袁旦一，金亞南，李　玲，何　謙，胡　林，李曉琪，孫志勇

(1.四川納比生物科技有限公司，成都 610041；2.杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，杭州 310053)

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豬圓環(huán)病毒2型交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立

袁旦一1，金亞南2，李玲1，何謙1，胡林2，李曉琪1，孫志勇1

(1.四川納比生物科技有限公司，成都 610041；2.杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，杭州 310053)

擬建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)快速分子檢測(cè)方法，為豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)疾病的生物安全防控提供技術(shù)支撐。采用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理，根據(jù)PCV2Cap基因設(shè)計(jì)一組交叉擴(kuò)增引物，用構(gòu)建的Cap基因重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA模板，對(duì)反應(yīng)體系的引物濃度、Betaine、MgSO4、dNTP、Bst酶、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，并結(jié)合核酸試紙條技術(shù)，建立可視化檢測(cè)PCV2的交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法(PCV2-CPA)。用建立的CPA檢測(cè)方法、常規(guī)PCR和ELISA方法檢測(cè)經(jīng)IFA方法標(biāo)定的127份臨床樣品，比較這些方法的敏感性、特異性和符合率。結(jié)果顯示，最佳反應(yīng)體系為引物F3、B3各 0.5 μmol·L-1，CPR 1 μmol·L-1，DF5F 0.7 μmol·L-1、DF5B 0.9 μmol·L-1，Betaine 0.075 mol·L-1，MgSO43 mol·L-1，dNTPs 0.4 mmol·L-1，BstDNA 聚合酶9.6 U。建立的檢測(cè)方法58 ℃ 擴(kuò)增50 min，檢測(cè)限可達(dá)7.6 拷貝·μL-1，靈敏度是常規(guī)PCR的10倍；與PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RV無(wú)交叉反應(yīng)。三種檢測(cè)方法的敏感性分別為78.08%～94.52%，特異性為87.03%～92.59%，符合率為84.25%～91.34%，ROC曲線圖顯示三種檢測(cè)方法中，CPA檢測(cè)方法效能最優(yōu)。建立的豬圓環(huán)病毒2型交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法不需要PCR儀，僅一臺(tái)水浴鍋或金屬浴即可完成病毒DNA的擴(kuò)增，密閉的核酸檢測(cè)試紙條使結(jié)果判定直觀、客觀，且可有效避免氣溶膠污染，可應(yīng)用于豬圓環(huán)病毒2型的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

豬圓環(huán)病毒2型；交叉引物；恒溫?cái)U(kuò)增；檢測(cè)；氣溶膠污染；生物安全防控

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，為單股負(fù)鏈環(huán)狀DNA病毒，是已知的最小動(dòng)物病毒之一。分為PCV1和PCV2兩個(gè)血清型，其中PCV2致病，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合癥(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)等疾病的主要病原[1]。自1991年加拿大首次報(bào)道PMWS以來(lái)，以后世界多國(guó)相繼報(bào)道了該病的發(fā)生[2-3]。2000年郎洪武等首次報(bào)道了我國(guó)PCV2的存在，此后的報(bào)道也證明PCV2感染在我國(guó)豬群中廣泛存在[4]，由PCV2引發(fā)的PMWS等各種疾病持久和廣泛蔓延，已給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重威脅。PCV2致病的主要原因是使感染的個(gè)體產(chǎn)生免疫抑制，感染豬體免疫細(xì)胞受到不同程度的損傷[5]，有“豬類艾滋病”之稱，目前該病以診斷、預(yù)防為主，建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法對(duì)于及早發(fā)現(xiàn)并采取有效方法控制本病顯得極為重要。

傳統(tǒng)的PCV2檢測(cè)方法有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附、免疫組化等，這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，且靈敏度和準(zhǔn)確性差；PCR、熒光定量PCR等分子生物學(xué)檢測(cè)方法以其靈敏度高、特異性好、可鑒別亞型得到了廣泛的應(yīng)用[6]，但這類方法對(duì)儀器設(shè)備要求較高，不利于基層單位使用；LAMP[7]檢測(cè)方法雖對(duì)儀器設(shè)備要求不高，但卻極易造成氣溶膠污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。作者利用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理(cross priming amplification，CPA)[8]，針對(duì)PCV2 的Cap基因高度保守區(qū)域作為靶序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)粒，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了可快速、靈敏、特異地檢測(cè)PCV2的CPA檢測(cè)方法，僅需一臺(tái)水浴鍋或金屬浴即可完成核酸擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物用密閉的核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行結(jié)果判定，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，且可有效避免氣溶膠污染，旨在將分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù)推廣至基層實(shí)驗(yàn)室甚至養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)，為養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全防控提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料與試劑

PCV1、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV細(xì)胞毒為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所饋贈(zèng)；FMDV、PEDV、TGEV、RV活疫苗購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；PCV2質(zhì)粒為四川納比生物科技有限公司自己構(gòu)建；BstDNA 聚合酶、10×ThermoPol?Reaction Buffer及MgSO4為NEB公司產(chǎn)品；Betaine為Sigma產(chǎn)品，dNTPs和無(wú)核酸酶水為上海生工產(chǎn)品；核酸試紙條檢測(cè)裝置(及配套緩沖液)由四川納比生物科技有限公司自主生產(chǎn)；圓環(huán)病毒2型ELISA抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自齊一生物科技(上海)有限公司。

1.2主要儀器

恒溫金屬浴為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品，PCR儀來(lái)自美國(guó)Bio-Rad(PTC02000型)，電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品(DYY-11型)，凝膠成像系統(tǒng)來(lái)自英國(guó)UVITEC(UVIdoc型)，酶標(biāo)儀來(lái)自美國(guó)Bio-Rad(iMark680型)。

1.3引物設(shè)計(jì)和及合成

根據(jù)GenBank中PCV2Cap基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行分析并設(shè)計(jì)5條特異性引物F3、B3、CPR、DF5F、DF5B(表1)，其中F3、B3也作為常規(guī)PCR的引物，送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，稀釋為20 μmol·L-1備用。

表1PCV2-CPA擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

Table 1PCV2 cross priming amplification primers design

引物Primers引物序列(5'→3')Nucleotidesequencesoftheprimers(5'→3')5'修飾5'ModificationF3TCCTCCCGCCATACCATAAC/B3ATGGTCTACATTTCCAGTAG/CPRCCGAAACCTGTCCTTGATAGTTTGTAGTCTCAGCCAGAGTTG/DF5FCCGAAACCTGTCCTTGATAGFitcDF5BTCCAACCCAATAACAAAAGAAABiotin

1.4豬圓環(huán)病毒2型質(zhì)粒DNA模板的制備

提取PCV2質(zhì)粒DNA，測(cè)定濃度并計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)。然后將該質(zhì)粒DNA進(jìn)行梯度稀釋，作為后續(xù)試驗(yàn)的DNA 模板及陽(yáng)性對(duì)照。

1.5PCV2-CPA基礎(chǔ)擴(kuò)增體系的建立和反應(yīng)體系的優(yōu)化

參考交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增文獻(xiàn)[8]，設(shè)置PCV2-CPA 的基礎(chǔ)反應(yīng)體系(表2)，用無(wú)核酸酶水作為陰性對(duì)照，7.6×105拷貝·μL-1的質(zhì)粒DNA作為陽(yáng)性模板，在63 ℃下恒溫?cái)U(kuò)增45 min。反應(yīng)產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。若陰、陽(yáng)性結(jié)果成立，則該基礎(chǔ)反應(yīng)體系可用于后續(xù)優(yōu)化。在此基礎(chǔ)之上，按照表3對(duì)不同濃度引物組合進(jìn)行優(yōu)化，其他試劑工作濃度不變，每個(gè)組合均設(shè)陰性對(duì)照。選取最優(yōu)濃度引物組合，采用控制變量法，對(duì)擴(kuò)增體系中的MgSO4、dNTPs、Betaine、Bst酶、擴(kuò)增溫度和擴(kuò)增時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化[8]，確定最佳反應(yīng)體系和條件。

表2PCV2-CPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系

Table 2The basic reaction system of PCV2-CPA

組分Components工作濃度Finalconcentration體積/μLVolume10×ThermoPolReactionBuffer1×2.08U·μL-1BstDNApolymerase8U1.010mmol·L-1dNTP0.4mmol·L-10.8100mmol·L-1MgSO43mmol·L-10.65mol·L-1Betaine0.25mol·L-11.020μmol·L-1F30.5μmol·L-10.520μmol·L-1B30.5μmol·L-10.520μmol·L-1CPR0.6μmol·L-10.820μmol·L-1DF5F0.8μmol·L-10.520μmol·L-1DF5B0.5μmol·L-10.5H2O/4.8模板Templates/4.0

1.6PCV2-CPA方法的交叉反應(yīng)檢測(cè)

提取豬常見(jiàn)病毒病病毒株(PCV1、PCV2質(zhì)粒、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV、PEDV、TGEV、RV)核酸，用建立的PCV2-CPA檢測(cè)方法用上述核酸作為模板進(jìn)行交叉試驗(yàn)。

1.7PCV2-CPA方法與常規(guī)PCR法靈敏度比較

用無(wú)核酸酶水調(diào)整質(zhì)粒DNA濃度為7.6×1010、7.6×109、7.6×108、7.6×107、7.6×106、7.6×105、7.6×104、7.6×103、7.6×102、7.6×101、7.6×100、7.6×10-1、7.6×10-2拷貝·μL-1，用建立的PCV2-CPA 檢測(cè)方法和常規(guī)PCR方法對(duì)上述不同濃度質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增，比較靈敏度差異。常規(guī)PCR的反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表3不同濃度引物組合

Table 3Different concentration combinations of primers

引物組合Primercombinations引物濃度/(μmol·L-1)PrimerconcentrationsF3B3CPRDF5FDF5B10.50.50.80.50.520.50.50.80.50.730.50.50.80.50.940.50.50.80.70.550.50.50.80.70.760.50.50.80.70.970.50.50.80.90.580.50.50.80.90.790.50.50.80.90.9100.50.510.70.9110.50.51.20.70.9

1.8PCV2-CPA的可視化試紙條檢測(cè)

將“1.6、1.7”中PCV2-CPA法的擴(kuò)增產(chǎn)物放入核酸試紙條檢測(cè)裝置中，3～5 min后肉眼判讀結(jié)果。當(dāng)試紙條T、C線處均出現(xiàn)紅色條帶時(shí)判定為陽(yáng)性，僅C線處出現(xiàn)紅色條帶時(shí)判定為陰性。

1.9不同方法臨床樣品檢測(cè)的敏感性、特異性、符合率比較

用建立的CPA方法、常規(guī)PCR方法和ELISA方法檢測(cè)評(píng)價(jià)經(jīng)金標(biāo)準(zhǔn)法(IFA方法)標(biāo)定的127份臨床樣品(73份陽(yáng)性，54份陰性)。按下公式計(jì)算三種不同檢測(cè)方法的敏感性、特異性和符合率：敏感性=(檢測(cè)真陽(yáng)性樣品數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品總數(shù))×100%；特異性=(檢測(cè)真陰性樣品數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品總數(shù))×100%；符合率=(檢測(cè)真陽(yáng)性樣品數(shù)+檢測(cè)真陰性樣品數(shù))/檢測(cè)樣本品總數(shù)×100%。用SPSS 21軟件做ROC曲線圖，綜合分析評(píng)定不同方法的檢測(cè)效能。

2　結(jié)　果

2.1質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)計(jì)算結(jié)果

提取的質(zhì)粒DNA經(jīng)測(cè)定質(zhì)量濃度為259.1 μg·mL-1，質(zhì)粒長(zhǎng)度為3 122 bp，經(jīng)計(jì)算，該質(zhì)粒濃度為7.6×1010拷貝·μL-1。

2.2PCV2-CPA基礎(chǔ)擴(kuò)增體系的建立

反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)電泳后紫外燈下觀察，質(zhì)粒DNA陽(yáng)性模板有梯形條帶產(chǎn)生，陰性對(duì)照無(wú)梯形條帶(圖1)。結(jié)果表明，PCV2-CPA基礎(chǔ)反應(yīng)體系可對(duì)PCV2進(jìn)行有效的擴(kuò)增。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Marker Ⅰ；1.陰性對(duì)照；2.陽(yáng)性模板M.DNA marker Ⅰ；1.Negative control；2.Positive control圖1　PCV2-CPA基礎(chǔ)擴(kuò)增體系電泳結(jié)果Fig.1 PCV2-CPA products in 3.0% agarose gel

2.3PCV2-CPA反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

引物濃度優(yōu)化結(jié)果顯示：濃度組合10(引物F3 和B3各0.5 μmol·L-1，引物CPR 1 μmol·L-1，引物DF5F 0.7 μmol·L-1，引物DF5B 0.9 μmol·L-1)的擴(kuò)增產(chǎn)物量多，條帶較清晰，為最佳濃度組合(圖2) 。

對(duì)反應(yīng)體系中的MgSO4、dNTPs、Betaine、Bst酶進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：0～0.4 mol·L-1范圍內(nèi)Betaine最佳工作濃度為0.075 mol·L-1；0～5 mmol·L-1范圍內(nèi)選擇MgSO4最佳工作濃度為3 mmol·L-1；0.1～0.6 mmol·L-1范圍內(nèi)dNTPs最佳工作濃度為0.4 mmol·L-1；Bst酶的最適添加量為9.6 U。

2.4PCV2-CPA反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

在56～65 ℃間選取最適反應(yīng)溫度，30～90 min選取最適擴(kuò)增時(shí)間，結(jié)果顯示：最適反應(yīng)條件為58 ℃擴(kuò)增50 min，詳見(jiàn)圖3、圖4。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，確定最佳反應(yīng)體系：1×ThermoPol?Reaction Buffer，Betaine 0.075 mol·L-1，MgSO43 mmol·L-1，dNTPs 0.4 mmol·L-1，BstDNA 聚合酶9.6 U，F(xiàn)3 0.5 μmol·L-1，B3 0.5 μmol·L-1，CPR 1 μmol·L-1，DF5F 0.7 μmol·L-1，DF5B 0.9 μmol·L-1，模板DNA 4 μL，無(wú)核酸酶水補(bǔ)足至20 μL。最佳反應(yīng)條件為58 ℃下恒溫?cái)U(kuò)增50 min。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Marker Ⅰ；泳道1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21分別為引物濃度組合1～11的陰性對(duì)照；泳道2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22分別為引物濃度組合1～11的陽(yáng)性模板擴(kuò)增結(jié)果M.DNA marker Ⅰ；Lane 1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21.Negative control of different concentration combinations of primers 1-11，respectively；Lane 2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22.Positive control of different concentration combinations of primers 1-11，respectively圖2　不同濃度引物及比例對(duì)擴(kuò)增效果的影響Fig.2　The amplification effects of different primer concentrations and ratios

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Marker Ⅰ；泳道1、3、5、7、9、11.分別為56、58、60、62、64、66 ℃的陰性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果；泳道2、4、6、8、10、12.分別為56、58、60、62、64、66 ℃的陽(yáng)性模板擴(kuò)增結(jié)果M.DNA marker Ⅰ；Lane 1，3，5，7，9，11.Negative control of 56，58，60，62，64，66 ℃；Lane 2，4，6，8，10，12.Positive control of 56，58，60，62，64，66 ℃圖3　不同溫度對(duì)擴(kuò)增效果的影響Fig.3　The amplification effects of different temperatures

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Marker Ⅰ；泳道1.陰性對(duì)照擴(kuò)增90 min的電泳結(jié)果；泳道2～9.分別為陽(yáng)性模板擴(kuò)增15、30、45、50、55、60、75、90 min的電泳結(jié)果M.DNA marker Ⅰ；Lane 1.Negative control of 90 min；Lane 2-9.Positive control of 15，30，45，50，55，60，75，90 min圖4　不同時(shí)間對(duì)擴(kuò)增效果的影響Fig.4　The amplification effects of different time

2.5PCV2-CPA交叉反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果

用PCV2-CPA最佳反應(yīng)體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示：僅PCV2質(zhì)粒DNA和病毒DNA出現(xiàn)典型的梯形擴(kuò)增條帶，而PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV、PEDV、TGEV、RV和陰性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后均未見(jiàn)明顯的擴(kuò)增條帶(圖5)，表明建立的PCV2-CPA 檢測(cè)技術(shù)特異性很好。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Marker Ⅰ；1.陰性對(duì)照；2～11.分別為PCV2質(zhì)粒、PCV2病毒、PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV、PEDV、TGEV和RV的CPA擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA marker Ⅰ；1.Negative control；2-11.Amplification products of PCV2 plasmid，PCV2，PCV1，PRV，CSFV，PRRSV，F(xiàn)MDV，PEDV，TGEV and RV，respectively圖5　PCV2-CPA特異性檢測(cè)Fig.5 The specificity of PCV2-CPA detection

2.6PCV2-CPA方法與常規(guī)PCR法靈敏度比較結(jié)果

用PCV2-CPA最佳反應(yīng)體系進(jìn)行靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示：7.6×100～7.6×1010拷貝·μL-1均有大量擴(kuò)增，7.6×10-1、7.6×10-2拷貝·μL-1和陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增 (圖6)，即建立的CPA方法最低檢出限為7.6 拷貝·μL-1。常規(guī)PCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示，僅7.6×101～7.6×1010拷貝·μL-1擴(kuò)增有目的條帶 (圖7)，即常規(guī)PCR法的最低檢出限為76 拷貝·μL-1。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Marker Ⅰ；1.陰性對(duì)照；2～14.分別為7.6×1010～7.6×10-2 拷貝·μL-1的CPA擴(kuò)增產(chǎn)物M.MarkerⅠ；1.Negative control；2-14.Amplification products of 7.6×1010 -7.6×10-2 copies·μL-1，respectively圖6　PCV2-CPA靈敏性檢測(cè)Fig.6　The sensitivity of PCV2-CPA detection

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Marker Ⅰ；1.陰性對(duì)照；2～14.分別為7.6×1010～7.6×10-2 拷貝·μL-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA marker Ⅰ；1.Negative control；2-14.PCR amplification products of 7.6×1010-7.6×10-2 copies·μL-1，respectively圖7　PCV2常規(guī)PCR方法靈敏性檢測(cè)Fig.7　The sensitivity of conven tional PCR detection

2.7PCV2-CPA的可視化試紙條檢測(cè)

應(yīng)用核酸試紙條檢測(cè)裝置對(duì)“2.5、2.6”中CPA方法的各擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果顯示，僅PCV2病毒DNA和質(zhì)粒DNA陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性，其他均為陰性結(jié)果，該結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致(圖8)，靈敏度擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果也與其瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果一致(圖9)。

1.陰性對(duì)照；2～11.分別為PCV2質(zhì)粒、PCV2病毒、PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、FMDV、PEDV、TGEV和RV的CPA擴(kuò)增產(chǎn)物核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果1.Negative control；2-11.Amplification products of PCV2 plasmid，PCV2，PCV1，PRV，CSFV，PRRSV，F(xiàn)MDV，PEDV，TGEV and RV，respectively圖8　核酸試紙條檢測(cè)裝置對(duì)PCV2-CPA特異性檢測(cè)Fig.8　Results of the specificity test of PCV2-CPA detected by nucleic acid test strip

1.陰性對(duì)照；2～14.分別為7.6×1010～7.6×10-2 拷貝·μL-1的CPA擴(kuò)增產(chǎn)物核酸試紙條檢測(cè)結(jié)果1.Negative control；2-14，amplification products of 7.6×1010-7.6×10-2 copies·μL-1，respectively圖9　核酸試紙條檢測(cè)裝置對(duì)PCV 2-CPA靈敏性檢測(cè)Fig.9　Results of the sensitivity test of PCV 2-CPA detected by nucleic acid test strip

2.8不同方法臨床樣品檢測(cè)的敏感性、特異性、符合率比較結(jié)果

用建立的CPA方法、常規(guī)PCR方法和ELISA方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行檢測(cè)，73份標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品中，CPA、PCR和ELISA檢測(cè)出的真陽(yáng)性樣品數(shù)分別為69、66和57份，54份標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品中，檢測(cè)出的真陰性樣品數(shù)分別為47、49和50份，三種方法的敏感性、特異性和符合率詳見(jiàn)表4。

采用SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件，得到ROC曲線圖(圖10)。曲線下面積大小顯示各方法的診斷性能，綜合評(píng)定為CPA>PCR>ELISA。

3　討　論

IFA是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)豬圓環(huán)病毒的經(jīng)典方法，但由于PCV 1和PCV 2存在抗原交叉反應(yīng)[9]，抗原檢

表43種檢測(cè)方法的敏感性、特異性和符合率比較

Table 4Comparison for sensitivity，specificity and consistency of three kinds of methods %

圖10　ROC曲線圖Fig.10　Receiver operating characteristic curve

測(cè)受制備的PCV2 抗體特異性影響很大。本試驗(yàn)中采用美國(guó)VMRD公司的抗PCV2特異性豬血清，此血清只能與PCV2發(fā)生特異性反應(yīng)，而不與PCV1發(fā)生反應(yīng)，保證了金標(biāo)準(zhǔn)法檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)可靠。然而，IFA方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，只能在實(shí)驗(yàn)室操作，且存在潛在散毒危險(xiǎn)，不適用于臨床快速診斷。ELISA方法是一種可用于臨床快速診斷的檢測(cè)方法，本試驗(yàn)結(jié)果顯示ELISA方法相對(duì)于其他分子診斷方法敏感性不高。ELISA方法操作要經(jīng)過(guò)多次洗板，孵育溫度、孵育時(shí)間及嚴(yán)格避光這些因素任何一步操作失誤都將影響結(jié)果。又因ELISA方法信號(hào)只經(jīng)過(guò)了酶聯(lián)放大，而分子診斷通過(guò)對(duì)目標(biāo)片段的指數(shù)式擴(kuò)增，在較短時(shí)間內(nèi)可將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍，因而，ELISA方法的敏感性自然很難達(dá)到分子診斷方法的敏感性?，F(xiàn)有的PCV2分子檢測(cè)方法主要是PCR及其衍生技術(shù)，這些檢測(cè)技術(shù)依賴于昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，雖效果較好，但只適用于實(shí)驗(yàn)室的病原檢測(cè)。PMWS的快速早期診斷是疾病防控的重要前提，本研究建立的豬圓環(huán)病毒2型交叉引物擴(kuò)增檢測(cè)方法，只需簡(jiǎn)單的恒溫設(shè)備(水浴鍋或金屬浴)即可于現(xiàn)場(chǎng)對(duì)病原進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果判定快速、客觀，擴(kuò)增產(chǎn)物不會(huì)造成氣溶膠污染，整個(gè)過(guò)程1 h左右即可完成。

PCV有ORF 1和ORF 2兩個(gè)主要的閱讀框，ORF 1編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的Rep蛋白，是PCV1和PCV2產(chǎn)生抗原交叉性的主要原因；ORF 2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白Cap，是分子水平上診斷區(qū)分PCV1和PCV2的理想靶基因。本試驗(yàn)中以Cap為靶基因，設(shè)計(jì)一套CPA檢測(cè)引物，其中對(duì)引物DF5F和DF5B的5′端分別標(biāo)記FITC和Biotin，以便使用一次性核酸檢測(cè)裝置對(duì)PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測(cè)。CPA檢測(cè)特異性和靈敏性與反應(yīng)體系中的各組分濃度有很大關(guān)系，其中引物自身的序列結(jié)構(gòu)和濃度比例對(duì)擴(kuò)增起決定性作用[10]。因此，在引物設(shè)計(jì)時(shí)對(duì)部分堿基進(jìn)行了更改以減少錯(cuò)配和引物間的互配，進(jìn)而提高其特異性，然后對(duì)引物濃度比例、MgSO4濃度、dNTPs濃度、Bst酶量、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，最終確立了CPA最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

本試驗(yàn)中各引物(CPR、DF5F、DF5B、F3、B3)的比例為1∶0.7∶0.6∶0.5∶0.5，與翟聰聰?shù)萚11]的結(jié)果相似(1∶0.6∶0.6∶0.2∶0.2)，外引物F3和B3需要量最少，探針DF5F和DF5B其次，交叉引物CPR量最多，這與引物工作原理相符。Betaine對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大，少量Betaine存在時(shí)，有特異性擴(kuò)增，超過(guò)0.4 mol·L-1時(shí)無(wú)擴(kuò)增；但當(dāng)體系中不添加Betaine時(shí)，有非特異性擴(kuò)增，這可能是因?yàn)轶w系中一定量的Betaine能提高對(duì)目的基因的選擇性，降低非目的基因?qū)怂釘U(kuò)增的干擾[12]。Mg2+能與Bst聚合酶上的活性位點(diǎn)相結(jié)合[13]，當(dāng)Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，對(duì)Bst聚合酶幾乎沒(méi)有催化作用，酶的活性降低，此反應(yīng)中不添加硫酸鎂也有擴(kuò)增，可能是因?yàn)锽uffer中有Mg2+存在；隨著Mg2+濃度的增加，其催化作用增強(qiáng)擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增多，但Mg2+濃度過(guò)高時(shí)，又會(huì)抑制Bst聚合酶的活性而導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物減少，這與王璐璐[8]的報(bào)道一致。擴(kuò)增溫度也會(huì)影響B(tài)st聚合酶的活性[14]，本試驗(yàn)中，體系在56～62 ℃范圍內(nèi)均能較好擴(kuò)增，其中58 ℃時(shí)擴(kuò)增效果最好，64 ℃時(shí)擴(kuò)增效率明顯降低，66 ℃時(shí)無(wú)擴(kuò)增，此擴(kuò)增溫度比已報(bào)道的其他CPA擴(kuò)增溫度和PCV2-LAMP的擴(kuò)增溫度都低，這可能與選擇的引物位置有關(guān)系。擴(kuò)增時(shí)間也是影響擴(kuò)增效率的一大因素，當(dāng)擴(kuò)增時(shí)間低于30 min時(shí)幾乎無(wú)擴(kuò)增，45 min時(shí)有明顯擴(kuò)增，50 min時(shí)達(dá)到最大擴(kuò)增，此后延長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)間靈敏度不變，因此建議擴(kuò)增時(shí)間為50 min。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)是另外一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，與CPA一樣不需要PCR儀、擴(kuò)增效率比PCR高。已有學(xué)者將LAMP技術(shù)應(yīng)用到PCV2的檢測(cè)中，胡瑞麗等[15]建立的豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測(cè)方法在59 ℃擴(kuò)增55 min可以檢測(cè)到10 拷貝·μL-1的PCV2 病毒DNA，楊澤曉等[7]建立的PCV2-LAMP檢測(cè)方法在64 ℃擴(kuò)增45 min檢測(cè)限可以達(dá)到10 拷貝·μL-1，擴(kuò)增結(jié)果通過(guò)核酸瓊脂糖凝膠電泳、反應(yīng)液渾濁度變化和熒光染料判讀。作者建立的CPA檢測(cè)體系58 ℃擴(kuò)增50 min檢測(cè)限為7.6 拷貝·μL-1，靈敏度比常規(guī)PCR高10倍，與熒光定量PCR檢測(cè)方法和已建立的LAMP檢測(cè)方法相近[6]，且檢測(cè)方法引入可視化核酸檢測(cè)試紙條，對(duì)反應(yīng)結(jié)果的判讀更加直觀、客觀、快捷，且不開(kāi)蓋電泳，不會(huì)造成氣溶膠污染。

4　結(jié)　論

建立的豬圓環(huán)病毒2型交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增(PCV2-CPA)可視化檢測(cè)方法，是首次將交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與核酸試紙條相結(jié)合應(yīng)用于PCV2檢測(cè)的研究。簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，結(jié)果直觀。檢測(cè)靈敏度是常規(guī)PCR的10倍，與熒光定量PCR和LAMP一致，與IFA符合率達(dá)到91.34%；1 h左右即可對(duì)提取的病原核酸是否含PCV2進(jìn)行可視化觀察，且與其他類似癥狀病原無(wú)交叉反應(yīng)，可特異性檢測(cè)PCV2，可應(yīng)用于PCV2的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。該檢測(cè)方法的建立對(duì)豬圓環(huán)病毒2型養(yǎng)殖場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)快速診斷和生物安全防控提供了技術(shù)支撐。

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(編輯白永平)

Establishment of Cross Priming Isothermal Amplification for Porcine Circovirus 2 Detection

YUAN Dan-yi1，JIN Ya-nan2，LI Ling1，HE Qian1，HU Lin2，LI Xiao-qi1，SUN Zhi-yong1

(1.SichuanNaBiiBiologicalTechnologyCo.，Ltd.，Chengdu610041，China；2.UstarBiotechnologies(Hangzhou)Ltd.，Hangzhou310053，China)

This experiment was conducted to establish a simple，sensitive and rapid detection method for the biosecurity control of the porcine circovirus 2 (PCV2) diseases.TheCapgene of PCV2 was used as the signature sequence for cross amplification primers design and the constructedCapgene plasmid DNA was used as the standard template.Amplification temperature，time and constituents of the reaction，including concentration of primers，MgSO4，dNTP，Betaine andBstDNA polymerase were systematically optimized.Used the nucleic acid test strip detect the amplified products，compared the sensitivity，specificity and consistency of CPA，PCR and ELISA by 127 standard clinical samples.The detection results showed that the cross amplification could be realized at 58 ℃ within 50 min，could specifically detect PCV2 with a sensitivity that was about 10 times higher than conventional PCR method.The detection limit of recombinant plasmid was 7.6 copies·μL-1and the assay gave no amplification from PCV1，PRV，CSFV，PRRSV，PEDV，TGEV and RV.The final optimal CPA condition established for rapid detection of PCV2 was as follows：0.5 μmol·L-1each of F3 and B3，1.0 μmol·L-1of CPR，0.7 μmol·L-1of DF5F，0.9 μmol·L-1of DF5B，0.075 mol·L-1Betaine，3 mmol·L-1MgSO4， 0.4 mmol·L-1dNTPs，9.6 UBstDNA polymerase，2 μL 10×ThermoPol?Reaction Buffer，4 μL templates and sterilized double-distilled water in 20 μL volumes.The sensitivity，specificity and consistency were 78.08% to 94.52%，87.03% to 92.59% and 84.25% to 91.34% among the three methods，respectively.Receiver operating characteristic curve showed that CPA was the best detection method. PCV2 cross priming amplification method does not require expensive equipment and skilled technicians，the visual detection could provide an intuitive and objective decision for people，and could also effectively avoid the aerosol pollution，which could be used in the on-site diagnosis for effective prevention and control of porcine circovirus 2 diseases.

porcine circovirus 2；cross primer；isothermal amplification；detection；aerosol pollution；biosecurity control

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.020

2016-03-03

2015年度勃林格中國(guó)豬圓環(huán)病毒病研究進(jìn)步獎(jiǎng)項(xiàng)目

袁旦一(1988-)，女，四川成都人，碩士，主要從事動(dòng)物疫病體外分子診斷的研究，E-mail: danielle.yuandanyi@scnabii.com

S852.659.2

A

0366-6964(2016)09-1905-09

作者簡(jiǎn)介：袁旦一