林德麟，陳　婷，黎　夢，謝梅英，習欠云，孫加節(jié)，張永亮

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

?

乳中miRNA的研究進展

林德麟，陳婷，黎夢，謝梅英，習欠云，孫加節(jié)，張永亮*

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

外泌體(Exosome)存在于動物的各種體液中，如乳汁、血液、尿液等，其中包含的蛋白質(zhì)、mRNAs、micro-RNAs、脂類等物質(zhì)，可進入受體細胞而發(fā)揮生理作用。近幾年有不少關(guān)于動物體內(nèi)各種miRNA的研究，而針對乳exosome中miRNA的研究卻相對較少。本文通過對一些已有報道的收集整理，從整體上證實了乳汁中存在miRNA且富集于exosome中，并對比不同動物乳中高表達的miRNA的異同，重點關(guān)注exosome中高表達的miRNA，并得出一般性結(jié)論。此外，本文還分析了乳中miRNA的其他存在形式，并討論miRNA在不同動物乳中的保守性及其可能的生理學作用。

乳；exosome；miRNA

乳汁是哺乳動物出生后的第一種且是最主要的營養(yǎng)物質(zhì)來源，乳汁中包含復(fù)雜的營養(yǎng)成分，能促進個體的生長和發(fā)育，特別是初乳中的免疫球蛋白對新生兒更具生理意義，而對乳的研究在食品學和營養(yǎng)學中已經(jīng)相當豐富。Exosome(外泌體)最早是由R.M.Johnstone等[1]在研究網(wǎng)織紅細胞向成熟紅細胞轉(zhuǎn)變過程中在體外培養(yǎng)的羊網(wǎng)織紅細胞上清液中分離出來的一種30～100 nm的膜性小囊泡，這種小囊泡可以包裹mRNA、microRNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等物質(zhì)并通過胞吞、融合等方式把內(nèi)容物釋放到受體細胞內(nèi)發(fā)揮生理作用。Exosome作為細胞間通訊的媒介之一，有著巨大的生物價值，體現(xiàn)在在醫(yī)學上可作為某些疾病[2-3]或癌癥[4-5]的生物標記；其還能作為基因的載體，在治療效果、靶向能力、免疫反應(yīng)、安全性上都優(yōu)于傳統(tǒng)基因治療的候補載體，如病毒載體、PEI納米顆粒和脂質(zhì)體等[6]。

microRNA(以下簡稱miRNA)是一類由18～24個核苷酸組成的具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼RNA，其廣泛存在于真核生物中。編碼miRNA的基因最初產(chǎn)生一個長的pri-RNA分子，這種初期分子必須被剪切成約70～90個堿基大小、具發(fā)夾結(jié)構(gòu)單鏈RNA前體(pre-miRNA)，并經(jīng)過Dicer酶加工后生成成熟的miRNA。miRNA通過與靶標基因不完全或完全互補結(jié)合，進而抑制翻譯或降解靶標mRNA而發(fā)揮作用。關(guān)于不同的miRNA在同一器官、組織中或同一miRNA在不同器官、組織中所起的作用已進行了較多的研究，而在不同器官、組織中某些miRNA與相關(guān)生理功能的關(guān)系已經(jīng)清晰；miRNA對基因表達的調(diào)控幾乎涉及到人類健康和疾病的所有方面[7-8]。但目前對于不同動物乳中miRNA的報道相對較少，而針對乳exosome中miRNA的研究則更少。本文在已有資料基礎(chǔ)上，對比不同動物乳中的miRNA，著重對比乳exosome中的miRNA，揭示在miRNA水平上不同動物之間的異同。

1　乳中存在miRNA

現(xiàn)已證實miRNA存在于各種體液中，如血清、血漿、尿液、唾液、胸腔積液等，其功能可能與周圍組織相關(guān)。J.A.Weber等[9]檢測到人體的12種體液中都存在miRNA，其中乳的總RNA濃度最高，所檢測到的miRNA數(shù)量也較高，相對于血液，乳中是富含miRNA的。其他報道也證實了乳中存在miRNA。T.Hata等[10]發(fā)現(xiàn)牛乳來源的微囊泡中含有mRNA和miRNA。Q.Zhou等[11]通過測序技術(shù)，確認了人乳exosome中存在452種pre-miRNAs，共可產(chǎn)生602種成熟miRNAs。X.Chen等[12]在牛乳中檢測到245種miRNAs，并通過對牛乳樣品的Solexa測序，發(fā)現(xiàn)其中有213種已知的miRNAs存在于常乳中，230種存在于初乳中，證實了初乳與常乳之間的miRNAs存在一定差異；且檢測結(jié)果顯示，雖然miRNAs在種類上血清多于乳汁，但qRT-PCR結(jié)果表明，7種能作為潛在的生物標記的miRNAs(miR-26a、miR-26b、miR-200c、miR-21、miR-30d、miR-99a、miR-148a)在牛乳中的表達量顯著高于在血清中，推測血液中部分miRNAs可能富集于乳中。N.Kosaka等[13]通過芯片分析，檢測出人乳中含有人已知的723種miRNAs中的281種，并證實在哺乳期內(nèi)基因的表達相關(guān)性較高，與免疫相關(guān)的miRNAs在哺乳期前6個月中表達量較高，且高于哺乳期后6個月；部分miRNAs在exosome中的表達量約為對照組的1.5倍，推測miRNAs可能富集于乳exosome中。Y.Gu等[14]報道了豬乳exosome中含有超過180種pre-miRNAs，其中包括140個已知的和40個新的pre-miRNAs，并報道了豬6個泌乳階段中乳exosome的miRNAs表達譜。T.Chen等[15]通過對豬初乳樣品的Solexa測序，發(fā)現(xiàn)了491種miRNAs，包括176種已知的miRNAs以及315種新的成熟miRNAs。H.Izumi等[16]報道了鼠的3個泌乳階段中乳清miRNAs表達譜，發(fā)現(xiàn)鼠的388種已知的miRNAs中有161種可以在乳清中檢測出來。A.C.Title等[17]在鼠胃乳凝塊樣品中發(fā)現(xiàn)有超過635種miRNAs，每個樣品平均含有506種miRNAs。

miRNA能存在于乳汁中，說明其必然有一種存在形式可防止被RNA酶所降解。有試驗證明，內(nèi)源性miRNA可以抵抗RNA酶、低pH和反復(fù)凍融所導(dǎo)致的降解，但對去污劑Triton X-100不耐受，可能是由于miRNA包裹于exosome里的原因[13，17-19]。miRNA除了通過細胞內(nèi)分選系統(tǒng)打包進入exosome這種方式外，有報道證實在血漿、血清中miRNA還能以與Ago2蛋白形成復(fù)合物的形式存在[20]。

2　不同動物乳exosome中高表達的miRNAs

乳汁通過2 000×g離心10 min后，能形成乳脂—上清液—沉淀3個分層；除去乳脂層和下層沉淀后，上清液通過12 000×g離心30 min可以沉淀細胞碎片；除去沉淀后，上清液通過100 000×g超速離心2 h，再用PBS洗滌2次，最后經(jīng)過100 000×g超速離心2 h，可得到exosome沉淀[13]。通過用Trizol或試劑盒對exosome進行miRNA的抽提，得到的總RNA可進行芯片分析或Solexa測序；或是將總RNA利用莖環(huán)引物或加尾試劑進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，最后進行qPCR等后續(xù)檢測。

T.Chen等[15]對測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)豬初乳exosome中有73種miRNAs的Count值超過100，有264種miRNAs的Count值低于100，并列出表達量最高的10種miRNAs(ssc-miR-193a-3p、ssc-miR-423-5p、ssc-miR-320、ssc-miR-181a、ssc-miR-30a-3p、ssc-miR-378、ssc-miR-191、ssc-let-7a、ssc-let-7f 和 ssc-let-7c)，這10種miRNAs在豬乳exosome中的表達量占總miRNAs的74.5%。Y.Gu等[14]列出了豬乳exosome中不同時期表達量最高的10種miRNAs，對應(yīng)豬的6個泌乳階段中的13種miRNAs(miR-148a-3p、miR-30a-5p、miR-25-3p、miR-182-5p、miR-30d-5p、miR-574-3p、miR-200c-3p、miR-30c-2-5p(-1-5p)、miR-191-5p、miR-375-3p、miR-27b-3p、miR-21-5p、ssc-let-7a-l-5p)，而每個階段表達量最高的10種miRNAs占全部234種miRNAs的比例從0 d的87.25%逐漸上升至28 d的93.46%，說明這10種高表達的miRNAs相當穩(wěn)定；其中，miR-148a-3p、miR-182-5p、miR-200c-3p、miR-25-3p、miR-30a-5p、miR-30d-5p和 miR-574-3p這7個miRNAs在6個階段中都位于前10位；miR-148a的表達量在6個階段都為最高，且隨著時間的增加而增加，從0 d的61.52%上升至28 d的78.99%，超過總量的一半，而其他9種的表達量百分比基本保持穩(wěn)定。Q.Zhou等[11]報道人乳exosome里表達量最高的10種miRNAs，分別是miR-148a-3p、miR-30b-5p、let-7f-1-5p(-2-5p)、miR-146b-5p、miR-29a-3p、let-7a-2-5p(-3-5p)、miR-141-3p、miR-182-5p、miR-200a-3p、miR-378-3p，這10種miRNAs占總量的62.3%，其中表達量最高的miR-148a占總量的約35.45%。X.Chen等[12]在牛乳中也有類似的報道。V.Modepalli等[21]以同屬哺乳綱而與人、豬、牛、鼠等屬不同亞綱的袋鼠為研究對象，證實了在不同的哺乳階段miR-148表達量也相對較高，且為乳特有的。H.Izumi等[22]列出了在牛乳exosome中表達量最高的50種miRNAs，其中通過芯片分析信號強度超過10的有11種，分別是miR-2478、miR-1777b、miR-1777a、let-7b、miR-1224、miR-2412、miR-2305、let-7a、miR-200c、miR-141和miR-2881，而miR-148a的信號強度也接近10，是第14個高表達的miRNA。

由以上信息推測miR-148家族中的miR-148a可能是所有哺乳動物母乳中含量較高的一種miRNA，這種高表達可能預(yù)示著其對于初生兒有著重要的生理功能。有報道認為，miR-148a因在哺乳期內(nèi)高且穩(wěn)定地表達，可作為牛乳[12]和人乳[11]品質(zhì)控制的一種潛在生物標志物。通過生物信息學分析，miR-148a與免疫和胃腸道健康有關(guān)，但具體作用機制尚不清楚。據(jù)研究報道，miR-148a可以負調(diào)控先天性免疫反應(yīng)和樹突狀細胞的抗原提呈功能[23]。此外，miR-148家族與正常組織的生長和發(fā)育、疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，并且可以參與靶基因的調(diào)控，如基因的增殖、分化、凋亡[24-25]。miR-148a可作為胃癌中的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子[26]；miR-148a的異位表達在結(jié)腸直腸癌細胞中可誘導(dǎo)細胞凋亡以及沉默Bcl-2[27]；在腸細胞分化過程中起上調(diào)作用[28]；靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b[29]；通過靶向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的蛋白編碼區(qū)直接下調(diào)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1，由此促進細胞的甲基化[30]。

3　不同動物之間乳exosome中miRNAs的對比

通過比較豬乳、人乳、牛乳exosome中表達量最高的10種miRNAs，發(fā)現(xiàn)三者miRNAs的種類組成相差較大(表1)。其中miR-148a在豬乳、人乳exosome中表達量都為最高，而在牛乳中則排在第14位；let-7a在豬乳、人乳、牛乳中都在前10，通過在miRBase 21.0里比對，發(fā)現(xiàn)雖然三者的前體序列不同，但成熟序列相同；miR-182-5p、miR-378、let-7f在豬乳、人乳中都在前10；miR-200c在豬乳、牛乳中都在前10；miR-141在人乳、牛乳中都在前10；let-7c在豬乳、牛乳中表達量都較高。此外，通過比較發(fā)現(xiàn)來源不同的豬乳樣品，其exosome中表達量最高的10種miRNAs 不完全相同(表1)，這可能與母豬品種、飼養(yǎng)水平、檢測方式等有關(guān)。而其中miR-191-5p都在前10內(nèi)。

通過對比發(fā)現(xiàn)，豬乳和牛乳兩者之間各種miRNAs的表達差別較大，這可能因為：(1)食性不同，豬為雜食動物，牛為草食動物；(2)消化方式不同，豬為單胃動物，牛為復(fù)胃動物。而對比兩種來源不同的豬乳中exosome里各自表達量最高的50種miRNAs，發(fā)現(xiàn)相同的有19種；再以牛乳exosome所含miRNAs與這19種miRNAs進行比較，發(fā)現(xiàn)在牛乳exosome里表達量最高的79種miRNAs中有11種對應(yīng)的miRNAs，數(shù)據(jù)如表2所示。表3羅列出牛乳exosome中表達量最高的50種miRNAs，再以兩種來源不同的豬乳exosome的miRNAs與其進行比較，發(fā)現(xiàn)在豬乳exosome(1)中能找到20種對應(yīng)的miRNA，且在排序上最高為第2位(ssc-miR-423-5p)，最低為第252位(ssc-miR-664-5p)；而在豬乳exosome(2)中能找到有23種對應(yīng)的miRNA，且在排序上最高是第1位(ssc-miR-148a-3p)，最低為第139位(ssc-miR-103-3p)。豬乳的兩組數(shù)據(jù)顯示兩者的miRNAs分布相似但在排序上有差異，說明在豬乳中miRNAs在種類上差異不大，但由于品種、飼養(yǎng)水平等的不同導(dǎo)致了表達量有一定的差異。其中在牛乳exosome里表達量最高的50種miRNAs中有14種是牛特有的[22]。

表1豬乳、人乳、牛乳exosome中表達量最高的10種miRNAs之間的對比

Table 1The comparison among top 10 most highly expressed miRNAs in porcine milk，human milk and bovine milk exosome

排序Rank豬乳exosome中的miRNAs(1)PorcinemilkexosomalmiRNAs(1)豬乳exosome中的miRNAs(2)PorcinemilkexosomalmiRNAs(2)人乳exosome中的miRNAsHumanmilkexosomalmiRNAs牛乳exosome中的miRNAsBovinemilkexosomalmiRNAs1miR-193a-3pmiR-148a-3pmiR-148a-3pmiR-24782miR-423-5pmiR-30a-5pmiR-30b-5pmiR-1777b3miR-320-3pmiR-25-3plet-7f-1-5p(-2-5p)miR-1777a4miR-181a-5pmiR-182-5pmiR-146b-5plet-7b5miR-30a-3pmiR-30d-5pmiR-29a-3pmiR-12246miR-378-3pmiR-574-3plet-7a-2-5p(-3-5p)miR-24127miR-191-5pmiR-30c-2-5p(-1-5p)miR-141-3pmiR-23058let-7a-5pmiR-200c-3pmiR-182-5plet-7a9let-7f-5pmiR-191-5pmiR-200a-3pmiR-200c10let-7c-5plet-7a-1-5pmiR-378-3pmiR-14111miR-181b-5pmiR-27b-3pmiR-288112miR-140-3pmiR-21-5pmiR-2328*13miR-30a-5pmiR-375-3plet-7c

(2)中miRNAs(除miR-148a-3p)的排序會因哺乳階段的不同而不同，表中列出第0天豬乳exosome中的miRNA的排序

The rank of miRNAs in (2) (except for miR-148a-3p) will be different at different stages of lactation，and the rank of exosomal miRNAs in 0 day porcine milk were listed in the table

表2牛乳exosome所含miRNAs與兩組豬乳exosome中表達量同為前50的miRNAs的對比

Table 2The comparison between bovine milk exosomal miRNAs and both top 50 most highly expressed miRNAs in 2 groups of porcine milk exosome

豬乳exosome中高表達的miRNAsPorcinemilkexosomalhighlyexpressedmiRNAs對應(yīng)的牛乳exosome的miRNAsCorrespondingbovinemilkexosomalmiRNAsTop79中的排序Rankintop79豬乳exosome中高表達的miRNAsPorcinemilkexosomalhighlyexpressedmiRNAs對應(yīng)的牛乳exosome的miRNAsCorrespondingbovinemilkexosomalmiRNAsTop79中的排序Rankintop79ssc-let-7a-5pbta-let-7a8ssc-let-7i-5pbta-let-7i74ssc-let-7c-5pbta-let-7c13ssc-miR-191-5pbta-miR-191-ssc-miR-148a-3pbta-miR-148a14ssc-miR-21bta-miR-21-ssc-miR-30d-5pbta-miR-30d24ssc-miR-423-3pbta-miR-423-3p-ssc-miR-30a-5pbta-miR-30a-5p30ssc-miR-425-5pbta-miR-425-5p-ssc-miR-125b-5pbta-miR-125b32ssc-miR-125a-5pbta-miR-125a-ssc-miR-24-3pbta-miR-24-3p36ssc-miR-205-5pbta-miR-205-ssc-miR-423-5pbta-miR-423-5p38ssc-miR-186-5pbta-miR-186-ssc-miR-27b-3pbta-miR-27b59ssc-miR-30a-3p--ssc-miR-23a-3pbta-miR-23a66

牛乳exosome中信號值為“0”的miRNAs不參與排序

The bovine milk exosomal miRNAs with “0” normalized signal intensity are not involved in ranking

表3兩組豬乳exosome中miRNAs與牛乳exosome中表達量最高的50種miRNAs之間的對比

Table 3The comparison between 2 groups of porcine milk exosomal miRNAs and top 50 most highly expressed miRNAs in bovine milk exosome

排序Rank牛乳exosome中表達量最高的50種miRNAsTop50mosthighlyexpressedmiRNAsinbovinemilkexosome對應(yīng)的豬乳exosome中的miRNAs(1)CorrespondingmiRNAsinporcinemilkexosome(1)(1)中的排序Rankin(1)對應(yīng)的豬乳exosome中的miRNAs(2)CorrespondingmiRNAsinporcinemilkexosome(2)(2)中排序Rankin(2)1bta-miR-24782bta-miR-1777b3bta-miR-1777a4bta-let-7b5bta-miR-12246bta-miR-24127bta-miR-23058bta-let-7assc-let-7a-5p8ssc-let-7a-l-5p149bta-miR-200chsa,mmu,rno-miR-200c-3p910bta-miR-141hsa,mmu,rno-miR-141-3p6511bta-miR-288112bta-miR-2328*13bta-let-7cssc-let-7c-5p10ssc-let-7c-5p1314bta-miR-148assc-miR-148a-3p33ssc-miR-148a-3p115bta-miR-320ssc-miR-320-3p3ssc-miR-320-3p6916bta-miR-288817bta-let-7fssc-let-7f-5p9ssc-let-7f-5p5718bta-miR-200bhsa,mmu,rno-miR-200b-3p1919bta-miR-158420bta-miR-26assc-miR-26a-5p6121bta-miR-20ahsa,mmu,rno-miR-20a-5p10322bta-miR-103ssc-miR-103-3p15ssc-miR-103-2-3p,ssc-miR-103-1-3p13923bta-miR-29cssc-miR-29c-3p94ssc-miR-29c-3p8224bta-miR-30dssc-miR-30d-5p48ssc-miR-30d-5p525bta-miR-92ssc-miR-92a-3p14ssc-miR-92a-2-3pssc-miR-92a-1-3p758326bta-miR-230427bta-miR-375hsa,mmu,rno-miR-375-3p828bta-miR-239129bta-let-7gssc-let-7g-5p37ssc-let-7g-5p55

表3(續(xù))

通過對袋鼠不同哺乳階段乳中miRNA進行檢測，發(fā)現(xiàn)有16種miRNAs表達量較高，其中9種(miR-191、miR-375、miR-148、miR-30a、miR-181a、let-7f、let-7a、miR-21、miR-141)同時屬于豬乳、人乳、牛乳exosome中表達量最高的10種miRNAs之中，推測這些miRNAs可能在哺乳動物乳汁中是保守并且高表達的。此外，不同的miRNAs在袋鼠哺乳期的表達規(guī)律有所差異，個別(miR-375、miR-30a、miR-22、let-7b、miR-130a)的表達量隨日齡的增加而逐漸上升，個別(miR-184、let-7f、miR-101、miR-182)的表達量則逐漸降低,數(shù)據(jù)如表4所示。

綜上表明，不同動物乳中miRNA的種類組成相似但表達量存在差異。需要指出的是，上述結(jié)果是在有限的資料基礎(chǔ)上比較而來，更加準確的情況需要更多的試驗數(shù)據(jù)支持。

表4不同哺乳階段袋鼠乳中miRNAs的表達量

Table 4The expression of miRNAs in kangaroo milk at different lactation stages

microRNA第35天D35第75天D75第120天D120第175天D175第250天D250miR-19140.42928.02243.8289.65715.471miR-18417.61124.8368.5621.4480.133miR-3752.4052.6328.2259.78225.778miR-1485.37110.5588.32014.6139.308miR-30a1.0953.4573.35613.66914.953miR-181c(-181a)6.7427.5345.0185.6995.827let-7f7.6886.4455.3716.0401.672miR-220.6710.7941.1363.1818.639let-7a3.8902.3862.6413.6461.190miR-10b2.9101.5203.4213.7561.146miR-1410.3441.7410.6844.9624.166miR-1430.8651.3851.1445.0673.117miR-923.2191.2392.5040.8490.984let-7i1.7180.7570.6702.1180.525miR-210.4380.2870.2143.0350.559miR-260.4661.4520.8360.6920.306

表中的數(shù)值為各自乳樣中miRNAs表達量歸一化的read值；表中只列出至少有一個階段read值大于1的miRNAs

The values in the table are normalized miRNAs expression of mapped reads in respective milk samples；The only miRNAs with more than 1 read value at least one stage are listed in the Table 4

4　乳中miRNA的其他存在形式

乳中的miRNA并非全部以包被于exosome中的形式出現(xiàn)。H.Izumi等[22]報道m(xù)iRNAs同時存在于不含exosome的乳清中。乳清(乳汁除去乳脂、細胞、碎片、酪蛋白等剩下的液體部分)通過超速離心后可以得到exosome沉淀和上清液，小心收集上清液可得到無exosome的乳清。芯片結(jié)果顯示，有79種miRNAs存在于exosome中，91種miRNAs存在于上清液中，其中兩者共有的miRNAs為39種。Exosome中表達量最高的50種miRNAs與無exosome上清液中表達量最高的50種miRNAs之間的對比如表5所示，其中miR-2478、miR-1777b、miR-1777a、miR-1224、miR-2412、miR-2305這6種miRNAs都排在前10位，而在exosome中表達量較高的let-7家族成員卻沒有一個位于上清液前50位中，說明let-7家族成員富集于exosome中。此外，在乳清中約70%的RNA集中于exosome里，其余分布在上清液中，驗證了exosome的富集作用以及其作為細胞間通訊媒介的物質(zhì)基礎(chǔ)。但exosome中只有約27%的小RNA為miRNA，上清液中約64%的小RNA為miRNA。

專門比較經(jīng)超速離心后所得到的exosome沉淀和上清液中所含miRNA區(qū)別的報道較少。對乳汁miRNA進行抽提的方式大致分成3類：一種是對只除去乳脂、細胞、碎片等剩下的液體部分進行抽提，得到上清(Supernatant)的miRNA，如X.Chen等[12]和V.Modepalli等[21]都以此方法處理樣品并抽提總RNA做Solexa測序和qPCR；N.Kosaka等[13]以此方法處理樣品并抽提總RNA做芯片分析和qPCR。第2種是對除去乳脂、細胞、碎片以及含量豐富的酪蛋白等剩下的液體部分進行抽提，得到乳清(Whey)的miRNA，如H.Izumi等[16，18]以此方法處理樣品并抽提總RNA做芯片分析和qPCR。第3種方式是收集胃乳進行檢測，如A.C.Title等[17]以此方法收集不同時期幼鼠體內(nèi)變性的胃乳以檢測其中的miRNA。表6、表7列出不同幼鼠在哺乳早期、中期、后期的胃乳中各階段表達量最高的10種miRNAs，可以看出在不同階段miRNAs的種類組成相似，而且3個階段中表達量最高的10種miRNAs中相同的有6種(mmu-miR-148a、mmu-miR-181a、mmu-miR-22、mmu-miR-27b、mmu-miR-30a、mmu-let-7f)，推測在整個哺乳期間miRNAs的分泌都相對穩(wěn)定。其中miR-148a-3p的表達量為最高，這與豬乳和人乳exosome中miR-148a-3p表達量最高相吻合；miR-30a-5p、miR-27b-3p、miR-181a-5p、let-7f同樣屬于豬乳exosome中表達量最高的前10種miRNAs內(nèi)，而let-7f也屬于人乳exosome中表達量最高的前10種miRNAs內(nèi)。

表5牛乳exosome與無exosome上清液中高表達的10種miRNAs之間的對比Table 5The comparison between top 10 most highly expressed miRNAs in bovine milk exosome and those in exosome-free supernatant

排序Rank牛乳exosome中的miRNAsmiRNAsinbovinemilkexosome信號強度Signalintensity牛乳無exosome上清液中的miRNAsmiRNAsinbovinemilkexosome-freesupernatant信號強度Signalintensity1bta-miR-247819.163bta-miR-1777a20.0162bta-miR-1777b14.105bta-miR-1777b19.7353bta-miR-1777a13.444bta-miR-230518.9304bta-let-7b12.778bta-miR-134317.7565bta-miR-122412.602bta-miR-241217.4836bta-miR-241212.543bta-miR-288817.4197bta-miR-230511.695bta-miR-231616.9748bta-let-7a11.672bta-miR-2328*16.8619bta-miR-200c11.507bta-miR-122416.03810bta-miR-14111.322bta-miR-247816.016

信號強度指歸一化的信號強度

Signal intensity means normalized signal intensity

由上述可知，miRNA同時存在于乳清的exosome和上清液中，但有報道推測miRNA存在于上清液中是由于制備exosome沉淀需要經(jīng)過超速離心，而exosome是一種直徑約30～100 nm的納米量級的膜性小囊泡，超速離心可能不能把直徑小的exosome沉淀下來，導(dǎo)致這部分exosome還游離于上清液中，因此在上清液中能檢測出少量的miRNAs[22]。然而為什么通過芯片檢測發(fā)現(xiàn)存在上清(Supernatant)或乳清(Whey)特有的miRNAs[22，31]，這還需要進一步的探索。

表6哺乳早期(D2)、中期(D8)、后期(D14)幼鼠胃乳中高表達的10種miRNAs(1)

Table 6Top 10 most highly expressed miRNAs in newborn mice at early (D2)，mid (D8) and late (D14) lactation stages(1)

排序Rank第2天D2Count第8天D8Count第14天D14Count1mmu-miR-148a-3p121307mmu-miR-148a-3p123141mmu-miR-181a-5p1286692mmu-miR-181a-5p51578mmu-miR-181a-5p112909mmu-miR-148a-3p1283403mmu-miR-22-3p28484mmu-miR-27b-3p43595mmu-miR-143-3p827384mmu-miR-27b-3p22280mmu-miR-22-3p39233mmu-miR-22-3p611035mmu-miR-30a-5p20021mmu-miR-30a-5p35712mmu-miR-192-5p449906mmu-let-7f-5p15167mmu-miR-146b-5p33939mmu-miR-27b-3p389847mmu-miR-146b-5p13216mmu-miR-143-3p24343mmu-miR-215-5p367898mmu-miR-26a-5p11527mmu-miR-141-3p20408mmu-miR-26a-5p312929mmu-let-7i-5p10216mmu-let-7f-5p19182mmu-let-7f-5p2959610mmu-miR-378a-3p9783mmu-miR-378a-3p18166mmu-miR-30a-5p28305

數(shù)據(jù)來源于試驗幼鼠1

Data comes from the experimental newborn mice 1

表7哺乳早期(D2)、中期(D8)、后期(D14)幼鼠胃乳中高表達的10種miRNAs(2)

Table 7Top 10 most highly expressed miRNAs in newborn mice at early (D2)，mid (D8) and late (D14) lactation stages(2)

排序Rank第2天D2Count第8天D8Count第14天D14Count1mmu-miR-148a-3p96003mmu-miR-148a-3p368038mmu-miR-148a-3p616282mmu-miR-181a-5p39355mmu-miR-181a-5p310394mmu-miR-181a-5p613133mmu-miR-22-3p22133mmu-miR-22-3p117528mmu-miR-22-3p248214mmu-miR-27b-3p16676mmu-miR-27b-3p111474mmu-miR-27b-3p177655mmu-miR-30a-5p16250mmu-miR-30a-5p80423mmu-miR-143-3p164956mmu-miR-146b-5p15132mmu-miR-143-3p66200mmu-miR-30a-5p164017mmu-let-7f-5p11204mmu-miR-26a-5p62362mmu-miR-215-5p138758mmu-miR-378a-3p8749mmu-let-7f-5p54063mmu-miR-141-3p107649mmu-let-7i-5p8512mmu-miR-141-3p49141mmu-miR-192-5p971810mmu-miR-26a-5p8147mmu-miR-378a-3p46642mmu-let-7f-5p9670

數(shù)據(jù)來源于試驗幼鼠2

Data comes from the experimental newborn mice 2

5　其　他

通過對比不同動物乳中的miRNAs，發(fā)現(xiàn)有部分miRNAs的表達量都相對較高，如miR-148a、let-7家族、miR-182-5p、miR-378、miR-141、miR-30a-5p、miR-27b-3p、miR-146b-5p、miR-26a等在多數(shù)動物乳中都是高表達的，說明這些miRNAs在物種進化上的保守性，而這種保守性也預(yù)示著它們具有某種生物學功能。

乳中的miRNA與免疫、生長發(fā)育、細胞、組織、神經(jīng)、代謝等相關(guān)，如牛乳中miR-101、miR-125b、miR-150、miR-21、miR-24-1、miR-93、miR-181a、miR-142-5p、miR-146a、miR-17-5p等與免疫相關(guān)；miR-15b、miR-106b、miR-155、miR-223、miR-27b、miR-34a、miR-130a等與免疫和發(fā)育相關(guān)；miR-122、miR-183、miR-96、miR-1、miR-206、miR-184、miR-451、miR-9等與組織相關(guān)。人們更傾向于對乳中與新生兒免疫、發(fā)育相關(guān)的miRNA的研究，如let-7a、let-7c、let-7f、miR-181b、miR-30a-3p、miR-320、miR-423-5p、miR-378等與IgA免疫網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)。

此外，已有報道證實包裹于人乳exosome中的miRNA能抵抗胃腸道的消化，并能被腸上皮細胞所吸收[32]，甚至牛乳中的miRNA能通過飲食跨物種轉(zhuǎn)移到人、鼠腸細胞中[7]。這些體外試驗的證據(jù)共同表明乳中的miRNA是可以被子代吸收的。然而，最新的研究發(fā)現(xiàn)母乳中的miRNA在胃腸道里會快速降解，而且證實了miRNA并不能通過腸道，因此不能被子代所吸收從而發(fā)揮作用。該研究作者推測造成試驗結(jié)果不統(tǒng)一是因為以往的研究不能完全模擬真正的腸道環(huán)境(如酶活，膽酸等)，單因素分析結(jié)果可信度不高[17]。綜上所述，miRNA能否被子代吸收利用如今存在爭議。若能證實乳中miRNA能被吸收利用，那這些功能相關(guān)的miRNA必將對初生子代各組織、器官、系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響，而這些影響可能貫穿個體整個發(fā)育過程乃至生命周期。

目前人們對乳中miRNA的種類已進行了分析，但不同動物乳中miRNA的差異還需要更多資料的證實。另外，乳中miRNA的功能分析剛剛起步，將是乳營養(yǎng)理論的下一個研究熱點。

[1]JOHNSTONE R M，ADAM M，HAMMOND J R，et al.Vesicle formation during reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes)[J].JBiolChem，1987，262(19)：9412-9420.

[2]VAN BALKOM B W，PISITKUN T，VERHAAR M C，et al.Exosomes and the kidney：prospects for diagnosis and therapy of renal diseases[J].KidneyInt，2011，80(11)：1138-1145.

[3]ZHOU H，CHERUVANKY A，HU X，et al.Urinary exosomal transcription factors，a new class of biomarkers for renal disease[J].KidneyInt，2008，74(5)：613-621.

[4]DUIJVESZ D，LUIDER T，BANGMA C H，et al.Exosomes as biomarker treasure chests for prostate cancer[J].EurUrol，2011，59(5)：823-831.

[5]NILSSON J，SKOG J，NORDSTRAND A，et al.Prostate cancer-derived urine exosomes：a novel approach to biomarkers for prostate cancer[J].BrJCancer，2009，100(10)：1603-1607.

[6]VAN DEN BOORN J G，SCHLEE M，COCH C，et al.SiRNA delivery with exosome nanoparticles[J].NatBiotechnol，2011，29(4)：325-326.

[7]WOLF T，BAIER S R，ZEMPLENI J.the Intestinal transport of bovine milk exosomes is mediated by endocytosis in human colon carcinoma caco-2 cells and rat small intestinal IEC-6 cells[J].JNutr，2015，145(10)：2201-2206.

[8]HOWARD K M，JATI KUSUMA R，BAIER S R，et al.Loss of miRNAs during processing and storage of cow’s (Bostaurus) milk[J].JAgricFoodChem，2015，63(2)：588-592.

[9]WEBER J A，BAXTER D H，ZHANG S，et al.The microRNA spectrum in 12 body fluids[J].ClinChem，2010，56(11)：1733-1741.

[10]HATA T，MURAKAMI K，NAKATANI H，et al.Isolation of bovine milk-derived microvesicles carrying mRNAs and microRNAs[J].BiochemBiophysResCommun，2010，396(2)：528-533.

[11]ZHOU Q，LI M，WANG X，et al.Immune-related microRNAs are abundant in breast milk exosomes[J].IntJBiolSci，2012，8(1)：118-123.

[12]CHEN X，GAO C，LI H，et al.Identification and characterization of microRNAs in raw milk during different periods of lactation，commercial fluid，and powdered milk products[J].CellRes，2010，20(10)：1128-1137.

[13]KOSAKA N，IZUMI H，SEKINE K，et al.microRNA as a new immune-regulatory agent in breast milk[J].Silence，2010，1(1)：7.

[14]GU Y，LI M，WANG T，et al.Lactation-related microRNA expression profiles of porcine breast milk exosomes[J].PLoSOne，2012，7(8)：e43691.

[15]CHEN T，XI Q Y，YE R S，et al.Exploration of microRNAs in porcine milk exosomes[J].BMCGenomics，2014，15：100.

[16]IZUMI H，KOSAKA N，SHIMIZU T，et al.Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey[J].PLoSOne，2014，9(2)：e88843.

[17]TITLE A C，DENZLER R，STOFFEL M.Uptake and function studies of maternal milk-derived microRNAs[J].JBiolChem，2015，290(39)：23680-23691.

[18]IZUMI H，KOSAKA N，SHIMIZU T，et al.Bovine milk contains microRNA and messenger RNA that are stable under degradative conditions[J].JDairySci，2012，95(9)：4831-4841.

[19]IZUMI H，KOSAKA N，SHIMIZU T，et al.Purification of RNA from milk whey[J]，MethodsMolBiol，2013：191-201.

[20]ARROYO J D，CHEVILLET J R，KROH E M，et al.Argonaute2 complexes carry a population of circulating microRNAs independent of vesicles in human plasma[J].ProcNatlAcadSciUSA，2011，108(12)：5003-5008.

[21]MODEPALLI V，KUMAR A，HINDS L A，et al.Differential temporal expression of milk miRNA during the lactation cycle of the marsupial tammar wallaby (Macropuseugenii)[J].BMCGenomics，2014，15(1)：1012.

[22]IZUMI H，TSUDA M，SATO Y，et al.Bovine milk exosomes contain microRNA and mRNA and are taken up by human macrophages[J].JDairySci，2015，98(5)：2920-2933.

[23]LIU X，ZHAN Z，XU L，et al.MicroRNA-148/152 impair innate response and antigen presentation of TLR-triggered dendritic cells by targeting CaMKIIalpha[J].JImmunol，2010，185(12)：7244-7251.

[24]GUO S L，PENG Z，YANG X，et al.miR-148a promoted cell proliferation by targeting p27 in gastric cancer cells[J].IntJBiolSci，2011，7(5)：567-574.

[25]CHEN Y，SONG Y X，WANG Z N.The microRNA-148/152 family：multi-faceted players[J].MolCancer，2013，12(1)：43.

[26]ZHENG B，LIANG L，WANG C，et al.MicroRNA-148a suppresses tumor cell invasion and metastasis by downregulating ROCK1 in gastric cancer[J].ClinCancerRes，2011，17(24)：7574-7583.

[27]ZHANG H，LI Y，HUANG Q，et al.MiR-148a promotes apoptosis by targeting Bcl-2 in colorectal cancer[J].CellDeathDiffer，2011，18(11)：1702-1710.

[28]HINO K，TSUCHIYA K，F(xiàn)UKAO T，et al.Inducible expression of microRNA-194 is regulated by HNF-1alpha during intestinal epithelial cell differentiation[J].RNA，2008，14(7)：1433-1442.

[29]SATO F，TSUCHIYA S，MELTZER S J，et al.MicroRNAs and epigenetics[J].FEBSJ，2011，278(10)：1598-1609.

[30]PAN W，ZHU S，YUAN M，et al.MicroRNA-21 and microRNA-148a contribute to DNA hypomethylation in lupus CD4+T cells by directly and indirectly targeting DNA methyltransferase 1[J].JImmunol，2010，184(12)：6773-6781.

[31]REINHARDT T A，SACCO R E，NONNECKE B J，et al.Bovine milk proteome：quantitative changes in normal milk exosomes，milk fat globule membranes and whey proteomes resulting from Staphylococcus aureus mastitis[J].JProteomics，2013，82：141-154.

[32]LONNERDAL B，DU X，LIAO Y，et al.Human milk exosomes resist digestioninvitroand are internalized by human intestinal cells[J].FASEBJ，2015，29(1 Supplement)：121.3.

(編輯郭云雁)

Research Progress of miRNA in Milk

LIN De-lin，CHEN Ting，LI Meng，XIE Mei-ying，XI Qian-yun，SUN Jia-jie，ZHANG Yong-liang*

(NationalEngineeringResearchCenterForBreedingSwineIndustry，CollegeofAnimalScience，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China)

Exosome exist in various kinds of body fluid，including milk，serum，urea，etc.It was reported that proteins，mRNAs，microRNAs，lipids，etc in exosome are transferred into receptor cells to play some physiological roles.In recent years，although there are a number of researchs on miRNA in animals，relatively a few studies illustrated miRNAs in milk.In this review，by collecting and collating some reports published，we confirmed the presence of miRNAs in the milk and they enriched in exosome，then compared the similarities and differences of miRNAs with high expression in different animal milk.We also concentrated on miRNAs highly expressed in exosome，and then drew some general conclusions.Moreover，we analyzed the other miRNAs binding forms in milk，then discussed the conservation of miRNAs in different animal milk and possible physiological function of miRNAs.

milk；exosome；miRNA

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.001

2015-12-02

國家自然科學基金 (31472163)；農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(2014ZX08009-048B)；廣東省科技計劃項目(S2013020012766)

林德麟(1990-)，男，廣東佛山人，碩士生，主要從事microRNA的研究，E-mail：al469223174@163.com

張永亮，教授，E-mail：zhangyl@scau.edu.cn

S813.3

A

0366-6964(2016)09-1739-10