徐志彬，袁　麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院內(nèi)鏡科，石家莊 050011)

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論著·臨床研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.010

食管癌變進程中間質(zhì)成纖維細胞的表型變化*

徐志彬，袁麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利△

(河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院內(nèi)鏡科，石家莊 050011)

目的研究在食管正常上皮歷經(jīng)癌前病變發(fā)展到食管鱗狀細胞癌的過程中，食管間質(zhì)中的成纖維細胞的α-SMA表型變化。方法免疫組化法分析20例正常食管組織、80例食管癌前病變組織及50例食管癌組織標本中食管間質(zhì)成纖維細胞α-SMA的表達，細胞培養(yǎng)3種食管間質(zhì)成纖維細胞，純化后行細胞免疫染色，RT-PCR法檢測三種食管間質(zhì)成纖維細胞α-SMA的表達。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示，α-SMA在正常食管、食管癌前病變和食管癌組織間質(zhì)成纖維細胞中的表達具有明顯差異；RT-PCR法顯示，3種食管間質(zhì)成纖維細胞在mRNA α-SMA的表達量上具有明顯差異。結(jié)論食管間質(zhì)成纖維細胞隨癌變進展會逐步發(fā)生活化，食管癌相關(guān)纖維母細胞可能是由正常的食管成纖維細胞發(fā)展至不典型增生成纖維細胞，再逐步惡變發(fā)展而來。

食管腫瘤；間質(zhì)細胞；間質(zhì)成纖維細胞；癌變；表型

雖然腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由自身的基因結(jié)構(gòu)及其表達的改變而導致的，但是腫瘤所處的間質(zhì)微環(huán)境在腫瘤的發(fā)展中起著舉足輕重的作用，亦不能被忽視。成纖維細胞是腫瘤基質(zhì)中最重要、最主要的細胞成分，活化后獲得平滑肌表型的成纖維細胞被稱為癌相關(guān)纖維母細胞(cancer-associated fibroblasts，CAFs)。學者們對多種實體腫瘤中的CAFs進行了研究，包括其免疫表型及生物學特性及功能，以及其與癌細胞的相互作用機制。本實驗重點研究正常的食管間質(zhì)成纖維細胞、食管不典型增生成纖維細胞以食管及癌相關(guān)纖維母細胞的形態(tài)特點及其免疫表型的變化，探討不典型增生間質(zhì)成纖維細胞是否為處于正常成纖維細胞與癌相關(guān)纖維母細胞之間的過渡階段。

1　資料與方法

1.1一般資料根據(jù)2008年WHO食管上皮性腫瘤診斷分類標準，選取河北省腫瘤醫(yī)院2010～2012年的食管癌前期病變標本80例，同時50例食管癌組織標本蠟塊和20例賁門癌標本的陰性上殘作為研究對象。150例入選，其中男84例，年齡50～76歲，平均(58.0±5.5)歲；女66例，年齡48～75歲，平均(62.0±6.5)歲。隨機抽取3組患者各5例行細胞培養(yǎng)。試劑：CK鼠抗人細胞單克隆抗體， Vimentin鼠抗人單克隆抗體，α-SMA鼠抗人單克隆抗體，濃度為1∶50，以上產(chǎn)品均由北京西雅金橋生物技術(shù)有限公司提供。RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone)，D-Hanks液，胰蛋白酶粉(美國Sigma公司)，膠原酶Ⅱ(美國Gibco公司)，基因及內(nèi)參照β-actin 的引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)，Oligo(dT)15/10 mmol/L dNTPs/RNase-inhibitor(日本Toyobo公司),Matrigel Basement Membrane Matrix(美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1一步法免疫組化染色陽性對照選擇陽性的人癌組織切片，陰性對照選擇PBS液。

1.2.2細胞培養(yǎng)將組織轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶，于 37℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中進行消化，顯微鏡下窺見獨立的細胞即終止消化，一般正常組織消化約為70 min，癌前病變組織消化約為90 min，癌組織消化約為100 min，細胞收集→過濾→離心→洗滌→離心→制備細胞懸液→計數(shù)→接種后，再向培養(yǎng)瓶中置入胰蛋白酶-EDTA混合液，消化1 min后，用吸管輕輕吹打瓶底，收集細胞，制備細胞懸液，接種培養(yǎng)。將制作好的細胞爬片固定于載玻片上，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS液漂洗3次，每次5 min，10%牛血清封閉30 min，加α-SMA一抗，37℃孵育1 h，PBS漂洗3次，每次5 min，加二抗，孵育30 min，PBS漂洗3次，5 min，DAB顯色，室溫反應(yīng)10 min，水洗1 min，2次，蘇木素復染1 min，水洗10 min，95%乙醇脫水，封片。用已知陽性細胞爬片做陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)液代替一抗做陰性對照。細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒即可判定為染色陽性。

1.2.3RT-PCR提取總的RNA：長滿細胞的75 mL培養(yǎng)瓶棄去培養(yǎng)基后用PBS液洗2次，再加1 mL Trizol裂解液裂解細胞，將裂解細胞液移入Ep 管中，室溫條件下靜置5 min后加入 0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，室溫下靜置 2～3 min,4 ℃條件下 12 000 r/min離心15 min，溶液層析為3層，將最上層的無色液體含移至另一EP 管中，加入等量異丙醇后顛倒混勻；經(jīng)冰浴15 min，在4℃下12 000 r/min 離心15 min后棄去上清液，加75%乙醇1 mL振搖混勻后，在4℃下7 500 r/min 離心5 min棄上清液，室溫下于空氣中干燥 5 min，加入20～30 μL無RNA 酶水，紫外分光光度儀測定RNA的A260/A280比值，1.8～2.0較好。逆轉(zhuǎn)錄體系： 總RNA 1 μg，Oligo(dT)15Primer 1 μL，5×Reaction buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，Ribolock RNase inhibitor 1 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL。將以上試劑依次加入200 μL的PCR管中，補足無RNase水，總體積12 μL，將上述試劑混勻，置于PCR儀上，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min，終止反應(yīng)。引物序列全長選自Pubmed基因庫，引物序列是由上海英駿生物有限公司合成、設(shè)計并合成，經(jīng)GenBank核實。Alpha-SMA、Vimentin及內(nèi)參β-actin的引物序列和PCR擴增產(chǎn)物長度見表1。

1.3判定標準α-SMA陽性判斷標準：按照王立峰等[6]的標準，以間質(zhì)成纖維細胞胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，觀察5個具有代表性的高倍視野(×400)，根據(jù)陽性范圍：無明顯陽性細胞為(-)，局灶陽性者判定為(+)，彌漫陽性者判定為(++)，為便于統(tǒng)計，將(+)和(++)合并為陽性。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以率或百分比表示，均數(shù)的比較用t檢驗，率的比較用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)　果

2.1食管癌變進程中間質(zhì)成纖維細胞的α-SMA表達情況α-SMA在正常食管間質(zhì)成纖維細胞中基本不表達(0/20)，可表達于平滑肌細胞和血管平滑肌細胞；癌前病變組、癌組的表達率分別為26%(21/80)、76%(38/50)；陽性的食管間質(zhì)成纖維細胞多呈梭形或條帶樣，多分布于癌前病變或癌團周圍間質(zhì)中，在進展期癌組織中可見條索狀成纖維細胞包裹癌巢。本組結(jié)果顯示，間質(zhì)成纖維細胞α-SMA的陽性表達率隨著食管癌變進展呈逐漸上升趨勢，組間陽性表達率差異有統(tǒng)計學意義，與正常組比較，食管癌前病變組和食管癌組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

表1　引物序列和PCR擴增產(chǎn)物長度

2.2細胞免疫染色結(jié)果食管正常成纖維細胞(NFs)中α-SMA染色為陰性，食管不典型增生成纖維細胞(AFs)和食管CAFs細胞質(zhì)中可見α-SMA的陽性染色。而Vimentin在3種食管間質(zhì)成纖維細胞中均為陽性表達，CK在3種食管間質(zhì)成纖維細胞中均為陰性表達(圖2～4)。

A：α-SMA 在正常組織成纖維細胞的陰性表達；B:α-SMA 在上皮內(nèi)瘤變組織中成纖維細胞的陽性表達；C:α-SMA 在食管癌組織中的陽性表達。

圖1α-SMA在食管癌變過程中間質(zhì)成纖維細胞的表達(IHC,×200)

A：Vimentin在NFs的陽性表達；B：Vimentin在AFs的陽性表達；C:Vimentin在CAFs的陽性表達。

圖2Vimentin在三種食管間質(zhì)成纖維細胞的表達(IHC,×100)

A：α-SMA在NFs的陰性表達；B：α-SMA在AFs的陽性表達；C:α-SMA在CAFs的陽性表達。

圖3α-SMA在三種食管間質(zhì)成纖維細胞的表達(IHC,×100)

A：CK在NFs的陰性表達；B：CK在AFs的陰性表達；C:CK在CAFs的陰性表達。

圖4CK在3種食管間質(zhì)成纖維細胞的表達(IHC,×100)

2.33種食管間質(zhì)成纖維細胞的Vimentin、α-SMA基因表達從NFs→AFs→CAFs，Vimentin的表達無明顯變化，α-SMA的表達逐漸增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5～6。

圖5　Vimentin、α-SMA在3種食管間質(zhì)成纖維細胞的表達

圖6　3種食管間質(zhì)成纖維細胞mRNA α-SMA的測定

3　討　論

腫瘤間質(zhì)微環(huán)境已經(jīng)成為腫瘤研究熱點之一。CAFs指存在于腫瘤間質(zhì)微環(huán)境中的活化纖維母細胞[1]。與正常成纖維細胞相比，CAFs已發(fā)生表型改變，主要表現(xiàn)為間質(zhì)成纖維細胞CD34的表達缺失，取而代之的是α-SMA、波形蛋白(vimentin)、成纖維細胞活化蛋白、成纖維細胞特異蛋白等表面蛋白的陽性表達。關(guān)于多種實體腫瘤的CAFs研究證實：α-SMA陽性表達是高發(fā)事件[2-4]。由靜止的正常成纖維細胞發(fā)展到活化的CAFs期間是否存在半活化的狀態(tài)，尚未得到證實。

關(guān)于癌旁纖維母細胞的起源學者們意見不一，有的學者認為CAFs是由腫瘤細胞經(jīng)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymaltransition，EMT)而來，血管平滑肌細胞和周細胞也可能是CAFs來源之一，大多數(shù)的觀點認為CAFs是由間質(zhì)既存的成纖維細胞活化而來[5-6]。本組免疫研究結(jié)果顯示，正常組α-SMA表達為陰性，而進展期癌組中的α-SMA表達率高達76%，明顯高于正常組。值得一提的是，本研究中的癌前病變也出現(xiàn)了α-SMA的陽性染色，表達率為26%，鏡下可觀察到，緊鄰異型細胞的間質(zhì)成纖維細胞更容易出現(xiàn)α-SMA陽性，呈絲帶狀分布。本研究對從正常組、癌前病變組、進展期癌組分離、提取、培養(yǎng)的間質(zhì)成纖維細胞進行了α-SMA免疫染色和mRNAα-SMA的半定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：NFs中α-SMA染色近乎陰性，mRNA檢測量極低，而AFs和CAFs的α-SMA染色均為陽性，mRNA檢測值呈逐漸增高的趨勢。以上結(jié)果提示：在食管癌變進程中，正常的食管間質(zhì)成纖維細胞是處于靜止期的，而在食管上皮受到外界刺激而基因突變時，間質(zhì)被動的做出應(yīng)答，與惡變上皮細胞臨近的間質(zhì)成纖維細胞逐步發(fā)生了活化，不典型增生成纖維細胞與癌旁纖維母細胞mRNAα-SMA的表達越來越強，腫瘤間質(zhì)中的成纖維細胞可能是由最初的靜止期正常成纖維細胞經(jīng)半活化的不典型增生間質(zhì)成纖維細胞而來。研究證實，腫瘤間質(zhì)成纖維細胞α-SMA的表型獲得與轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)密切相關(guān)，TGF-β1能下調(diào)纖維細胞CD34的表達，促進α-SMA的表達，誘導CD34細胞凋亡可能是其機制之一，而TGF-β1是可以由腫瘤細胞和癌旁纖維母細胞大量分泌的[7-9]。

腫瘤的發(fā)生機制目前尚不完全清楚，普遍認為，在癌變過程中上皮細胞的基因突變是主動的，間質(zhì)反應(yīng)只是被動地做出應(yīng)答。以往有研究將已經(jīng)發(fā)生了癌前病變的口腔上皮組織去掉，將其黏膜下層結(jié)締組織與正常的口腔上皮組織貼合后發(fā)現(xiàn)，正常的口腔上皮會發(fā)生異型性改變，可見間質(zhì)成纖維細胞在腫瘤的發(fā)生中扮演的不僅是被動的角色，本研究中間質(zhì)成纖維細胞在癌前病變時即可發(fā)生活化的現(xiàn)象也恰恰證實了這一觀點。由此可見食管癌變進程中間質(zhì)成纖維細胞的表型變化具有非常重要的意義。

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Change of phenotype of stromal fibroblasts in esophageal carcinogenesis*

Xu Zhibin,Yuan Li,Zheng Xiuli,Wang Shijie,Wu Mingli△

(DepartmentofEndoscopy,theFourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,Hebei050011,China)

Objective To investigate the expressions of α-SMA in different esophageal stromal fibroblasts in esophageal carcinogenesis.MethodsIHC method was uesd to detect the expression of α-SMA protein in stromal fibroblasts of twenty normal esophageal tissues,eighty precancerous lesions and fifty esophageal carcinomas respectively.Three kinds of esophageal stromal fibroblasts were cultured primarily and cells immunohistochemical staining was carrired out after being purified.Expression of α-SMA was detected by RT PCR.ResultsIHC results showed that α-SMA expressions in normal,precancerous and cancerous lesions were of significant differences.RT-PCR results showed that α-SMA expressions were different significantly among three kinds of fibroblasts.ConclusionEsophageal stromal fibroblasts were activated with carcinogenensis.AFs was possibly the origion of CAFs.

esophageal neoplasms;stromal cells;stromal fibroblast;carcinogenesis;phenotype

河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學科學研究重點課題計劃(20160656)。作者簡介：徐志彬(1976-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事食管癌早診早治研究?！?/p>

，E-mail:xzblxh@sina.com。

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1671-8348(2016)27-3777-03

2016-03-11

2016-05-26)