邱自貴 ，趙萬樂 ，陳二平 ，李艷玲 ，朱松波

（1.河南省新縣畜牧局，河南 信陽 465000；2.鄭州市農(nóng)林科學研究所，河南 鄭州 450005）

含N-乙酰半胱氨酸稀釋液對雞精液低溫保存效果的影響

邱自貴1，趙萬樂2，陳二平2，李艷玲2，朱松波2

（1.河南省新縣畜牧局，河南 信陽 465000；2.鄭州市農(nóng)林科學研究所，河南 鄭州 450005）

采集安卡紅種公雞鮮精，分別用含不同濃度N-乙酰半胱氨酸的A、B 2種稀釋液稀釋后低溫保存，之后測定保存時間、生存指數(shù)和精子畸形率，比較不同濃度的N-乙酰半胱氨酸對雞精液在低溫保存下的效果。結(jié)果表明：A液中，0.0130mol/L添加量和0.0026mol/L添加量相比保存時間和生存指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05），且均極顯著（P＜0.01）高于A液無添加組；B液中，0.0130mol/L添加量在保存時間和生存指數(shù)方面均極顯著（P＜0.01）優(yōu)于0.0026mol/L添加量和無添加組，0.0026mol/L添加量與B液無添加組相比，保存時間和生存指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）。而2種稀釋液中是否添加N-乙酰半胱氨酸及添加量的多少對精子畸形率影響均不大（P＞0.05）。

雞精液；稀釋液；低溫保存；生存時間；畸形率

隨著現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，雞人工授精技術得到廣泛利用。而雞精液的稀釋與保存是人工授精技術發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，它的發(fā)展與突破能促進人工授精技術發(fā)揮更好的作用。精液只有經(jīng)稀釋處理后，才能進行有效的保存和運輸，有利于優(yōu)秀種公雞的資源共享［1］。低溫保存精液可以延長精子在體外的存活時間，維持其受精能力，有利于長途運輸，擴大精液的使用范圍。而精液保存時間長短與其自身氧化代謝速率密切相關，添加抗氧化劑可以減緩精子氧化代謝速度。N-乙酰半胱氨酸 （N-acetylcysteine，NAC）因其具有抗氧化功能，已被應用于家畜精液保存之中，但未見對雞精液保存效果的研究。該試驗研究在A、B 2種雞精液稀釋液基礎液中添加不同濃度N-乙酰半胱氨酸對40周齡安卡紅種公雞精液的低溫保存效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取15只40周齡的健康安卡紅種公雞，體重3.25 kg/只左右，供采精用。供試驗雞的飼料配方見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 稀釋液的配方與配制：根據(jù)基礎液配方（見表2）準確稱量所需藥品，加入蒸餾水溶解、過濾，并定容至100mL，然后封裝于100mL的瓶中，高溫（水浴 85～90 ℃）消毒滅菌（30min），室溫冷卻后蠟封，按該方法2種基礎液各配制200mL，置陰涼處保存?zhèn)溆?。用酸度計和滲透壓儀分別測定出不同稀釋液的pH值和滲透壓。

1.2.2 精液采集：于每天16：00左右采用背腹按摩法開始采集精液。檢查不同雞的采精量、精子活力及污染狀況，篩選出精液色澤良好、密度適中、無糞便、血液、尿酸鹽等污染的精液，過濾分裝好后進行精液品質(zhì)的檢查。

表1 基礎日糧飼料組成及營養(yǎng)水平

表2 2種精液稀釋液基礎液配方

1.2.3 精液稀釋

①A液與B液各分為3組，并分別記作A0、A1、A2 與 B0、B1、B2，每組 40mL。其中 A0、B0 作對照不加抗氧化劑，A1、B1添加0.0026mol/L的N-乙酰半胱氨酸,A2、B2添加0.0130mol/L的N-乙酰半胱氨酸，溶解完全后備用。

②將鮮精液和稀釋液按1∶4的稀釋比例混合稀釋。注意稀釋時將稀釋液沿器皿壁慢慢加入原精液，并輕輕搖動，使之混合均勻。

③稀釋完畢后，制片，并置于顯微鏡下進行精子活率檢查。如果稀釋后活率高于60%，進行封裝保存。

1.2.4 稀釋精液低溫保存與觀察：將稀釋液置冰箱中在4℃低溫環(huán)境中保存。每隔一定時間觀察稀釋液精子的活率，每天2次。按《動物繁殖學》［2］介紹的方法進行，即在載玻片上滴1滴原精液，然后加上蓋玻片（不要有氣泡，蓋玻片不游動），在400倍顯微鏡下觀察。精子活力評定一般用 “十級制”，100%者為 1.0級，90%為 0.9級，80%為 0.8級，以此類推，無精子直線前進者為0。記錄相關數(shù)據(jù)（時間間隔、精子活率、溫度等），并計算生存時間和生存指數(shù)（指精子存活時間及其活率變化的一項綜合指標，是反映精子活率下降速度的標志）。二者計算公式如下：存活時間（h）=觀察開始至精子活率為零時的累計時間和；生存指數(shù)=每前后相鄰2次檢查精子活率的平均數(shù)與間隔時間乘積的總和。

1.2.5 精子畸形率的觀察：是通過用龍膽紫染液染色后的精液抹片，在顯微鏡1000倍油鏡下觀察300個精子中畸形精子所占的比例。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 生存指數(shù)和生存時間 表3顯示，生存時間指標：B2低溫保存條件下精子的存活時間為（642.00±6.00）h，極顯著（P＜0.01）高于 B0、B1、A1、A2、A0 存活時間。 B0、B1、A1、A2 生存時間極顯著（P＜0.01）高于 A0，B0、B1 極顯著（P＜0.01）高于 A1、A2，但 B0、B1 相互之間無差異（P＞0.05），A1、A2 相互之間無差異（P＞0.05）。生存指數(shù)指標：B2的生存指數(shù)極顯著（P＜0.01）高于 A0、A1、A2、B0、B1，A1、A2、B0、B1 生存指數(shù)極顯著 （P＜0.01）高于 A0，但A1、A2、B0、B1 相互之間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 0～4℃下各處理組精子存活時間和生存指數(shù)

表4 各組精子不同保存時間活率及各組有效存活時間 h

2.2 精子有效存活時間 通常精子活率≥0.6的存活時間為有效存活時間。各組有效存活時間見表4。

從表4可以看出精子的活率隨時間的延長都呈下降趨勢。但A0、A1、A2有效存活時間為44.08 h，極顯著（P＜0.01）長于 B0、B1、B2 的 7 h。

2.3 畸形率 表5顯示，在低溫保存條件下，由B組稀釋液作基礎液配制的B0、B1、B2前期和中期畸形率極顯著（P＜0.01）高于同階段由A組稀釋液作基礎液配制的A0、A1、A2，精子全部死亡后B組稀釋液畸形率顯著（P＜0.05）高于A組稀釋液，但同一階段各組組內(nèi)無差異 （P＞0.05），即不同濃度的N-乙酰半胱氨酸對雞精子畸形率無影響。

表5 前中后三期各組精子畸形率測定結(jié)果 %

3 討論

3.1 稀釋液對雞精液保存效果的影響 影響雞精液體外保存效果的因素很多，如稀釋液的滲透壓、pH值、組成成分、緩沖物質(zhì)等。近年來的研究結(jié)果表明，滲透壓為 360～440 mOsm、pH 值為 6.8～7.1 較有利于體外低溫保存雞精子時精子的存活和保存后的受精力［3］。通過表3可以看到A、B 2種基礎液的pH為分別為6.80、7.00，都較為適宜，而滲透壓A基礎液為338 mOsm，較B基礎液296 mOsm更接近最適生存范圍，應當是A保存效果比B稀釋液要好，這與有效存活時間和畸形率結(jié)果相符合，但與生存時間和生存指數(shù)結(jié)果相反，這種結(jié)果可能與B稀釋液緩沖能力比A強有關。張兆旺［4］得出滲透壓越低，精子頭部彎曲且膨脹的百分數(shù)越高，存在極顯著的負相關關系；滲透壓越高，精子頭部單純彎曲的百分數(shù)越高，存在極顯著的正相關關系。與該試驗結(jié)果是相接近，但該試驗中影響精子畸形率的因素顯然不是單一的，很可能是眾多的因素造成的。

3.2 N-乙酰半胱氨酸的作用 N-乙酰半胱氨酸為谷胱甘肽的前體，是一種含有巰基的抗氧化劑，具有干擾自由基的生成、清除已生成的自由基、調(diào)節(jié)細胞的代謝活性、預防DNA的損傷、調(diào)節(jié)基因的表達和信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)、抗細胞凋亡、抗血管生成、抑制惡性腫瘤發(fā)展、抑制新生物的生成和轉(zhuǎn)移等作用［5］。據(jù)報道，N-乙酰半胱氨酸分子中的巰基與體內(nèi)活性氧自由基（例如H2O2、OH-、次氯酸等）有很強的結(jié)合能力［6-8］。N-乙酰半胱氨酸與 H2O2、OH-、次氯酸等的結(jié)合可以明顯降低細胞中活性氧自由基濃度，以保護細胞內(nèi)生物大分子免受活性氧（ROS）引起的氧化性損傷［9-10］。 精子呼吸代謝能產(chǎn)生ROS，所攜帶的氧自由基氧化性很強，能氧化精子質(zhì)膜的不飽和脂肪酸，干擾精子的代謝，造成過氧化損傷，這是受精能力下降的重要原因［11］。通過向稀釋液中添加帶巰基物質(zhì)可抵抗這種氧化壓力，對保護精子質(zhì)膜及抑制精子獲能等有重要作用［12］，從而降低精子氧化代謝速度。這與該試驗結(jié)果相近，即添加N-乙酰半胱氨酸的A1、A2生存時間和生存指數(shù)極顯著好于A0，B2生存時間和生存指數(shù)極顯著好于B0。雖然有很多試驗已經(jīng)證明N-乙酰半胱氨酸可以有效地保護精子質(zhì)膜完整性，降低精子畸形率，但在該試驗中，可以看出，是否添加N-乙酰半胱氨酸對精子畸形率似乎并沒有多大的影響，但稀釋液基礎液不同對畸形率有極顯著影響，這可能是稀釋液其他成分與抗氧化劑綜合作用的結(jié)果。

該試驗中通過對雞精液保存過程中精子的生存指數(shù)及有效存活時間測定得出，在用A稀釋液時，0.0026mol/L和0.0130mol/L添加量效果差異不顯著（P＞0.05），但均極顯著（P＜0.01）高于空白對照組。在用B作為稀釋液時，0.0130mol/L添加量效果極顯著（P＜0.01）優(yōu)于0.0026mol/L添加量和空白對照，0.0026mol/L添加量效果與空白對照組差異不顯著（P＞0.05），造成A和B 2種稀釋液保存效果有差異的原因可能是稀釋液配方組成的不同。

綜上可知，在該試驗中，影響精子生存時間、生存指數(shù)指標和有效存活時間的因素不是某一個因素造成的。生存時間和生存指數(shù)指標B稀釋液比A稀釋液好的原因可能是由于B中某些成 分和N-乙酰半胱氨酸共同作用，稀釋液緩沖能力和對精子的抗氧化保護能力更強，才表現(xiàn)出對雞精液的體外保存效果；而有效存活時間A優(yōu)于B，可能是因為A稀釋液的滲透壓、pH值等指標更接近雞精液最適生存范圍，但具體機制需要進一步分析。

4 結(jié)論

在稀釋液中添加N-乙酰半胱氨酸可以極顯著延長雞精液低溫保存時間，且效果因精液稀釋液配方不同而異，0.0130mol/L添加量較0.0026mol/L添加量保存效果好。是否添加N-乙酰半胱氨酸對雞精子畸形率沒有顯著影響。

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Effect of Addition of N-acetyl-cysteine in the Extender on Cryo-preservation Quality of Chicken Semen

QIU Zi-gui1，ZHAO Wan-le2，CHEN Er-ping2，LI Yan-ling2，ZHU Song-bo2
（1.Bureau of Animal Husbandry of Xin County of Henan Province，Xinyang 465000，China；2.Zhengzhou Institute of Agricultural and Forestry Sciences，Zhengzhou 450005，China）

This study was carried out to evaluate the effect of supplementing different concentrations of N-acetyl-cysteine in the extender on cryo-preservation quality of chicken semen.The fresh semen samples from Anka breeder chickens were collected and diluted with two separate extenders （A and B）each adding different concentrations （0.0130 and 0.0026mol/L）of N-acetylcysteine.The diluted semen samples were subsequently cryo-preserved and the preservation time,survival index and deformity rate were determined.The results revealed that in the A extender,there were no significant differences in preservation time and survival index between the 0.0130mol/L of N-acetyl-cysteine treatment samples and 0.0026mol/L of N-acetyl-cysteine treatment samples （P＞0.05）,but preservation time and survival index of the two N-acetyl-cysteine treatment samples were significantly higher than those of control （P＜0.01）;in the B extender,the preservation time and survival index of the 0.0130mol/L of N-acetyl-cysteine treatment samples were significantly higher than those of 0.0026mol/L of N-acetyl-cysteine treatment samples and control（P＜0.01）,but no significant differences in preservation time and survival index between the 0.0026mol/L of N-acetyl-cysteine treatment samples and control were observed （P＞0.05）.The addition and adding levels of N-acetyl-cysteine in the extenders had no obvious effect on the sperm deformity rate of Anka breeder chickens （P＞0.05）.

chicken semen；extender；cryo-preservation；survival time；deformity rate

S831.2

A文章順序編號：1672-5190（2016）08-0027-03

2016-07-28

邱自貴（1975—），男，初級畜牧師，主要從事動物檢疫工作。

趙萬樂（1987—），男，研究實習員，碩士，主要研究方向為動物繁育技術。

（責任編輯：錢英紅）