高　瑾，羅　偉，王　欽，徐偉翔，吳岢蔚，李　杰，章麗霞△

(1.蘭州石化總醫(yī)院婦產(chǎn)科,蘭州 730060；2.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，四川南充 637000)

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·經(jīng)驗(yàn)交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.036

紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞增殖及IMP3表達(dá)的影響*

高瑾1，羅偉2，王欽2，徐偉翔2，吳岢蔚2，李杰2，章麗霞2△

(1.蘭州石化總醫(yī)院婦產(chǎn)科,蘭州 730060；2.川北醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，四川南充 637000)

目的檢測(cè)紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞中胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ mRNA 結(jié)合蛋白3(IMP3)表達(dá)情況的影響及其意義。方法采用CCK-8法檢測(cè)不同濃度紅景天苷作用Siha細(xì)胞24、48、72 h的細(xì)胞增殖抑制作用，采用Western blot和RT-PCR檢測(cè)宮頸癌Siha細(xì)胞中IMP3的蛋白和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞的增殖抑制率具有時(shí)間和濃度雙重依賴性(P<0.05)。IMP3在紅景天苷組宮頸癌Siha細(xì)胞中的蛋白和mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論紅景天苷可抑制宮頸癌Siha細(xì)胞增殖，同時(shí)降低Siha細(xì)胞IMP3的表達(dá)。

紅景天屬；宮頸腫瘤；Siha細(xì)胞；胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白

紅景天是一種具有廣泛藥理作用的天然中草藥植物，其主要有效成分是紅景天苷。紅景天苷對(duì)體外培養(yǎng)人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞[1]、人乳腺癌MCF-7細(xì)胞[2]及肺腺癌SPC-A-1細(xì)胞[3]等有一定的抑制作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也有報(bào)道，紅景天苷具有抑制體內(nèi)移植瘤如小鼠腹水型H22肝癌[4]和Lewis肺癌荷瘤小鼠移植瘤的生長(zhǎng)、提高小鼠生存期的作用[5]。目前尚少見(jiàn)對(duì)紅景天苷作用宮頸癌Siha細(xì)胞后檢測(cè)其胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ mRNA 結(jié)合蛋白3(IMP3)表達(dá)的報(bào)道。本研究通過(guò)不同濃度紅景天分別作用宮頸癌Siha細(xì)胞24、48、72 h，觀察紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞增殖抑制作用，從而選取紅景天苷作用宮頸癌Siha細(xì)胞的最佳干預(yù)濃度，檢測(cè)并分析紅景天苷作用宮頸癌Siha細(xì)胞后，細(xì)胞中IMP3的表達(dá)變化，為紅景天苷應(yīng)用于臨床治療宮頸癌進(jìn)行初步研究。

1　材料與方法

1.1材料人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞由川北醫(yī)學(xué)院影像研究所惠贈(zèng)，IMP3單克隆抗體購(gòu)于ABCAM 公司(ab177477)，CCK-8試劑，增強(qiáng)型RIPA裂解液，苯甲基磺酰氟(PMSF)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物，二抗，CCK-8試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；新生牛血清購(gòu)于TBD 公司；高糖DMEM購(gòu)于Gibco公司。紅景天苷購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，純度：HHPLC=98%，規(guī)格：每支20 mg。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)用DMEM 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素各100 U/mL)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。每2～3天換液1 次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞備用。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)紅景天苷Siha細(xì)胞的毒性作用取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌Siha細(xì)胞，胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)基，紅景天苷處理組加入用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋的0、20、40、80、160、320 μg/mL的紅景天苷；對(duì)照組加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL培養(yǎng)細(xì)胞，空白對(duì)照組不加細(xì)胞僅加含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液100 μL，每組6個(gè)復(fù)孔繼續(xù)分別培養(yǎng)至24、48、72 h后每孔分別加入10 μL CCK-8，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h后，在酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值(A)，抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。

1.2.3Western blot法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌Siha細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個(gè)，接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶4 mL。待細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)吸棄舊液，PBS溶液洗滌3次后，分別加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液(共2瓶)、含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋的終濃度為80 μg/mL(2瓶)并含5%FBS的紅景天苷溶液。標(biāo)記組別(對(duì)照組和紅景天組)和時(shí)間后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，對(duì)照組吸棄舊液，紅景天苷組吸取舊液離心，PBS溶液洗滌3次后，每瓶加入500 μL蛋白裂解液，冰上裂解2～3 h，提取細(xì)胞總蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白濃度。100 ℃變性5 min，每孔上樣40 μg，10% SDS-PAGE凝膠電泳,恒壓95 V 90 min分離樣品；200 mA轉(zhuǎn)膜35～50 min；以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加5%脫脂奶粉稀釋的IMP3，4 ℃過(guò)夜。TBST洗膜5 min×3次，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫孵育2～3 h，TBST洗膜5 min×3次，ECL發(fā)光。使用Image lab軟件分析目的蛋白與內(nèi)參的灰度值，通過(guò)目的蛋白IMP3與β-actin內(nèi)參照灰度值對(duì)比，得出相對(duì)量。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)宮頸癌Siha細(xì)胞中IMP3的mRNA表達(dá)按Trizol總RNA 抽提試劑盒所附說(shuō)明提取待測(cè)細(xì)胞中總RNA。紫外分光光度儀測(cè)定其濃度后， 取1 ng RNA，在離心管內(nèi)加入Oligo(dT)15、dNTP、RNA 酶抑制劑、DEPC水,在逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 的催化下獲得cDNA。所有的引物均由寶生物工程大連公司合成(表1)。以2%瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR結(jié)果。用Image lab軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析，以相應(yīng)目的條帶IMP3吸光度值與β-actin條帶吸光度值的比值進(jìn)行半定量分析。

表1　IMP3、β-actin RT-PCR引物序列

2　結(jié)　果

2.1紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞增殖的影響采用CCK-8檢測(cè)紅景天苷對(duì)Siha細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制的影響，在20～640 μg/mL濃度，不同濃度的紅景天在不同的作用時(shí)間下(24、48、72 h)對(duì)Siha細(xì)胞均有抑制作用，且隨紅景天苷濃度的增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，宮頸癌Siha細(xì)胞增殖抑制率也逐漸增高(表2)。以紅景天苷濃度在640 μg/mL，作用72 h時(shí)的抑制率最高，抑制率為97.46%±0.54%；不同濃度紅景天苷作用Siha細(xì)胞48 h的抑制曲線較好，其中紅景天苷80 μg/mL作用Siha細(xì)胞48 h的抑制率為49.80%±0.46%。不同藥物濃度對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞增殖抑制率的單因素方差分析，24、48、72 h的F值分別為23.73、134.687、34.21，均P<0.01。提示紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞的增殖抑制率具有時(shí)間和濃度雙重依賴性。以80 μg/mL紅景天苷濃度分別作用24、48、72 h進(jìn)行單因素方差分析，F(xiàn)=70.56，P<0.01。故選取48 h IC50，80 μg/mL作為干預(yù)濃度，為紅景天苷組。宮頸癌Siha細(xì)胞為對(duì)照組。

2.2Western blot檢測(cè)紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞IMP3蛋白表達(dá)的影響對(duì)照組與紅景天苷組中宮頸癌Siha細(xì)胞IMP3可見(jiàn)特異性的蛋白條帶(圖1)，對(duì)照組IMP3蛋白表達(dá)量(0.306 6±0.220 8)高于紅景天苷組(0.018 8±0.002 3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3RT-PCR檢測(cè)紅景天苷對(duì)宮頸癌Siha細(xì)胞IMP3 mRNA表達(dá)的影響對(duì)照組中IMP3 mRNA的表達(dá)量(0.621 1±0.498 8)高于紅景天苷組(0.014 6±0.009 3)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

表2　不同濃度紅景天苷對(duì)Siha細(xì)胞增殖的抑制作用

圖2　IMP3 mRNA在宮頸癌Siha細(xì)胞中的表達(dá)

3　討　論

在我國(guó)，每年有約130 000例新增宮頸癌病例，占全球全年新增病例的1/3；每年有53 000例因?qū)m頸癌死亡例數(shù)，占全球?qū)m頸癌死亡例數(shù)的1/4[6]。目前，治療宮頸癌的主要手段是放化療作用配合手術(shù)切除，超過(guò)35%的局部晚期宮頸癌患者經(jīng)過(guò)手術(shù)治療或者放療后，將發(fā)展為持續(xù)性/復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移性宮頸癌，鉑類為基礎(chǔ)的順鉑作用仍然是治療的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。但鉑類藥物由于不良反應(yīng)影響，而使患者生活質(zhì)量下降，預(yù)后較差。

紅景天苷是紅景天屬植物的主要活性成分，具有抗衰老、抗疲勞以及抗缺氧作用，對(duì)心臟、腦、神經(jīng)、腎具有保護(hù)作用，以及抗癌和抗細(xì)胞凋亡等多種作用[8]。紅景天苷通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶4(cyclin-dependent kinases 4，CDK4) - 細(xì)胞周期蛋白 D1(cyclin D1)途徑而抑制G1期，或者通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)-細(xì)胞周期蛋白 B1(cyclin B1)途徑抑制G2期來(lái)發(fā)揮細(xì)胞毒活性[9]。已有研究顯示，經(jīng)紅景天苷處理的肝癌細(xì)胞在G0/G1期百分?jǐn)?shù)明顯增加，S期和G2/M期細(xì)胞減少，表明腫瘤生長(zhǎng)在G0/G1期被阻斷。提示紅景天苷可在此期抑制腫瘤DNA的合成和復(fù)制。本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8檢測(cè)不同濃度紅景天苷對(duì)Siha細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明紅景天苷對(duì)Siha細(xì)胞的增殖抑制率具有時(shí)間和濃度雙重依賴性。

IMP3又名KOC或L523S，在人類早期胚胎中發(fā)揮重要作用，在成人正常組織中很少或無(wú)表達(dá)[10-11]。但在人乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腫瘤、膀胱癌、宮頸腺癌等各種惡性腫瘤中IMP3高表達(dá)，在惡性腫瘤周圍的良性組織中不表達(dá)[12-16]。IMP3屬于IGF-Ⅱ的mRNA結(jié)合蛋白(IMP)家族，由IMP1、IMP2和IMP3組成。IMP3與IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的5′-UTR結(jié)合，通過(guò)促進(jìn)IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的翻譯使IGF-Ⅱ蛋白的表達(dá)上調(diào)而發(fā)揮致癌作用[17]。IGF-Ⅱ與IGF-ⅠR結(jié)合后，使其內(nèi)在的酪氨酸酶活化，活化的酪氨酸酶介導(dǎo)PI3K/AKT和RAF/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分化，抑制凋亡[18]。劉紀(jì)昀等[19]采用免疫組化及原位雜交方法檢測(cè)20例正常宮頸上皮，35例宮頸上皮內(nèi)瘤變，50例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的IMP3蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)IMP3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率隨著宮頸病變程度的增高而增加，提示IMP3在鑒別宮頸良惡性病變方面具有參考意義。同時(shí)有研究證實(shí)，IMP3的過(guò)表達(dá)與宮頸病變的程度有關(guān)，IMP3主要是在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中表達(dá)，并能預(yù)測(cè)腫瘤侵襲性的FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤(rùn)密切相關(guān)。因此，IMP3被認(rèn)為與腫瘤侵襲性相關(guān)[20]。本研究顯示，經(jīng)80 μg/mL紅景天苷作用的宮頸癌Siha細(xì)胞中IMP3蛋白和mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)合已有研究推測(cè)，在未經(jīng)任何治療的宮頸癌患者組織中IMP3表達(dá)，可以預(yù)測(cè)宮頸癌侵襲性腫瘤的行為，也可以作為預(yù)后不良的預(yù)測(cè)因子之一。本次實(shí)驗(yàn)表明，紅景天苷可降低宮頸癌Siha細(xì)胞中IMP3的表達(dá)，提示紅景天可能通過(guò)阻斷IMP3與IGF-Ⅱ Leader3 mRNA的5′-UTR結(jié)合，負(fù)性調(diào)節(jié)PI3K/AKT和RAF/MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制Siha細(xì)胞生長(zhǎng)。梁穎等[21]用紅景天注射液輔助化療治療非小細(xì)胞肺癌晚期對(duì)患者血清VEGF表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，紅景天對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)具有良好的抑制作用，它可以有效作用于腫瘤組織，推測(cè)紅景天苷可以用于臨床治療宮頸癌。

本實(shí)驗(yàn)以宮頸癌Siha細(xì)胞為研究對(duì)象，初步探討紅景天苷抑制宮頸癌Siha細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，后續(xù)將建立動(dòng)物模型進(jìn)一步研究紅景天苷對(duì)小鼠宮頸癌移植瘤的影響情況，以及利用PD98059(MAPK信號(hào)通路特異性阻斷劑)、LY294002 (PI3K信號(hào)通路特異性阻斷劑)分別阻斷MAPK、PI3K信號(hào)通路，進(jìn)一步探討紅景天苷在宮頸癌中的作用機(jī)制。

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四川省教育廳項(xiàng)目(12ZB225)；川北醫(yī)學(xué)院發(fā)展基金項(xiàng)目(CBY-A-QN02)；川北醫(yī)學(xué)院學(xué)生科創(chuàng)基金(15263)。作者簡(jiǎn)介：高瑾(1979-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事腫瘤病理的研究?！?/p>

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