季振中，胡正國△，徐焱成

(武漢大學中南醫(yī)院：1.綜合醫(yī)療科；2.內分泌科 ，武漢 430071)

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糖尿病腎病患者血清miRNA377的表達及其對SMAD信號通路調控作用

季振中1，胡正國1△，徐焱成2

(武漢大學中南醫(yī)院：1.綜合醫(yī)療科；2.內分泌科 ，武漢 430071)

目的探索糖尿病腎病(DN)患者血清miRNA377(miR377)的表達特點及其可能的下游調控通道。方法 用實時熒光定量PCR方法檢測經(jīng)腎活檢確診的DN組、糖尿病無腎病損害(DM)組和健康人群(對照組)血清中miR377的相對表達量，用TargetScan等生物信息學的方法預測miR377調節(jié)的靶基因，并在體外細胞模型中上調miR377的表達，檢測下游機制蛋白。結果DN組(1.32±0.13)和DM組(0.92±0.11)患者血清中miR-377均高于對照組(0.33±0.06)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；生物信息學分析顯示為糖尿病腎病中miR377的靶基因為SMAD；Western blot 結果顯示，轉染miR377 mimics組HMC細胞中SMAD2和SMAD3蛋白的表達量均高于miR377 NC組和對照組(P<0.05)，而SMAD7在各組中表達量無明顯差異(P>0.05)。結論糖尿病腎病患者血清的miR377存在異常高表達，可能預示腎臟病變的程度。

糖尿病腎病；微RNAs;計算生物學；miR377；SMAD；預后

糖尿病腎病(DN)是糖尿病患者重要的微血管并發(fā)癥，病理上為細胞膜外基質在腎小球系膜及基底膜內過度的積聚，最終引起腎小球纖維化。無論在歐美等發(fā)達國家，還是在中國，因DN而最終導致終末腎病(end stage renal disease，ESRD)的比例也逐年上升，DN的早診斷和早治療可延緩疾病進展[1]。近年來，大量研究表明miRNA與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關，有望成為疾病早期診斷標志物和潛在的治療靶點。多項研究也證實，miRNA對DN多條信號通路的調控作用，在miRNA的調控下，系膜細胞肥大，細胞外基質逐漸沉積和足細胞凋亡，共同參與了小球硬化的過程[2]。此外，miRNA在不同細胞中的作用具有復雜性及細胞特異性，有關miRNA與DN的分子作用機制有待深入探索。miRNA在基因中的調控作用可能成為DN一個新的診斷標志及治療靶點，將為DN的早期診斷和合理治療帶來新的思路[3]。Wang等[4]通過采用1型糖尿病小鼠及高糖狀態(tài)下的人系膜細胞，發(fā)現(xiàn)miRNA377(miR377)在該細胞中高表達并與DN的病情進展有關，其機制是通過下調錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)及p21活化激酶(PAK1)，從而增加纖連蛋白(FN)的表達，而FN是腎小球細胞外基質(ECM)沉淀的主要蛋白之一。本研究通過實時熒光定量PCR(quantitative realtime polymerasechain reaction，qRT-PCR)檢測DN患者和健康對照組血清中miR377的表達差異，分析其作為預測DN病情變化標志物的可能性，并探討其在DN中的可能作用機制。

1　資料與方法

1.1一般資料DN組選擇本院2012年1月至2014年6月臨床診斷病經(jīng)腎臟活檢確診的25例2型糖尿病(T2DM)患者，排除其他繼發(fā)性腎小球、腎小管病變等；糖尿病無腎損害(DM)組共27例；健康體檢者22例為健康對照組。DN組和DM組患者均患2型糖尿病，接受降糖治療方案，血糖控制滿意。本研究經(jīng)本單位醫(yī)學倫理委員會批準，且所有受試者均簽署針對研究的知情同意書。所有均受試者抽取10 mL全血，1 200 r/min離心血清，保存于-80 ℃冰箱待下一步檢測。

1.2主要試劑和儀器PCR引物、miR377-mimics和miR377-NC由廣東銳博生物技術服務公司合成，Trizol試劑由美國Invitrogen公司提供，TaqMan MicroRNA反轉錄試劑盒、miR377和U6 TaqMan檢測試劑盒(美國Applied Biosystems)。Liofectamine2000(美國lnvitrogen)氯仿、異丙醇、無水乙醇等其他常規(guī)化學試劑均為分析純產(chǎn)品。Tpersonal PCR儀為德國Biometra公司產(chǎn)品。人腎系膜細胞系(HMC)由武漢大學中南醫(yī)院科研中心保存，胎牛血清購自杭州四季青公司，高糖DMEM培養(yǎng)基和F12培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，重組人轉化生長因子(TGF)β1購自美園R&D公司，Bradford蛋白濃度試劑盒購自碧云天公司。

1.3qRT-PCR檢測按相關說明書操作。用TaqMan法進行miR377和U6的qRT-PCR檢測。TaqMan 2×Universal PCR Master Mix Ⅱ10 μL，TaqMan MicroRNA Assays 1 μL，得到反轉錄產(chǎn)物4 μL，用無RNA酶水補至20 μL。在反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)50次。PCR反應在Tpersonal PCR儀上進行。

1.4生物信息學預測miR377靶基因用TargetScan、PicTar、miRanda和miRDB 4個軟件進行在線預測miR377靶基因。

1.5下游靶基因驗證采用含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液(100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)常規(guī)培養(yǎng)HMC細胞，采用脂質體Liofectamine2000瞬時轉染miR377 mimics及miR377 NC,對照組轉染采用脂質體Liofectamine2000，瞬時轉染后24 h采用qRT-PCR檢測各組的miR377表達量。

1.6Western Blot檢測蛋白轉染48 h后，吸走上層培養(yǎng)基， 1×PBS洗滌兩次，采用Bradford蛋白濃度試劑盒測定總蛋白濃度，將定量后的蛋白樣品點樣于聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠上樣孔中，每孔20μg，分離蛋白，將蛋白電轉到聚偏二氟乙烯膜上，采用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃下孵育指定的一抗過夜，雜交反應，TBS緩沖液漂洗3次，再孵二抗，TBS緩沖液漂洗3次，化學發(fā)光顯影，膠片曝光，結果用UVP 掃描儀掃描。以β-actin蛋白為內參。

2　結　果

2.1一般資料情況DN組男15例，女10例，年齡(44.2±4.7)歲，病程大于7年，eGFR(70.3±9.4)mL/min，24 h尿蛋白量為(5.2±3.3)g；病理均為典型K-W硬化性結節(jié)病灶，免疫熒光檢測免疫復合物陰性，DN病變腎組織見圖1。DM組男14例，女13例，年齡(53.1±2.9)歲，確診糖尿病病程小于或等于1年，eGFR(84.3±4.8)mL/min，尿蛋白定量陰性。健康對照組男8例，女14例，年齡(42.8±2.5)歲，均為體檢中心年齡大于30歲的健康人群。

2.2各組血清miR377表達量qRT-PCR檢測結果顯示，DN組血清miR377表達量(1.32±0.13)顯著高于DM組(0.92±0.11)和健康對照組(0.33±0.06)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；且DM組血清miR-377表達量也高于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3miR377下游靶基因分析及預測TargetScan預測miR377靶基因為32個，PicTar預測為332個、miRanda預測為936個，miRDB預測為252個和miRDB 4個，預測結果顯示，miR377調節(jié)靶基因非常廣泛，涉及細胞增殖、細胞凋亡、細胞分化和信號轉導等各個方面。與腎臟纖維化和DN相關的SMAD信號通路基因為其潛在靶基因。選擇了SMAD2、SMAD3、SMAD7進行下一步驗證。

A：正常的腎臟組織；B：DN的腎臟組織。

圖1電鏡下的腎臟組織(×7 000)

a：P<0.01,與DM組及健康對照組比較；b:P<0.05與健康對照組比較。

圖2各組血清miR377表達量比較

2.4miR377可抑制SMAD2和SMAD3的表達Westernblot 結果顯示，轉染miR377 mimics組HMC細胞中SMAD2和SMAD3蛋白的表達量均高于miR377 NC組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而SMAD7在各組中表達量無明顯差異(P>0.05),見圖3。

Blank：空白對照組；NC：miR377陰性對照組；miR377：轉染miR-377 mimics組。

圖3各組HMC細胞SMAD2和SMAD3表達情況

3　討　論

MicoRNAs(miRNAs)是一類內源性的非編碼單鏈RNA分子，長度在22 nt左右，廣泛存在于植物、線蟲和人類的細胞中。關于miRNA在各種疾病的發(fā)生、發(fā)展中作用的研究已成為當前生命科學領域的研究熱點。miRNA通過對靶基因轉錄后的調控，使其在包括糖尿病在內的多種疾病中都發(fā)揮著重要作用[5]。然而，miRNAs在DN病理生理中的調控機制研究才剛剛起步[6]，人類已經(jīng)得到實驗證實的miRNAs有1 000多個，只少量的miRNAs分子的功能得到研究。miRNAs能調控腎臟的發(fā)生、發(fā)育，維持腎小球濾過屏障和集合管結構的完整性，一些特異性miRNAs能調控腎臟疾病的病理生理過程[7]，例如，miR15a與多囊腎病的發(fā)生密切相關[8]；細胞模擬實驗研究顯示，miR200和miR205能促進腎小管上皮細胞向間葉性細胞轉化[9]，miR192和miR377可上調細胞腎小球系膜外基質蛋白的表達，加速腎小球硬化的發(fā)展[10-11]。Yang等[12]研究顯示，尿液中miR377高表達可能作為糖尿病早期診斷的一個指標。因此，miR377參與了糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過程，miRNA在血液中比較穩(wěn)定，其血液檢測值能很好地反映患者體內miRNA水平，為探明其機制，本研究檢測DN患者和健康對照組血清中miR377的表達差異，采用生物信息學方法預測其可能靶基因SMAD，并采用Western blot進行驗證。

miRNA通過對靶基因的表達調控而發(fā)揮作用，作用靶點廣泛，與糖尿病及糖尿病腎病關系密切的基因有胰島素受體底物2基因(IRS2)、絲裂原活化蛋白激酶的激酶基因[5]。本研究結果顯示，DN組血清miR377表達量明顯高于健康人群，同時也高于DM組患者，提示血清miR377與DN的進展有一定關系。本研究生物信息學預測顯示，miR377與腎臟纖維化和DN相關的SMAD信號通路基因為其潛在靶基因。為進一步研究，本研究采用人腎系膜細胞系，上調HMC細胞miR377水平后，發(fā)現(xiàn)SMAD2和SMAD3蛋白表達量增加。

轉化生長因子 TGFβ/Smad 信號通路所屬蛋白家族大，參與功能多，機制復雜，是被廣為研究的一條信號通路，它與 DN 的發(fā)生、發(fā)展有著密切關系。通過 TGF-β/Smad 信號通路，Smad蛋白家族可誘導腎小球細胞增生和肥大，使細胞外基質增多，致腎小球硬化及腎間質纖維化，以此促使 DN 的不可逆進展[13]。Smad蛋白蛋白家族介導了 TGF-β 信號的轉導，是唯一所知的 TGF-β 受體的胞內激酶底物[14]。多項研究報道TGF-β/Smad信號通路在糖尿病腎病的腎纖維化等過程。Sun等[15]報道紫杉醇通過調節(jié)miR192基因啟動子序列，抑制miR192基因介導的TGF-β/Smad通路的激活，從而抑制慢性腎病的纖維化過程。有研究通過對高低糖培養(yǎng)的人腎小球系膜細胞進行芯片檢測，發(fā)現(xiàn)高表達miR377可引起DN纖維粘連蛋白的增加從而對DN產(chǎn)生作用[4]。

本研究表明，DN患者血清的miR377存在異常高表達，可能預示腎臟病變的程度，提示其有潛在的DN血清標志物特異性，其下游機制可能是激活TGF-β/Smad通路，增加SMAD2和SMAD3蛋白表達量的表達。檢測血液中DN特異性的miRNA并將其作為DN的生物學指標，這對于早期診斷和早期治療DN可能具有重要的生物學意義[16]。為進一步研究miR377在糖尿病腎病中的功能，將通過體內動物實驗，更好地研究其調控的分子機制。

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Mirna377 expression in serum of patients with diabetic nephropathy and the role of SMAD signaling pathway

Ji Zhenzhong1,Hu Zhengguo1△,Xu Yancheng2

(1.DepartmentofIntergratedWards;2.DepartmentofEndocrinology,ZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China)

ObjectiveTo explore the characteristics of patie nts with diabetic nephropathy serum miRNA377(miR377) expression and the possible regulation of downstream channels.MethodsReal-time PCR method to detect biopsy-confirmed DN group,diabetes without kidney damage group (DM) and serum of healthy people relative expression of miR377,with the TargetScan bioinformatics method for predicting the miR377 target gene regulation and raised miR377 expression in vitro model,the detection mechanism downstream protein.ResultsCompared with healthy control patients(0.33±0.06),patients with diabetic nephropathy(1.32±0.13) in serum miR377 expression (P<0.01),diabetes without kidney damage group(0.92±0.11) miR377 is also highly expressed (P<0.01),bioinformatics analysis showed that diabetic nephropathy the miR377 target genes of SMAD;Western blot showed transfected miR377 mimics group HMC cells SMAD2 and SMAD3 protein expression levels higher than miR377 NC group and the control group (P<0.05),while SMAD7 The expression in each group had no significant difference (P>0.05) amount.ConclusionThe patients with diabetic nephropathy serum miR377 expression exists abnormally high level,may indicate kidney disease,the mechanism may be activated TGF-β / Smad pathway and increased expression of SMAD2 SMAD3 protein expression.

diabetic nephropathies;microRNAs;computational biology;miRNA377;SMAD;prognosis

季振中(1984-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事糖尿病分子生物學研究?！?/p>

，E-mail:Huzg811@163.com。

·生物信息學·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.026

R587.1

A

1671-8348(2016)27-3824-03

2016-02-17

2016-04-06)