陸　曉，冼　磊

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧 530021)

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·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.002

TCF21基因?qū)Ψ蜗侔〢549細胞DDP化療及放療敏感性的影響*

陸曉，冼磊△

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心胸外科，南寧 530021)

目的為探討轉(zhuǎn)錄因子21(TCF21)基因?qū)θ朔伟〢549細胞放化療敏感性的影響。方法利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在肺癌A549細胞中高表達TCF21基因，以熒光定量PCR、Western blot分析目的基因的表達，用四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測高表達TCF21肺腺癌A549細胞對順鉑(DDP)化療敏感性的影響，平板克隆實驗檢測高表達TCF21肺腺癌A549細胞對放療敏感性的影響。結(jié)果在72 h時，隨著DDP濃度的增高(0、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/L)，各組細胞的抑制率相應(yīng)增高，高表達組各個藥物濃度時的抑制率明顯高于空載體組與未轉(zhuǎn)染組(P<0.05)，而后兩者之間無明顯差異；過表達TCF21組隨著藥物濃度及時間及的增加，高表達組抑制率相應(yīng)增高(P<0.05)；接受X照射后，未轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染+放療組、空載體組、空載體+放療組、高表達組及高表達+放療組克隆形成率分別為：95.17%±2.85%、88.20%±2.03%、93.80%±4.17%、85.60%±2.42%、71.67%±3.21%、56.00%±2.65%。結(jié)論TCF21基因高表達能顯著增強肺癌A549細胞對放療及DDP化療敏感性。

肺腫瘤；放射療法；藥物療法；A549；TCF21；敏感性

肺癌發(fā)病率和病死率均占惡性腫瘤的第一位[1]。其中約85%～90%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。由于大部分患者就診時已處于中晚期，存在局部及遠處轉(zhuǎn)移，放、化療作為綜合性治療的一部分，是臨床上肺癌主要治療方法之一。轉(zhuǎn)錄因子21(transcription factor 21,TCF-21)基因是近幾年開始研究的一個較新的基因，位于人染色體6q23-q24，屬于基本螺旋環(huán)螺旋轉(zhuǎn)錄因子(basic helix-loop-helix transcription factors,bHLH)家族。bHLH家族的轉(zhuǎn)錄因子具有中胚層特異性，對中胚層組織細胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤發(fā)生發(fā)揮重要作用[2]。研究表明TCF-21的表達與多種腫瘤(頭頸部腫瘤、肺癌、腎透明細胞癌、黑色素瘤、胃癌)的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3-7]，但其作用的具體機制尚不明朗。本實驗觀察了TCF21基因?qū)Ψ切〖毎伟┘毎?A549)順鉑(DDP)化療以及放療敏感性增敏作用并探討機制，初步判斷TCF21基因是否能作為一種新的化療及放射增敏靶點用于臨床以便提高NSCLC 的5年生存率。

1　材料與方法

1.1實驗材料NSCLC 細胞株(A-549)由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室提供；RPMI 1640、10%胎牛血清購于Hyclone公司；兔抗人多克隆抗TCF21抗體購自Abcam公司(ab32981)；順鉑購于美國Sigma公司，熒光定量PCR儀(Step one plus)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人肺腺癌A549細胞株，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(并添加1%的青霉素鏈霉素)于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2慢病毒轉(zhuǎn)染及細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株篩選將細胞分為高表達組 (含目的基因TCF21高表達組)、空載體組(陰性對照組)和未轉(zhuǎn)染組(即未處理組)，轉(zhuǎn)染試劑由上海吉凱基因公司提供。轉(zhuǎn)染流程按照吉凱基因公司說明書進行。轉(zhuǎn)染前8 h取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞濃度為每毫升3×104個，取A549細胞100 μL接種至96孔板，總液體量為每孔2 mL；待細胞融合率達到50%～60%時開始轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染MOI值為50；8字混勻后于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染10 h后將液體換為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。待細胞處于對數(shù)生長期，在高表達組和空載體組分別加入終濃度為2 μg/mL的puromycin，7 d后puromycin濃度減半，藥物篩選約15 d后，隨機選取多個視野，分別計數(shù)白光與熒光條件下的可見細胞數(shù)，通過相同視野中熒光條件下可見細胞數(shù)與白光條件下可見細胞數(shù)之比計算平均轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測細胞中TCF21的表達AxyGen RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，取1 μg RNA作為模板進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參，使用TIANGEN生物公司的SYBR Green Master Mix進行熒光定量PCR。PCR進行40個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為(94℃ 10 min,54.5℃ 30 s,72℃ 32 s)引物如下:TCF21上游5′-CCA GCT ACA TCG CCC ACT TG-3′，下游5′-CTT TCA GGT CAC TCT CGG GTT TC-3′，GAPDH上游5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，下游5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′。反應(yīng)體系為:SYBR super Mix熒光混合物10 μL，模板混合液(上、下游引物)1 μL，水8 μL，cDNA 1 μL。RT-PCR結(jié)果分析，采用相對定量法檢測轉(zhuǎn)染組與對照組之間的差異化表達，以GAPDH作為內(nèi)參照。根據(jù)擴增曲線，按照2-ΔΔCt法通過管家基因GAPDH進行校正。

1.2.4Western blot檢測細胞中TCF21蛋白的表達提取各組細胞中的總蛋白。蛋白跑膠(SDS-PAGE：5%濃縮膠，10%分離膠)后轉(zhuǎn)膜至0.22 μm的PVDF膜上。5%牛奶封閉0.5 h，4℃孵育TCF21(1∶2 000稀釋)和GAPDH(1∶5 000稀釋)一抗過夜。充分洗膜后室溫孵育二抗1 h，再次洗膜后進行ECL發(fā)光，柯達膠片顯影、定影。

1.2.5四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測高表達TCF21后A549細胞對化療藥物的敏感性取培養(yǎng)各組細胞，分別細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為每毫升3×104。胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL,培養(yǎng)8 h 細胞貼壁后分別加入DDP至終濃度0、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/L，每組各設(shè)5復(fù)孔。置37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)24、48、72、96 h后，各孔加MTT 20 μL。上述條件繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液后,每孔加二甲基亞砜溶液(DMSO)150 μL終止反應(yīng),微量振蕩器振蕩10 min,置酶標儀設(shè)置在570 nm下,測定各孔的吸光度A值。藥物對腫瘤細胞抑制率計算公式:藥物對腫瘤細胞抑制率= [1-(藥物孔平均A值/腫瘤細胞陰性對照孔平均A值)]×100%[8]。

1.2.6平板克隆形成實驗檢測高表達TCF21對A549細胞放療敏感性的影響取培養(yǎng)的各組細胞分別計數(shù)，取400個細胞接種于6 孔板中，補充含10%胎牛血清的1640至每孔2 mL，每組細胞接種3孔。8 h貼壁后接受2 Gy 的X 線照射(照射條件：6 MV光子線，源皮距(SSD)為100 cm,照射野10 cm×10 cm，劑量DT =2 Gy，射野覆蓋全細胞培養(yǎng)板)，然后置于37℃，體積分數(shù)為5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d， 甲醇固定，結(jié)晶紫染色，低倍鏡下計數(shù)大于50 個細胞的克隆，以上實驗重復(fù)3 次取均數(shù)。實驗計算克隆形成率(%)=細胞克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100 %。

2　結(jié)　果

2.1TCF21高表達慢病毒成功轉(zhuǎn)染細胞為檢測慢病毒轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)染效率，運用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染后經(jīng)篩選的穩(wěn)轉(zhuǎn)株進行觀察計數(shù)。高表達組和空載體組均可見綠色熒光蛋白表達，且平均轉(zhuǎn)染效率為85%(圖1)。

圖1　TCF21在肺癌細胞A549中的表達(×160)

2.2RT-PCR檢測TCF21基因mRNA的表達水平為檢測TCF21是否成功高表達，對轉(zhuǎn)染后經(jīng)篩選的穩(wěn)轉(zhuǎn)株進行了熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明高表達組mRNA表達量(20 452.65±190.12)遠高于未轉(zhuǎn)染組和空載體組的TCF21 mRNA表達量(1.00±0.21和0.75±0.16，P<0.05，圖2A)。

2.3Western blot檢測TCF21蛋白的表達水平為檢測TCF21蛋白是否成功高表達，采用Western blot技術(shù)檢測各組細胞中TCF21蛋白表水平。結(jié)果表明相較于未轉(zhuǎn)染組，高表達組TCF21蛋白表達量明顯增高，而空載體組和未轉(zhuǎn)染組均未見明顯TCF21蛋白表達。這與熒光定量PCR的檢測結(jié)果一致，進一步說明肺腺癌A549細胞中成功高表達了TCF21(圖2B)。

2.4MTT法檢測高表達TCF21對肺腺癌A549細胞DDP化療敏感性的影響為檢測高表達TCF21對肺腺癌A549細胞DDP化療敏感性的影響，對不同濃度DDP、不同時間作用后的各組細胞采用MTT法進行了細胞活性檢測。實驗結(jié)果顯示：在72 h時，隨著DDP濃度的增高(0、0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/L)，除藥物濃度為0 mg/L外各組細胞的抑制率相應(yīng)增高(表1)，且高表達組各個藥物濃度時的抑制率相較于空載體組與未轉(zhuǎn)染組均明顯增高(P<0.05)，而后兩者之間無明顯差異；且過表達TCF21組隨著藥物濃度及時間及的增加，除藥物濃度為0 mg/L外各時間段抑制率相應(yīng)增高(表2，P<0.05)。說明TCF21能增強肺腺癌A549細胞對DDP化療敏感性(圖3)。

A：熒光定量PCT;B:Western blot檢測。

圖2熒光定量PCR及Western blot檢測TCF21在各組中的表達

A:72h時不同濃度DDP對各組細胞化療敏感性的影響(n:未轉(zhuǎn)染組；-：空載體組、+：高表達組)；B：不同濃度DDP及不同時間對高表達TCF21組化療敏感性的影響。

圖3MTT檢測DDP對化療敏感性的影響

A、B、C未接受X線照射，D、E、F接受X線照射。

圖4　平板克隆實驗檢測高表達TCF21對A549細胞放療敏感性的影響(結(jié)晶紫×80)

2.5平板克隆形成實驗檢測高表達TCF21對A549細胞放療敏感性的影響為檢測高表達TCF21對A549細胞放療敏感性的影響，采用平板克隆形成實驗對接受2 Gy的X線照射后的各組細胞進行了增殖活性檢測。結(jié)果表明：2周后，未轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染+放療組、空載體組、空載體+放療組、高表達組及高表達+放療組克隆形成率分別為：95.17%±2.85%、88.20%±2.03%、93.80%±4.17%、85.60%±2.42%、71.67%±3.21%、56.00%±2.65%。實驗結(jié)果顯示高表達組細胞克隆形成率低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

表2　實驗組不同藥物濃度DDP及不同藥物作用時間對各組細胞的抑制率±s)

3　討　論

肺腺癌在我國的發(fā)病率有上升趨勢,已成為我國最常見的病理類型。肺腺癌約占原發(fā)性肺癌的50%，但其發(fā)生機制尚不明朗。研究表明多種抑癌基因(如p53、PTEN、Rb等)啟動子異常甲基化導(dǎo)致基因表達異常與肺癌發(fā)生密切相關(guān)[9-13]。TCF21是新進發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。研究表明TCF21在多種腫瘤中存在啟動子區(qū)域甲基化，且其在腫瘤組織中的表達量較正常組織明顯降低。本課題組前期研究表明抑癌基因TCF21可抑制A549細胞的增殖和遷移、誘導(dǎo)凋亡[14]。

當(dāng)前LAC 的治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療等。但肺癌的多重耐藥(multi-drug resistance，MDR)一直嚴重影響著LAC 的化療效果和預(yù)后。臨床多以聯(lián)合化療、聯(lián)合放療等來提高治療效果。同時作用強而毒副作用較小的放、化療增敏劑越來越受到大家的關(guān)注。

TCF-21屬于bHLH家族成員。bHLH蛋白在HLH區(qū)域構(gòu)成非共價二聚體，形成一對DNA結(jié)合基序，竟而結(jié)合至E盒(CANNTG)的共同DNA序列，通過調(diào)節(jié)在多種發(fā)育相關(guān)基因的啟動子和(或)增強子而發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活或阻抑作用[15]。對TCF21基因所屬的bHLH家族研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的bHLH轉(zhuǎn)錄因子DEC1/2突變或缺失與多種腫瘤如口腔癌、乳腺癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移特征密切相關(guān)[16-23]。DEC1/2作為PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑的靶基因調(diào)節(jié)c-Myc的表達參與乏氧誘導(dǎo)的細胞增殖[24]。還有研究發(fā)現(xiàn)，TCF-21基因作為腎母細胞瘤抑制基因1(Wilms′ tumour suppressor gene 1,WT1)基因的下游，WT1可直接結(jié)合TCF-21上游區(qū)域調(diào)控TCF-21基因的表達[25]。而WT1可通過PI3K/AKT信號通路影響DDP對肺癌的化療敏感性[25]。

眾所周知，PI3K/AKT信號通路在正常生理和致癌過程對細胞增殖、分化起著重要作用。此外，異常的激活PI3K/AKT/mTOR途徑是獲得性耐藥的機制之一[25-26]。由于TCF-21基因所屬的bHLH家族中的經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子是PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑的一個重要的靶基因，而且TCF-21基因有可能通過PI3K/AKT信號通路影響DDP對肺癌的化療敏感性。因此，作者提出假設(shè)：TCF-21有無可能是通過PI3K/AKT信號通路影響腫瘤細胞的增殖，也通過PI3K/AKT信號通路影響DDP對肺癌的化療敏感性？

本研究通過體外細胞培養(yǎng)進一步探索TCF21高表達對肺腺癌A549細胞DDP化療及放療敏感性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCF21基因高表達能顯著增強肺癌A549細胞對放療及DDP化療敏感性。那么TCF21是否是通過PI3K/AKT信號通路影響DDP對肺癌的化療敏感性，這一猜想尚需實驗證實。另一方面，作為癌癥中頻繁被激活的信號通路之一，PI3K/AKT通路在多種癌癥中表達異常。那么TCF21是否通過PI3K/AKT通路實現(xiàn)抑癌作用，這需要進一步拓展研究。

本研究通過肺腺癌細胞株A549體外細胞培養(yǎng)來探索TCF21高表達對肺腺癌A549細胞順鉑化療及放療敏感性的影響，問題在于體外細胞實驗不能夠完全模擬體內(nèi)生理環(huán)境，故實驗存在一定的局限性。對于本研究中TCF21基因高表達引起的放、化療增敏作用，為進一步確定其準確性，應(yīng)該進一步檢測細胞增殖和凋亡相關(guān)mRNA及蛋白的表達量，以及小鼠體內(nèi)實驗。這也為后期研究留下了空間。

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The effects of TCF21 genes on radiation and chemotherapy sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells*

Lu Xiao,Xian Lei△

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning,Guangxi530021,China)

ObjectiveTo investigate the transcription factor 21 (transcription factor 21,TCF21) gene on human lung cancer A549 cells sensitivity to chemotherapy.MethodsUsing lentivirus technology in A549 lung cancer cells highly expressed genes TCF21,fluorescence quantitative PCR,Western Blot analysis were used to analyse the expression of the target gene,MTT assay was used to detect the effect of TCF21 lung adenocarcinoma A549 cells on cisplatin (cis-Dichlorodiamineplatinum,DDP) chemosensitivity,and colony assay was used to detect the effect of overexpression of TCF21 lung adenocarcinoma A549 cells on radiosensitivity.ResultsAfter 72 h,with the increasing concentration of DDP (0,0.625,1.250,2.500,5.000,10.000 mg/L),corresponding inhibition rates in each group increased,and the inhibition rate of the high expression group was significantly higher in empty vector group and untransfected group (P<0.05),no significant difference between the two then;overexpression TCF21 group with drug concentration and time and increase the rate of high expression inhibition corresponding increase (P<0.05) ;after receiving X radiation,non-transfected group,untransfected plus radiotherapy group,vector group,vector plus radiotherapy group,high expression and high expression + radiotherapy colony formation rates were:95.17%±2.85%,88.20%±2.03%,93.80%±4.17%,85.60%±2.42%,71.67%±3.21%,56.00%±2.65%.ConclusionTCF21 gene expression can significantly enhance the sensitivity to radiotherapy and chemotherapy DDP A549 lung cancer cells.

lung neoplasms;radiotherapy;chemotherapy;A549;TCF21;sensitivity

廣西自然科學(xué)基金資助項目(2013GXNSFAA019270)。作者簡介：陸曉(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事肺癌基礎(chǔ)與臨床研究?！?/p>

，E-mail:xianlei59@163.com。

R734.2

A

1671-8348(2016)27-3748-05

2016-02-18

2016-04-06)