任艷萍，謝亮亮，李海艷，石德順*，李湘萍*

(1.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004； 2.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遵義 563003)

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轉(zhuǎn)PRL基因小鼠遺傳性狀分析

任艷萍1，2，謝亮亮1，李海艷1，石德順1*，李湘萍1*

(1.廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004； 2.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遵義 563003)

本研究以原核注射法生產(chǎn)的乳腺特異性表達(dá)PRL基因小鼠為模型，從外源基因遺傳完整性、拷貝數(shù)和插入位點(diǎn)3方面對其進(jìn)行遺傳性狀分析，為今后大型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的選育提供基礎(chǔ)。采用基因組DNA PCR方法篩選發(fā)生外源基因片段部分缺失的小鼠，并進(jìn)行Southern blot驗(yàn)證，以檢測外源基因的遺傳完整性；用絕對熒光定量PCR方法測定外源基因拷貝數(shù)，用Genome walking方法分析外源基因整合位點(diǎn)。結(jié)果顯示，外源基因片段部分缺失率為1.91%；整合十幾個(gè)拷貝外源基因的小鼠在便攜UV燈下可見綠色熒光，整合2個(gè)拷貝的小鼠無綠色熒光；在NW_001073945.1序列的2 025～2 026 bp和NW_001030574.1序列的10 760 020～10 760 021 bp處插入的外源基因可正常表達(dá)。以上結(jié)果說明，外源PRL基因在原核注射法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因小鼠中可穩(wěn)定遺傳；在一定范圍內(nèi)，外源基因的表達(dá)量與拷貝數(shù)呈正相關(guān)；附近無其他基因的外源基因插入位點(diǎn)有利于外源基因的表達(dá)。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；遺傳性狀；原核注射；外源基因插入位點(diǎn)；拷貝數(shù)

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在基礎(chǔ)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、藥物開發(fā)及繁殖育種等領(lǐng)域中應(yīng)用較廣泛，常用的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方法包括原核注射法[1]、體細(xì)胞核移植法[2]、精子載體法[3]、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法[4]等。原核注射法由于可導(dǎo)入大基因片段、無體細(xì)胞核移植中的重編程不徹底[5]、無精子載體法中重復(fù)性差[5]、亦無逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法中存在病毒DNA序列整合等問題，其在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因小鼠生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。

原核注射法所生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，外源基因的整合位點(diǎn)存在隨機(jī)性，因此外源基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)是否表達(dá)以及表達(dá)水平的高低受遺傳完整性[6-8]、外源基因拷貝數(shù)[9-10]和外源基因插入位點(diǎn)[11]等諸多遺傳性狀的影響。因此，在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代的選育中，有必要對其遺傳性狀進(jìn)行分析。但大型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物存在選育周期長，費(fèi)用高等問題。為此，本研究以原核注射轉(zhuǎn)基因小鼠為模型，從外源基因遺傳完整性、外源基因拷貝數(shù)以及外源基因插入位點(diǎn)3方面，對已建立的乳腺特異性表達(dá)PRL基因小鼠模型的遺傳性狀進(jìn)行了分析。為今后轉(zhuǎn)基因水牛等大型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代的選育奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1轉(zhuǎn)基因小鼠的擴(kuò)繁

挑選經(jīng)基因組DNA PCR鑒定的轉(zhuǎn)PRL基因小鼠，定為F0代。將F0代轉(zhuǎn)基因小鼠與野生型同種FVB小鼠雜交得到F1代，并在出生后3 d用便攜式長波UV燈觀測子代小鼠綠色熒光表達(dá)情況。

1.2轉(zhuǎn)基因小鼠PCR鑒定

將出生21 d的小鼠用4%苦味酸進(jìn)行編號(hào)，用酚/酚仿/氯仿依次抽提法，提取小鼠尾尖組織的基因組DNA。分別以T-PRL和CMV 為引物擴(kuò)增外源PRL基因和cmv啟動(dòng)子；mACTB為引物擴(kuò)增內(nèi)參基因β-actin片段(表1)。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，60.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸55 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min；4 ℃保存。

表1轉(zhuǎn)基因小鼠檢測引物

Table 1Primers used in the transgenic mice detection

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence使用目的AimT-PRLF:ACCCCCGTCTGTCCCAATR:GATTTTGACATCGCTACAGAGT檢測PRL基因mACTBF:CATCCGTAAAGACCTCTATGCR:ACATCTGCTGGAAGGTGGAC檢測β-actin基因CMVF:GTTATCCCCTGATTCTGTGGR:ATAGACCTCCCACCGTACAC檢測cmv啟動(dòng)子

1.3Southern blot分析

利用Roche公司DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit對轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA進(jìn)行Southern blot鑒定。首先，用BamH I和KpnI酶切pPRL質(zhì)粒，膠回收純化PRL片段，地高辛標(biāo)記后作為探針貯存在-20 ℃?zhèn)溆?。用BamH I酶切20 μL小鼠基因組DNA，乙醇沉淀后按試劑盒中所述步驟進(jìn)行Southern blot操作。

1.4外源基因拷貝數(shù)分析

表2外源基因拷貝數(shù)分析引物

Table 2Primers used in detecting the copy number of exogenous gene

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence使用目的AimFabpiF:TGGACAGGACTGGACCTCTGCTTTCCTAGAR:TAGAGCTTTGCCACATCACAGGTCATTACG定量檢測Fabpi基因Q-PRLF:GCTGCCATACCTCCTCCR:GGTGACTAGGTGATACAGAGG定量檢測PRL基因

1.5外源基因整合位點(diǎn)分析

用Genome walking方法分析外源基因整合位點(diǎn)。首先在距轉(zhuǎn)基因載體5′端約500 bp處，由內(nèi)向外依次設(shè)計(jì)3條退火溫度為65 ℃的下游引物(表3)。按照Genome walking試劑盒說明書步驟(圖1)，以小鼠基因組DNA作為模板，用cmvSp1、cmvSp2、cmvSp3引物與隨機(jī)引物進(jìn)行3次曹氏PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后、TA克隆到pMD-18T載體中測序。所得序列先與轉(zhuǎn)基因載體行同源性比對，并將未對比上的序列與小鼠基因組序列進(jìn)行Blast比對，以確定外源基因的整合位點(diǎn)。

圖1　Genome walking方法及引物示意圖Fig.1　Sketch map of Genome walking method and primers

表3外源基因整合位點(diǎn)分析引物

Table 3Primers used in Genome Walking analysis

引物名稱Primername引物序列(5'-3')Primersequence使用目的AimcmvSp1CGTGAGTCAAACCGCTATCCcmv端引物cmvSp2ACCGCATCACCATGGTAATAGcmv端引物cmvSp3CCTATTGGCGTTACTATGGGAAcmv端引物

2　結(jié)　果

2.1外源基因在F1代轉(zhuǎn)基因小鼠中的遺傳完整性分析

將F0代轉(zhuǎn)PRL基因小鼠與野生型FVB小鼠雜交得到F1代小鼠。以野生型小鼠DNA為陰性對照，ddH2O為空白對照，基因組PCR分別擴(kuò)增目的基因PRL以及標(biāo)記基因啟動(dòng)子cmv片段。結(jié)果顯示，2、3、4和5號(hào)樣品可擴(kuò)增得到 752 bp的PRL片段；2、3、4、5和7號(hào)樣品可擴(kuò)增得到599 bp的cmv片段(圖2A)。其中7號(hào)小鼠基因組外源PRL片段缺失，僅有cmv片段。為驗(yàn)證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，以PRL基因?yàn)樘结槪ㄟ^Southern blot方法檢測這幾只小鼠。結(jié)果顯示，2、3、4和5號(hào)小鼠有外源PRL片段整合(圖2B)，與基因組PCR結(jié)果一致，表明基因組PCR的結(jié)果準(zhǔn)確可信。對16窩共157只F1代小鼠基因組進(jìn)行基因組PCR分析，共發(fā)現(xiàn)3只小鼠基因組中存在外源基因片段部分缺失，且缺失片段均為PRL，缺失發(fā)生率為1.91%(表4)。以上結(jié)果表明，外源基因在遺傳過程中有一定的概率發(fā)生片段缺失，但概率較低；多數(shù)情況下，外源基因可完整地遺傳給后代。

2.2轉(zhuǎn)PRL基因小鼠外源基因拷貝數(shù)分析

比對轉(zhuǎn)基因小鼠的熒光檢測結(jié)果與基因組PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，部分?jǐn)y帶外源基因的小鼠在便攜UV燈下無綠色熒光，推測這可能與外源基因的拷貝數(shù)有關(guān)。為此，選擇3只經(jīng)鑒定攜帶外源基因的小鼠，UV燈下1號(hào)和2號(hào)有明顯的綠色熒光，3號(hào)無綠色熒光。采用絕對定量熒光PCR法分析外源PRL基因的整合數(shù)。分別對pPRL和pFabpi的標(biāo)準(zhǔn)品做回歸曲線，R2分別為0.995和0.998，擴(kuò)增效率分別為105.154%和105.191%(圖3)，表明本次熒光定量PCR結(jié)果可信。定量分析結(jié)果顯示，1號(hào)和2號(hào)小鼠的外源基因拷貝數(shù)較高，分別為14.0和12.1個(gè)，3號(hào)小鼠的外源基因拷貝數(shù)較低，為1.9個(gè)拷貝(表5)。結(jié)果表明，外源基因的表達(dá)情況與外源基因拷貝數(shù)呈正相關(guān)。

A.基因組PCR結(jié)果；B.Southern blot結(jié)果；M1.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、18.野生型小鼠；2、11.F1代1號(hào)小鼠；3、12.F1代2號(hào)小鼠；4、13.F1代3號(hào)小鼠；5、14.F1代4號(hào)小鼠；6、15.F1代5號(hào)小鼠；7、16：F1代6號(hào)小鼠；8、17：F1代7號(hào)小鼠；9.空白對照；10.陽性對照A.PCR results of the genome DNA；B.Results of Southern blot detection；M1.DNA Marker III；M2.1 kb DNA Ladder；1，18.The wild-type mouse；2，11.The mouse No.1 in the F1 generation；3，12.The mouse No.2 in the F1 generation；4，13.The mouse No.3 in the F1 generation；5，14.The mouse No.4 in the F1 generation；6，15.The mouse No.5 in the F1 generation；7，16.The mouse No.6 in the F1 generation；8，17.The mouse No.7 in the F1 generation；9.The blank control；10.The positive control圖2　外源基因遺傳穩(wěn)定性分析Fig.2　The genetic stability analysis of exogenous gene

2.3轉(zhuǎn)PRL基因小鼠外源基因整合位點(diǎn)分析

選擇2只在便攜UV燈下有明顯綠色熒光的轉(zhuǎn)基因小鼠，以其基因組DNA為模板，用Genome walking法分析外源基因整合位點(diǎn)。電泳結(jié)果顯示，經(jīng)過3次PCR，2個(gè)小鼠基因組均可擴(kuò)增出一條2 000～3 000 bp的特異性片段(圖4A為1號(hào)小鼠，2號(hào)小鼠圖片未給出)?；厥占兓撈?1號(hào)小鼠如圖4B，2號(hào)小鼠圖片未給出)并TA克隆到pMD-18T載體中，得到5 026～6 133 bp的pMD-18T-cmvSp3質(zhì)粒(1號(hào)小鼠如圖4C，2號(hào)小鼠圖片未給出)。經(jīng)測序，將得到的序列分別與轉(zhuǎn)基因載體5′端cmv序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)1號(hào)和2號(hào)小鼠的序列中有210 bp的cmv同源序列，同源率100%(1號(hào)小鼠如圖4D，2號(hào)小鼠的圖片未給出)。去除cmv同源序列，將剩余未知序列與小鼠基因組進(jìn)行Blast對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1號(hào)和2號(hào)小鼠分別與小鼠基因組中的NW_001073945.1和NW_001030574.1序列同源性較高，分別為99%和84%(1號(hào)小鼠如圖4E，2號(hào)小鼠的圖片未給出)。其中，NW_001073945.1序列全長2 464 bp，尚未定位到染色體中，未發(fā)現(xiàn)該段序列中存在基因編碼，外源基因于2 025～2 026 bp處反向插入；NW_001030574.1位于15號(hào)染色體中，外源基因于10 760 020～10 760 021 bp處反向插入，該位點(diǎn)上下游20 kb內(nèi)無基因編碼。以上結(jié)果說明，這2只表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，外源基因插入位點(diǎn)附近均無其他基因編碼。

表4外源基因部分片段缺失率

Table 4The losing rate of exogenous gene fragment

代數(shù)Generation窩數(shù)Nest總只數(shù)Number片段缺失只數(shù)Thenumberoflosingfragment缺失率/%ThelosingrateF16615731.91

表5外源基因整合數(shù)分析結(jié)果

Table 5The copy number of exogenous gene in transgenic mice genome

編號(hào)Number基因Gene平均Ct值TheCtaveragevalue拷貝數(shù)Thecopynumber整合數(shù)Theintegrationnumber1PRLFapbi16.61920.537221945115818514.02PRLFapbi17.45021.24712213289497112.13PRLFapbi19.32720.5113168741612181.9

圖3　外源基因整合數(shù)分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　The standard curve for the copy number analysis of exogenous gene in transgenic mice genome

A.Genome walking PCR；B.第三次PCR產(chǎn)物膠回收；C.質(zhì)粒pMD-18T-cmvSp3；D.同源性分析；E.NCBI Blast結(jié)果；M1.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；M2.DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.cmvSp3引物PCR產(chǎn)物；2.cmvSp2引物PCR產(chǎn)物；3.cmvSp1引物PCR產(chǎn)物；4.cmvSp3片段；5.質(zhì)粒pMD-18T-cmvSp3A.Genome walking PCR；B.The third PCR fragment after purification；C.The pMD-18T-cmvSp3 vector；D.Homology analysis；E.Blast analysis with mouse genome from NCBI；M1.DNA Marker III；M2.Supercoiled DNA Ladder Marker；1.The third PCR results with cmvSp3 primer；2.The second PCR results with cmvSp2 primer；3.The first PCR results with cmvSp1 primer；4.cmvSp3 fragment；5.pMD-18T-cmvSp3 vector圖4　外源基因整合位點(diǎn)分析結(jié)果Fig.4　The results of exogenous gene integration site in transgenic mice

3　討　論

原核注射法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，外源基因隨機(jī)插入基因組[12]。與外源基因插入位點(diǎn)相對應(yīng)的同源染色體上對應(yīng)序列，在同源染色體配對時(shí)，插入位點(diǎn)附近可能發(fā)生重組或修復(fù)，出現(xiàn)外源基因片段全部或部分丟失的現(xiàn)象。A.R.Migliaccio等在細(xì)胞水平上研究發(fā)現(xiàn)，僅有少數(shù)幾個(gè)特定位點(diǎn)上的外源基因能夠穩(wěn)定遺傳，絕大多數(shù)整合位點(diǎn)上的外源基因會(huì)在傳代過程中發(fā)生丟失[13]。在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中，外源基因可以穩(wěn)定地遺傳給后代[6-7]。顏景斌等利用多對引物PCR檢測F0至F4代轉(zhuǎn)基因小鼠，未發(fā)現(xiàn)外源基因片段丟失[8]。B.Aigner等研究發(fā)現(xiàn)，即使拷貝數(shù)高達(dá)73的轉(zhuǎn)基因小鼠在與野生型小鼠雜交也未發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)丟失；但在插入位點(diǎn)不同轉(zhuǎn)基因小鼠間雜交時(shí)，高拷貝轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)存在較低概率的拷貝數(shù)丟失的問題[14]。本研究對157只PRL轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了外源基因完整性分析，發(fā)現(xiàn) 1.91%的位于轉(zhuǎn)基因載體6.9 kb后的PRL片段缺失，表明外源基因在很大程度上可以穩(wěn)定遺傳給后代，但也存在一定的丟失概率，其丟失率可能受外源基因長度的影響。

已有研究發(fā)現(xiàn)，外源基因表達(dá)情況受插入位點(diǎn)附近基因的干擾，即轉(zhuǎn)錄干擾[11]。當(dāng)一定空間內(nèi)存在兩個(gè)基因時(shí)，這兩個(gè)基因表達(dá)量均顯著低于僅有一個(gè)基因時(shí)的表達(dá)量[15]。轉(zhuǎn)錄干擾的強(qiáng)弱與兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄方向有關(guān)，相向型高，背離型最弱，順勢串聯(lián)型居中[15]。本研究分析轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因插入位點(diǎn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有明顯綠色熒光蛋白表達(dá)的小鼠，其外源基因的插入位點(diǎn)附近上下20 kb無其他基因，不存在轉(zhuǎn)錄干擾問題，而本研究所驗(yàn)證的這兩個(gè)基因插入位點(diǎn)NW_001073945.1序列的2 025～2 026 bp處和NW_001030574.1序列的10 760 020～10 760 021 bp處，可作為今后外源基因定點(diǎn)插入的候選插入位點(diǎn)。

外源基因表達(dá)水平除會(huì)受到其遺傳穩(wěn)定性和插入位點(diǎn)的影響外，還受外源基因拷貝數(shù)的影響。原核注射法生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，外源基因在同一個(gè)位點(diǎn)往往存在多個(gè)拷貝[16]。在一定范圍內(nèi)，外源基因的表達(dá)水平與其拷貝數(shù)成正比[10]，但拷貝數(shù)過高時(shí)，外源基因的表達(dá)會(huì)被抑制甚至沉默。B.Aigner等發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠中外源基因的拷貝數(shù)與基因表達(dá)量在一定程度內(nèi)呈正相關(guān)[9]。D.Garrick等研究表明，高拷貝致使外源基因甲基化程度增加，基因表達(dá)水平下降[17]。本試驗(yàn)用雙酶切對轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)行線性化，粘性末端不互補(bǔ)，所得轉(zhuǎn)基因小鼠外源基因的拷貝數(shù)為2～14個(gè)，未發(fā)現(xiàn)高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)基因小鼠，外源標(biāo)記基因的表達(dá)水平與拷貝數(shù)呈正相關(guān)，該結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。

4　結(jié)　論

綜上，本研究從外源基因的遺傳穩(wěn)定性、插入位點(diǎn)和拷貝數(shù)3個(gè)方面分析了轉(zhuǎn)PRL基因小鼠的遺傳性狀。結(jié)果顯示，在遺傳穩(wěn)定性上，存在較低的外源基因片段丟失率，在絕大多數(shù)情況下，外源基因可以穩(wěn)定遺傳給后代；在外源基因插入位點(diǎn)上，附近無其他基因存在的外源基因插入位點(diǎn)有利于外源基因的正常表達(dá)，而本研究所驗(yàn)證的兩個(gè)插入位點(diǎn)可作為今后外源基因定點(diǎn)插入的候選位點(diǎn)；在一定的拷貝數(shù)范圍內(nèi)，外源標(biāo)記基因的表達(dá)水平與拷貝數(shù)呈正相關(guān)，10個(gè)拷貝數(shù)以上的轉(zhuǎn)基因小鼠方可用便攜UV燈檢測綠色熒光蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果可為今后大型轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的選育奠定基礎(chǔ)。

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(編輯郭云雁)

The Genetic Traits Analysis ofPRLTransgenic Mice

REN Yan-ping1，2，XIE Liang-liang1，LI Hai-yan1，SHI De-shun1*，LI Xiang-ping1*

(1.StateKeyLaboratoryofSubtropicalBioresourceConservationandUtilization，GuangxiUniversity，Nanning530004，China；2.SchoolofBasicMedicalSciences，ZunyiMedicalUniversity，Zunyi563003，China)

In order to provide the foundation for breeding large transgenic animals in futher，in this study，the genetic traits of mammary gland-specificPRLtransgenic mice produced by pronuclear microinjection，were analyzed from the genetic integrity，the copy number and the inserting site of exogenous gene.The transgenic mice deleted partially exogenous gene were screened by genomic DNA PCR method，and were verified by Southern blot to detect the genetic stability of exogenous gene.The copy number of exogenous gene in transgenic mice was detected by absolute real-time fluorescence quantitative PCR method.The inserting site of exogenous gene in transgenic mice was analyzed by Genome walking method.The results showed that the losing rate of exogenous gene fragment was 1.91%.The green fluorescence signal was observed under the long-wave UV lamp in the transgenic mice integrated higher copies of exogenous gene，while not observed in the transgenic mice integrated 2 copies of exogenous genes.The exogenous gene expressed normally in the 2 025-2 026 bp site of NW_001073945.1 gene and the 10 760 020-10 760 021 bp site of NW_001030574.1 gene.The result indicated that the exogenous gene could be inherited stablely in the transgenic mice produced by pronuclear microinjection，the expression level was positively correlated with the copy number of exogenous gene in certain range，and it was beneficial for the exogenous gene expression while there was no other genes nearby the inserting site.

transgenic animal；genetic traits；pronuclear microinjection；the inserting site of exogenous gene；copy number

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.09.015

2015-12-17

國家轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)(2014ZX08007-001)；國家自然科學(xué)基金(31560632)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFAA118084)

任艷萍(1986-)，女，河南人，博士，主要從事胚胎工程研究，E-mail：ypren@foxmail.com

石德順，博士，研究員，主要從事胚胎工程研究，E-mail：ardsshi@gxu.edu.cn；李湘萍，博士，研究員，主要從事胚胎工程研究，E-mail：xiangpingli@163.com

S865.13

A

0366-6964(2016)09-1861-07