jīng)類藥物；苯乙醇苷，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、強心等作用；1-異丙氨基-3-[對-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇，是1種β-腎上腺素阻滯劑，可治療高血壓、心絞痛和心肌梗塞等[3]。

工業(yè)上生產2-苯乙醇的方法有化學合成法和天然法。化學合成法是以苯或苯乙烯為原料通過化學反應合成2-苯乙醇，不但原料具有致癌風險，而且產物中常含有一些難以去除的副產物，嚴重影響了產品質量，極大限制了產品的使用范圍。天然法生產2-苯乙醇包括采用物理方法從植物中直接提取和微生物合成2種途徑，天然產品純度高、無毒無害，具有很好的生物安全性，因此市場需求量越來越大[4]。從玫瑰等植物精油中提取天然 2-苯乙醇的效率很低，提取成本高，難以滿足市場需求。一些真菌和酵母菌具有合成2-苯乙醇的能力，為微生物發(fā)酵法生產2-苯乙醇奠定了基礎[3]。目前國內外發(fā)酵生產2-苯乙醇的菌種以酵母菌為主，如產朊假絲酵母、釀酒酵母和克魯維酵母等。

作為模式生物的釀酒酵母既是1種國際公認的安全微生物，也是目前發(fā)現(xiàn)的2-苯乙醇合成能力較高的微生物之一。與其他微生物相比，釀酒酵母對很多脅迫因素具有較高耐受性，對工業(yè)化環(huán)境具有較高的適應性，以及成熟的發(fā)酵工藝控制策略，因此是通過微生物發(fā)酵法生產2-苯乙醇的理想菌種。

1 酵母菌合成2-苯乙醇的代謝途徑及調控過程

1.1 莽草酸途徑 (Shikimate pathway)

莽草酸途徑是釀酒酵母從頭合成2-苯乙醇的代謝途徑 (圖1)[3]。來源于糖酵解途徑(Glycolysis)的磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenol pyruvate) 和磷酸戊糖途徑(Pentose phosphate pathway) 的4-磷酸赤蘚糖(Erythrose-4-phosphate) 經(jīng)4步酶促反應生成莽草酸(Shikimate)，莽草酸進一步經(jīng)5步酶促反應生成苯丙酮酸(Phenylpyruvate)，然后在苯丙酮酸脫羧酶(Phenylpyruvate decarboxylase) 催化下生成苯乙醛(Phenyl-acetaldehyde)，最后在醇脫氫酶(Alcohol dehydrogenase) 作用下脫氫生成2-苯乙醇 (2-Phenylethanol)。釀酒酵母通過莽草酸途徑合成2-苯乙醇的代謝途徑長、支路多，并存在多種抑制作用，因此通過莽草酸途徑合成2-苯乙醇的產量很低，一般僅為400?500 mg/L[5]。

圖1 酵母菌合成2-苯乙醇的代謝途徑

1.2 艾氏途徑 (Ehrlich pathway)

艾氏途徑早在1907年就被德國生物化學家Felix Ehrlich提出，但直到20世紀90年代才通過體外實驗得到確認；而胞內代謝途徑直到最近幾年才借助核磁共振等先進技術最終得以證實[6]。當培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸 (L-Phe) 作為唯一氮源時，酵母菌主要通過艾氏途徑合成2-苯乙醇：L-Phe經(jīng)芳香族氨基酸氨基轉移酶Ⅰ(Aromatic aminotransferaseⅠ) 或芳香族氨基酸氨基轉移酶Ⅱ (Aromatic aminotransferaseⅡ) 催化生成苯丙酮酸，苯丙酮酸經(jīng)苯丙酮酸脫羧酶 (Phenylpyruvate decarboxylase) 作用脫羧生成苯乙醛，苯乙醛在醇脫氫酶 (Alcohol dehydrogenase) 作用下脫氫生成2-苯乙醇 (圖1和2)[3]。

圖2 艾氏途徑合成2-苯乙醇[3]

1.2.1 L-苯丙氨酸的轉運及相關基因

釀酒酵母可以利用30多種不同的含氮化合物作為細胞生長的唯一氮源，其中能支持細胞快速生長的氮源為優(yōu)質氮源，如谷氨酰胺和氨；而只能維持細胞緩慢生長的氮源為貧乏氮源，如脯氨酸、尿素和芳香族氨基酸。釀酒酵母會根據(jù)環(huán)境中氮源的含量及質量調整細胞的生理代謝過程[7]。Gap1p是轉運芳香族氨基酸進入細胞的主要通透酶。培養(yǎng)基中存在優(yōu)質氮源時，由于氮代謝物阻遏作用 (Nitrogen catabolite repression，NCR)，的表達被抑制，質膜上的Gap1p失活；當培養(yǎng)基僅有貧乏氮源時，被誘導表達，Gap1p恢復轉運活性。的誘導表達與GATA轉錄因子及啟動子上游的激活序列有關，此外，氨基酸滲透因子Ssy1p是細胞接受胞外芳香族氨基酸信號的感應器。因此，當L-苯丙氨酸作為唯一氮源時，Ssy1p首先接受L-苯丙氨酸的信號，并誘導表達和Gap1p恢復活性，Gap1p將L-苯丙氨酸轉運至胞內，參與細胞的代謝活動。

1.2.2 轉氨、脫羧、還原反應及相關酶與基因

艾氏途徑合成2苯乙醇的轉氨反應由芳香族氨基酸氨基轉移酶所催化，將L-苯丙氨酸的氨基轉移到α-酮戊二酸，形成苯丙酮酸和L-谷氨酸 (圖2)[3]。在釀酒酵母中存在兩種同工酶，即芳香族氨基酸氨基轉移酶Ⅰ和芳香族氨基酸氨基轉移酶Ⅱ，兩者同屬于第一家族氨基轉移酶類，分別由和基因編碼。的表達受氨基酸生物合成的通用調控系統(tǒng)調節(jié)，它在細胞的各個周期都能夠表達。Aro8p能夠催化與芳香族氨基酸代謝相關的絕大部分轉氨反應，而且對甲硫氨酸、α氨基己二酸和亮氨酸的轉氨反應也有催化作用。Aro9p的N-端區(qū)域有2個反向平行的β-折疊片，是Aro9p區(qū)別于其他轉氨酶的特征區(qū)域，并與Aro9p二聚體的形成有關[8]。細胞在優(yōu)質氮源條件下不表達基因，在基因無法表達或者在僅含貧乏氮源的情況下，經(jīng)苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸等誘導進行表達，產生芳香族氨基酸氨基轉移酶II。轉錄因子Aro80p 和基因的一段上游激活序列是參與誘導表達的兩個重要因素[9]。

艾氏途徑的脫羧反應為不可逆反應，轉氨反應的產物——苯丙酮酸被苯丙酮酸脫羧酶催化，脫去一個羧基生成苯乙醛 (圖2)[3]。釀酒酵母基因組中含有5個可能編碼苯丙酮酸脫羧酶活性的基因，在不同氮源的條件下，5個基因中只有基因的轉錄水平有較大改變，當以L-苯丙氨酸為唯一氮源時，轉錄水平比其余4個基因的轉錄水平高出30倍，說明艾氏途徑中苯丙酮酸脫羧酶主要是由基因編碼[10]。Aro10p的底物范圍較廣，主要參與芳香族氨基酸轉氨反應產物的脫羧反應[10]。與一樣，細胞在優(yōu)質氮源條件下不表達基因，在氮源貧乏的情況下，經(jīng)苯丙氨酸、色氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸等誘導表達，其誘導作用同樣涉及轉錄因子Aro80p和一段上游激活序列。

艾氏途徑合成2-苯乙醇的最后一步是苯乙醛在依賴于NADH的醇脫氫酶催化下發(fā)生還原反應，生成終產物2-苯乙醇 (圖2)[3]。在葡萄糖限制的連續(xù)充氧恒化器中培養(yǎng)時，苯乙醛主要被醛脫氫酶氧化成雜醇酸，而以葡萄糖流加分批培養(yǎng)時，90%以上的苯乙醛會經(jīng)醇脫氫酶還原生成2-苯乙醇，更進一步以不充氧方式進行分批或者恒化器培養(yǎng)時，苯乙醛幾乎可以全部被還原生成2-苯乙醇[10]。說明醛脫氫酶與醇脫氫酶催化苯乙醛發(fā)生氧化還原反應之間的平衡是由培養(yǎng)條件所決定的[6,11]。在釀酒酵母中共發(fā)現(xiàn)6個與2-苯乙醇合成相關的脫氫酶基因，包括5個乙醇脫氫酶基因、、、和，以及一個甲醛脫氫酶基因，這6個基因至少有一個表達，細胞才能表現(xiàn)出長鏈復合醇脫氫酶活性。而Adh1p-Adh5p或者 Sfa1p中的任何一個都可以單獨催化艾氏途徑中最后一步由醛脫氫形成高級醇的反應[6])。

1.2.3 2-苯乙醇的外排

雜醇從細胞內外排到培養(yǎng)基中的詳細機制目前還不清楚，但有研究表明，雜醇的外排至少需要一個細胞質膜載體的參與[6]。，編碼一種依賴于ATP的與苯甲酸鹽、山梨酸鹽等弱有機酸外排有關的質膜載體Pdr12p。當細胞在以亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸為唯一氮源的恒化器中培養(yǎng)時，的表達水平明顯上升[9]。對缺失突變株的表型分析表明Pdr12p參與了酵母菌艾氏途徑以亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸或色氨酸為底物合成的雜醇的外排過程[12]。

1.2.4 艾氏途徑合成2-苯乙醇的調控

在氮源豐富的條件下，細胞只能通過莽草酸途徑合成少量的2-苯乙醇[9]。而當L-苯丙氨酸作為唯一氮源時，某些轉錄因子可以調控艾氏途徑相關基因表達，細胞以艾氏途徑合成2-苯乙醇。目前已知的調控因子主要有Aro80p以及GATA轉錄因子[13-14]。

1) 轉錄因子Aro80p

基因編碼的轉錄因子Aro80p屬于Zn2Cys6蛋白家族的一員。它對芳香族氨基酸產生應答而激活和的表達。Aro80p的N末端是與DNA結合的區(qū)域，能夠與靶基因啟動子序列中一段36 bp的激活序列結合。這段36 bp的激活序列由4組互相間隔7個堿基的CCG組成，最早在和的啟動子序列中得到確認，同時也存在于啟動子序列中(圖3)[14]。在芳香族氨基酸作為唯一氮源的條件下，芳香族氨基酸通過氨基酸通透酶Gap1p進入細胞，Aro80p接受芳香族氨基酸的誘導信號后與和基因啟動子上的CCG重復序列結合，激活艾氏途徑關鍵酶基因的表達，同時Aro80p也對的表達產生自誘導作用。

2) GATA轉錄因子

GATA家族是一類能識別GATA基序(motif)并與之結合的轉錄調節(jié)因子。在釀酒酵母中，氮代謝活動相關基因的表達受4個GATA家族轉錄因子——Gln3p、Gzf3p、Gat1p、Dal80p的全局調控，其中Gln3p和Gat1p是轉錄激活因子[13]。在氮源豐富條件下，Gln3p和Gat1p被隔離在細胞質中，無法參與靶基因的轉錄調控；當?shù)簇毞r，Gln3p和Gat1p進入細胞核，激活靶基因的表達[13-14]。是第一個被克隆和測序的氮代謝基因的調控因子基因。Gln3p的306?330區(qū)域是一個鋅指結構，是Gln3p與靶基因啟動子的5￠-GATAA/G-3￠序列結合的區(qū)域，這些序列稱之為上游激活序列 (UASNTR)。Gat1p是釀酒酵母氮代謝途徑中第二個被發(fā)現(xiàn)的激活因子。和有較高的同源性，310?334區(qū)域是與靶基因啟動子5￠-GATAA/G-3￠序列結合的鋅指結構區(qū)。與釀酒酵母艾氏途徑相關的、、和的啟動子中均含有GATA轉錄因子的結合序列5￠-GATAA/G-3￠(圖3)[14]；用雷帕霉素處理酵母細胞后，細胞出現(xiàn)類似氮源缺乏的表型，通過染色質免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)此條件下GATA轉錄因子Gln3p和Gat1p與、、和啟動子的結合明顯增強[14]。而敲除GATA轉錄激活因子編碼基因和后，、、和的表達水平明顯降低[14]。可見GATA轉錄因子可能直接或間接參與艾氏途徑合成2-苯乙醇關鍵酶基因的轉錄調控。

圖3 ARO9、ARO10、ARO80和GAP1啟動子上游激活序列

2 2-苯乙醇的生理功能與細胞毒性

2-苯乙醇作為一種次級代謝產物，它在酵母細胞中的生理功能目前還不很清楚。它可能作為環(huán)境敏感的信號分子，通過特定的信號途徑影響細胞的形態(tài)。酵母細胞在含有雜醇，比如異戊醇的培養(yǎng)基中會誘導假菌絲生長，這種細胞形態(tài)的改變伴隨著琥珀酸脫氫酶活性的增加以及細胞壁幾丁質含量的上升。除異戊醇外，外源添加2-苯乙醇也會導致細胞形態(tài)發(fā)生改變和單倍體侵入生長[15]。生理生化研究表明，隨著2-苯乙醇濃度增加(從0到4.0 g/L)，酵母細胞分解代謝能力、細胞膜滲透性逐漸降低，線粒體膜電位逐漸增加，胞內ROS 濃度先增加后減少[16]。這種效應可能被一種感應環(huán)境變化而發(fā)生形態(tài)改變的群體信號通路所調控。芳香醇通過cAMP-依賴的蛋白激酶A亞基Tpk2p和轉錄因子Flo8p，誘導細胞表面GPI錨定蛋白——絮凝蛋白Flo11p的上調表達來刺激細胞形態(tài)發(fā)生改變[15]。在不能合成芳香醇的缺陷菌株中，細胞絲狀生長的現(xiàn)象明顯減少，而外源添加芳香醇后細胞又重新出現(xiàn)絲狀生長的現(xiàn)象[15]。人類真菌病原體白色念珠菌和都柏林念珠菌在刺激菌膜形成的生長階段也會產生2-苯乙醇和異戊醇?？梢?-苯乙醇可能作為一種信號分子，誘導細胞分化以適應環(huán)境的改變[6]。

3 提高酵母菌2-苯乙醇產量的研究

艾氏途徑合成2-苯乙醇只需要3步反應，代謝途徑短，是提高2-苯乙醇產量的關鍵途徑。酵母細胞在貧乏氮源中僅維持基本的生理代謝活動，因此細胞對芳香族氨基酸的吸收速度比較慢，艾氏途徑轉化芳香族氨基酸的效率很低。貧乏型氨基酸在細胞內累積，也會對氨基酸通透酶Gap1p基因的表達和酶活性產生反饋抑制作用，以減少細胞能量及代謝物的消耗。而當艾氏途徑的產物2-苯乙醇濃度上升時，細胞生長和的表達都受到抑制，2-苯乙醇濃度超過3 g/L后，幾乎完全抑制酵母細胞生長，并且的表達幾乎被阻斷；細胞對L-苯丙氨酸的吸收效率也隨2-苯乙醇濃度的上升而逐漸降低[16]。因此，酵母細胞通過艾氏途徑合成2-苯乙醇存在著底物反饋抑制、底物利用率低、產物反饋抑制和產物的細胞毒性等問題。要提高2-苯乙醇的產量，需要對酵母菌合成2-苯乙醇的各個關鍵環(huán)節(jié)進行綜合調控。目前提高酵母菌2-苯乙醇產量的研究主要包括傳統(tǒng)選育、代謝工程改造等育種策略以及發(fā)酵過程優(yōu)化及控制。

3.1 菌株選育

3.1.1 自然篩選及誘變育種

對微生物進行篩選和誘變是獲得工業(yè)高產菌株的有效方法。酵母菌是人類最早應用的工業(yè)微生物之一，通過篩選和誘變獲得高產2-苯乙醇的酵母菌株已有較多的報道 (表1)。梅建鳳等比較了13個酵母菌株合成2-苯乙醇的能力，篩選出一株2-苯乙醇合成能力較高的釀酒酵母BD；紫外誘變獲得的突變菌株BD-25-39其2-苯乙醇產量達到5.4 g/L，比原始菌株提高了10.2%[17-18]。Eshkol等在具有多重壓力抗性表型的酵母菌株中篩選首先獲得耐熱菌株，進而獲得可以耐受2.5 g/L以上2-苯乙醇的酵母菌株Ye9-612，其2-苯乙醇產量和非耐熱菌株相比提高了57%[19]。Celinska等報道了一株從英國酵母保藏中心篩選到的產2-苯乙醇的解脂耶氏酵母NCYC3825，在非優(yōu)化的培養(yǎng)基中2-苯乙醇產量接近2g/L，這是首次篩選到的產2-苯乙醇的解脂耶氏酵母，是一株較有潛力的2-苯乙醇生產菌株[20]。

表1 產2-苯乙醇酵母菌株選育

3.1.2 代謝工程改造

運用基因工程可以對酵母菌合成2-苯乙醇的關鍵酶基因和調控因子基因的表達進行調控，進而調節(jié)細胞合成2-苯乙醇的能力，達到定向提高2-苯乙醇產量的目的 (表1)。梁婧如等從.S288C 中克隆脫羧酶基因并構建重組質粒，將重組質粒導入S288C，轉化菌株的2-苯乙醇產量達到1.0 g/L，較對照菌提高了16%[21]。Kim等在W303-1B中高效表達轉錄因子基因，明顯提高了Aro80p靶基因和的表達水平，使2-苯乙醇產量比對照菌株提高了58%；進一步通過同時高效表達、和，在SC培養(yǎng)基中2-苯乙醇產量比對照菌株提高了3.1倍；在此基礎上，敲除乙醛脫氫酶基因，阻斷苯乙醛生成苯乙酸酯這一競爭性途徑，2-苯乙醇產量比對照菌提高了約5倍[22]。Kim等通過質粒介導的方式在馬克斯克魯維酵母BY25569中同時高效表達釀酒酵母艾氏途徑的苯丙酮酸脫羧酶基因和醇脫氫酶基因，在以YNB為氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時2-苯乙醇產量為1.0 g/L，比宿主菌株提高了4倍；而當這兩個基因分別在BY25569中高效表達時，細胞沒有產生2-苯乙醇，說明在以YNB為氮源的培養(yǎng)基中，細胞啟動艾氏途徑合成2-苯乙醇至少需要同時具有苯丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的活性；作者還篩選出1株具有對氟苯丙氨酸 (L-Phe的毒性類似物)抗性的進化菌株，并在該菌株中高效表達來源于的抗3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP) 合酶回復突變型基因aroG，減輕芳香族氨基酸特別是L-苯丙氨酸合成的反饋抑制，該菌株在不含L-苯丙氨酸的培養(yǎng)基中可以合成1.3 g/L的2-苯乙醇[23]。Romagnoli等應用合成基因陣列法對釀酒酵母中參與2-苯乙醇合成的基因進行篩選和鑒定，重點研究了編碼苯丙酮酸脫羧酶的基因，研究發(fā)現(xiàn)敲除后的CEN.PK在以硫酸銨為唯一氮源的培養(yǎng)基中生長時，的表達量增加，2-苯乙醇的產量為180 mg/L；同時敲除、和以及高效表達和后，的表達量進一步增加，2-苯乙醇產量達到410 mg/L，該研究為利用廉價氮源合成2-苯乙醇提供了新的思路[24]。本實驗室對釀酒酵母莽草酸途經(jīng)和艾氏途徑合成2-苯乙醇的代謝調控進行了研究，發(fā)現(xiàn)不僅合成途徑中的關鍵酶對2-苯乙醇合成有直接的調節(jié)作用，而且氨基酸通透酶以及轉錄因子對莽草酸途徑和艾氏途徑合成2-苯乙醇也具有重要的調控作用，這些研究為全面闡述2-苯乙醇合成的調控機制以及進一步構建高產2-苯乙醇的酵母工程菌提供了寶貴的理論依據(jù)。

3.2 發(fā)酵過程優(yōu)化與控制

3.2.1 培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化

酵母菌合成2-苯乙醇除了受到菌株本身特性的影響，還與培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件密切相關，通過對培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，可以顯著提高酵母菌2-苯乙醇的產量 (表2)。梅建鳳等通過單因素和正交試驗、中心組合試驗和響應面分析，建立了2-PE產量和培養(yǎng)基組分之間的二次多項式回歸模型，發(fā)現(xiàn)碳氮源、無機鹽及底物濃度等均是影響酵母菌2-PE合成的主要因素，在優(yōu)化培養(yǎng)條件下，2-PE合成能力提高了155%[18]。王航等對釀酒酵母轉化生成2-苯乙醇過程的碳氮源進行優(yōu)化，2-苯乙醇終濃度達4.4 g/L，和未優(yōu)化時相比提高了76%[25]。汪琨等對釀酒酵母CWY132生物轉化合成2-苯乙醇的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進行優(yōu)化設計，2-苯乙醇產量達到4.1 g/L，比未優(yōu)化時提高了約50%[26]。Etschmann等對CBS600的13種培養(yǎng)基成分以及培養(yǎng)溫度進行優(yōu)化演算，2-苯乙醇的最高產量達到5.6 g/L，比未優(yōu)化時提高了87%[27]。Pan等研究在甘蔗糖蜜廢水中以混合微生物共培養(yǎng)的方法生產2-苯乙醇，利用比較代謝組學和多元統(tǒng)計分析方法對細胞內102種代謝物進行了分析，發(fā)現(xiàn)其中17種代謝物通過6條不同的途徑影響2-苯乙醇的合成，經(jīng)過發(fā)酵實驗對代謝物進一步分析提出了生產2-苯乙醇的整體代謝機制假說，即：細胞內丙酮酸代謝流量的分支途徑，以及苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、脯氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和油酸的流量，與2-苯乙醇產量和細胞生長密切相關，這個結論為利用甘蔗糖蜜廢水生產2-苯乙醇的菌種馴化、篩選和培養(yǎng)基優(yōu)化提供了理論指導[28]。

表2 產2-苯乙醇酵母菌株發(fā)酵過程優(yōu)化和控制

3.2.2 原位產物分離技術

原位產物分離技術，是一種可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)回收產物的方法，使發(fā)酵培養(yǎng)基中產物的濃度維持較低水平，有效降低或避免發(fā)酵產物對微生物細胞的生長抑制或毒性作用，解除產物反饋抑制，還可以簡化下游的產物分離工藝。原位產物分離技術主要包括兩相法萃取技術、吸附技術以及基于膜分離的滲透蒸發(fā)和滲透萃取技術等。在微生物合成2-苯乙醇的培養(yǎng)基中采用原位產物分離技術將2-苯乙醇與微生物細胞分離，有助于提高2-苯乙醇產量 (表2)。

1) 兩相法萃取

液液萃取技術是指利用2-苯乙醇在水相和有機相中的溶解度或分配系數(shù)差異，使2-苯乙醇從水相轉移到有機相中，達到產物和細胞分離的目的。梅建鳳等研究了BD在水/有機溶劑兩相體系中轉化合成2-苯乙醇的工藝，在油酸與培養(yǎng)基體積比為1∶3時，有機相和水相中2-苯乙醇的濃度分別為14.9 g/L和1.7 g/L[29]。Stark等以油酸為萃取劑，將Giv 2009進行兩相補料分批培養(yǎng)，油酸中2-苯乙醇的濃度為24.0 g/L，2-苯乙醇總產量達到12.6 g/L[30]。Etschmann等以PPG1200為萃取劑對CBS 600進行流加培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中保持培養(yǎng)基中L-苯丙氨酸濃度恒定，有機相和水相中的2-苯乙醇濃度分別為26.5 g/L和0.3 g/L，2-苯乙醇總產量為10.2 g/L[31]。Kim 以PPG 1200為萃取劑，采用JHY 317進行兩相發(fā)酵，2-苯乙醇總產量為6.1 g/L[22]。

2) 吸附

吸附技術是在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入利用樹脂等多孔材料對2-苯乙醇進行吸附，使產物實現(xiàn)原位轉移。Mei等從幾種樹脂中篩選出對2-苯乙醇具有較高吸附能力的非極性大孔樹脂D101，以BD作為實驗菌株，將2 g水合樹脂加入到30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，2-苯乙醇的總產量為6.2 g/L[32]。Rong等在用活性干酵母發(fā)酵2-苯乙醇時以大孔吸附樹脂HZ816為分離介質，通過控制葡萄糖酵解和乙醇氧化降解的速率來加強2-苯乙醇合成效率，2-苯乙醇總產量為14.8 g/L[11]。Gao和Daugulis利用固液兩相分區(qū)生物反應器系統(tǒng)對CBS 600進行發(fā)酵培養(yǎng)，以Hytrel?8206作為吸附劑，2-苯乙醇總產量為13.7 g/L，而當采用半連續(xù)反應器進行培養(yǎng)時，2-苯乙醇總產量可達20.4 g/L[33]。Wang等提出了一個反映協(xié)同效應的動力學模型，利用GivR-UV3合成2-苯乙醇時通過控制葡萄糖流量和加入FD0816樹脂作為萃取劑來降低2-苯乙醇和乙醇對細胞的毒性作用，在流加培養(yǎng)時加入10%的樹脂，2-苯乙醇總產量為13.7 g/L，而當采用半連續(xù)培養(yǎng)的原位產物分離技術，在2-苯乙醇含量高于2.7 g/L時替換新的樹脂，2-苯乙醇總產量可達32.5 g/L[34]。

3) 滲透蒸發(fā)和滲透萃取

膜具有選擇性分離的功能，利用膜的選擇透過性可以在發(fā)酵液中實現(xiàn)2-苯乙醇的分離和純化。Etschmann等用聚辛基甲基硅氧烷 (POMS) 膜包裹聚丙烯 (PP) 或聚醚酰亞胺 (PEI) 組成一種親有機質的滲透蒸發(fā)單元，將它用于CBS 600的發(fā)酵培養(yǎng)，2-苯乙醇產量達到5.2 g/L[35]。Stark等將癸二酸二丁酯包埋在直徑2.2 mm的海藻酸鈣-聚乙烯亞胺-戊二醛微膠囊中，每個微囊形成一個獨立的滲透萃取系統(tǒng)，將這些微囊放入發(fā)酵罐中，對Giv 2009進行補料分批發(fā)酵后得到5.6 g/L的 2-苯乙醇，比原來的產量提高了47%[36]。侯丹丹等利用海藻酸鈉-殼聚糖 (AC) 微膠囊作為固定化載體將酵母細胞包裹，在培養(yǎng)基-癸二酸二丁酯兩相體系中催化合成2-苯乙醇，細胞與有機相被微膠囊隔離，有機相不影響微囊內酵母細胞的生長，且微囊內細胞活性保持良好，2-苯乙醇產量為4.5 g/L[37]。

4 總結與展望

微生物轉化法生產的2-苯乙醇屬于天然產品，符合國際標準對食品、化妝品和藥品原材料的要求，在國際市場上具有廣闊的應用前景。然而世界范圍內只有少數(shù)幾個企業(yè)能夠運用微生物發(fā)酵生產2-苯乙醇，產量較低，遠遠不能滿足市場需求。微生物合成2-苯乙醇的產量受到多種因素的影響和制約，目前提高2-苯乙醇產量的研究取得了一定的進展，但是這些方法都存在著一定的局限：傳統(tǒng)方法隨機性大，2-苯乙醇產量提高不明顯；原位產物分離技術成本較高，不利于控制生產成本；基因工程方法的調控機制比較復雜，需要更多的深入研究。在今后的研究中，研究者們仍需在菌種改造、培養(yǎng)基優(yōu)化、成本控制和生產工藝優(yōu)化等方面繼續(xù)深入研究，綜合考慮這些因素對2-苯乙醇產量的影響，實現(xiàn)微生物生產2-苯乙醇的最優(yōu)方案。同時，深入研究2-苯乙醇生物合成的關鍵調控因子及調控機制以及2-苯乙醇的毒性機制，將為闡明細胞內2-苯乙醇的代謝機制及調控機理提供更多理論依據(jù)，并為進一步構建高產2-苯乙醇工程菌提供理論指導。

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(本文責編 陳宏宇)

Advances in biosynthesis of 2-phenylethanol by yeasts

Xianrui Chen, Zhaoyue Wang, and Xiuping He

CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

2-Phenylethanol (2-PE) is an aromatic alcohol with a pleasant rose-like fragrance. It has been widely used in food, cosmetic, and pharmaceutical industry. Most of 2-PE is produced by chemical synthesis, but the use of chemically synthesized product is restricted in some fields. 2-PE from plant extraction is natural but its production is very low. Microbial biotransformation is a promising process to produce natural 2-PE. In this paper, we review recent research progress in the synthetic metabolic pathways and regulatory processes of 2-PE in yeast, and strategies for improving 2-PE production. Moreover, we discuss the limitation of current progress and future research directions.

yeast, 2-phenylethanol, metabolic pathway, gene, regulation

December 21, 2015; Accepted: January 28, 2016

Xiuping He. Tel/Fax: +86-10-64807427; E-mail: hexp@im.ac.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31171754).

國家自然科學基金 (No. 31171754) 資助。

陳先銳, 王肇悅, 何秀萍. 酵母菌合成2-苯乙醇的研究進展. 生物工程學報, 2016, 32(9): 1151–1163.

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