王 云，喬宗駿，王國科 ，梁雄燕

（1.長江大學，湖北 荊州 404025；2.重慶市忠縣畜牧獸醫(yī)服務中心馬灌鎮(zhèn)站，重慶 忠縣 404317）

散養(yǎng)淮南王土雞J亞群禽白血病的診斷

王 云1，喬宗駿2，王國科1，梁雄燕1

（1.長江大學，湖北 荊州 404025；2.重慶市忠縣畜牧獸醫(yī)服務中心馬灌鎮(zhèn)站，重慶 忠縣 404317）

對湖北省某農(nóng)戶散養(yǎng)的12周齡淮南王土雞病雞進行剖檢，發(fā)現(xiàn)病雞肝臟有白色腫瘤；心肌增厚，有疑似腫瘤贅生物；脾臟萎縮，切面呈暗色。用J亞群禽白血病病毒（ALV-J）特異性引物進行PCR檢測，擴增出了約545 bp的條帶，病雞組織內(nèi)含有ALV-J病毒核酸序列，表明該病例為ALV-J感染。

淮南王土雞；J亞群禽白血病；PCR檢測；診斷

J亞群禽白血病是由禽白血病病毒第10個亞群J亞群禽白血病病毒 （ALV-J）引起的腫瘤性疾病，廣泛存在于世界各地雞群。該病毒是1989年由英國開普敦家禽研究所的Payne首先于肉種雞中發(fā)現(xiàn)的，早期的病例報道主要是針對肉雞［1］。我國1999年首先在內(nèi)蒙古自治區(qū)發(fā)現(xiàn)肉雞J亞群禽白血病，2002年和2005年分別首次報道海蘭褐蛋雞群和中國地方雞種J亞群白血?。?-7］。近年來，J亞群禽白血病在我國不斷蔓延，呈現(xiàn)出跨區(qū)域傳播趨勢及宿主擴大化現(xiàn)象，首先由肉雞蔓延到蛋雞，進而波及我國地方性雞種，這不僅對我國養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的危害，而且也給我國地方雞群種質(zhì)資源保護提出了更嚴峻的挑戰(zhàn)［8-9］。

2015年10月湖北省某農(nóng)戶散養(yǎng)的淮南王土雞，雞群整體消瘦，明顯達不到預期體重標準，12周齡時出現(xiàn)零星死亡。剖檢病雞可見，肝臟有白色腫瘤；心肌增厚，有疑似腫瘤贅生物；脾臟萎縮，切面呈暗色。通過J亞群禽白血病病毒特異性PCR檢測確診為ALV-J感染。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理湖北省某農(nóng)戶散養(yǎng)的淮南王土雞病雞。剖檢病雞取具有典型病變的組織，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑rTaq DNA聚合酶、dNTP Mixture試劑等PCR試劑為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。DNA提取相關(guān)試劑，由筆者所在實驗室配制。ALV-J 特異性引物 H5/H7［10］分別位于 pol基因和env基因上，目標片段545 bp，由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成。

H5：5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3′

H7：5′-CGAACCAAAGGTAACACACG-3′

1.3 試驗方法

1.3.1 臨床觀察與剖檢：觀察和記錄雞群臨床癥狀，并取具有典型臨床癥狀的病雞進行剖檢，觀察組織器官病變情況，取具有典型病變的組織，用于提取DNA進行PCR檢測。

1.3.2 ALV-J特異性PCR：模板DNA制備參照文獻［11］進行。 PCR 采用 25 μL 反應體系，即 10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L 的 Mg2＋1.5 μL， 10 pmol/μL的上、下游引物各 1 μL， 模板 DNA 1 μL，2.5 mmol/L 的 dNTP 1 μL，5 U/μL 的 Taq 酶 0.25 μL， 去離子水16.75 μL。循環(huán)條件為預變性94℃3 min，94℃30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s；30 個循環(huán)；72 ℃終末延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

圖1 病雞的臨床癥狀及病理變化

圖2 ALV-J特異性PCR檢測

2.1 臨床癥狀和剖檢病變臨床觀察發(fā)現(xiàn)，病雞體形消瘦，雞冠蒼白，部分雞眼瞼粘連（見圖1 A）。剖檢病雞可見，肝臟腫大，呈暗紅色，肝表面和切面可見顆粒狀白色腫瘤結(jié)節(jié)（見圖1 B）；心臟一側(cè)明顯腫大，切開心肌明顯增厚（見圖1 C）。

2.2 ALV-J特異性PCR結(jié)果以病雞組織DNA為模板，用ALV-J異性引物H5/H7進行PCR，結(jié)果從2只雞的DNA中均擴增出了大小約為545 bp的條帶，與預期片段大小相符（見圖2），表明這些雞體內(nèi)均含有ALV-J病毒核酸序列。

3 討論

J亞群禽白血病最早由英國開普敦家禽研究所的Payne于1989年在肉種雞中發(fā)現(xiàn)，該病是主要引起肉雞和肉種雞比傳統(tǒng)的禽淋巴細胞白血病發(fā)病率和死亡率更高的髓細胞瘤性白血?。?］。我國在1999年首次發(fā)現(xiàn)J亞群肉種雞禽白血病病例，隨后全國各地20多個省市相繼報道肉種雞雞群發(fā)生ALV-J感染［2］。2002年徐鑌蕊等首次報道我國海蘭褐蛋雞J亞群禽白血病病例，隨后其他學者相繼在山東、湖北、廣東蛋雞中發(fā)現(xiàn)血管瘤型ALV-J病例［4-8］。 2005 年以來，先后在山東、廣西、江西等地的地方品種雞群中發(fā)現(xiàn)ALV-J感染病例［5-7］。這表明近年來J亞群禽白血病在我國不僅有區(qū)域蔓延趨勢，更有宿主擴大化的趨勢，不僅嚴重威脅了養(yǎng)禽業(yè)的生產(chǎn)，同時也對保護我國地方禽種資源提出了更嚴峻的挑戰(zhàn)。

ALV-J主要侵害機體的骨髓造血細胞，引起骨髓細胞瘤病變，對機體免疫系統(tǒng)損害較大，即便是近年出現(xiàn)的蛋雞感染血管瘤性J亞群禽白血病也往往伴有髓細胞瘤發(fā)生。ALV-J感染雞群血清學情況比較復雜，可出現(xiàn)無病毒血癥無抗體（V-，A-）、無病毒血癥有抗體 （V-，A＋）、有病毒血癥有抗體（V＋，A＋）、有病毒血癥無抗體（V＋，A-），4 種血清學類型［12］，因此抗體檢測往往很難準確判斷雞群的帶毒和感染情況，確定雞群是否帶毒必須通過IFA或PCR檢測方法進行病原檢測。該研究在剖檢的基礎(chǔ)上進一步通過ALV-J特異性PCR，確診了散養(yǎng)的淮南王土雞為ALV-J感染，表明湖北的部分淮南王土雞雞群已存在ALV-J感染，應引起土雞養(yǎng)殖者的重視，在引進雞苗時需要提高警惕，并采取相應措施，確保引進健康雞苗，保證雞群健康，以預防ALV-J的感染，從而減少經(jīng)濟損失。

［1］PAYNE L N，BROWN S R，BUMSTEAD N，et al．A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens［J］.Gen Virol，1991，72（pt4）：801-807.

［2］趙振華，顧玉芳，王風龍，等．禽骨髓細胞瘤病的病理學初報［J］.動物醫(yī)學研究進展，1999，20（3）：85-86．

［3］杜巖，崔治中，秦愛建．從市場商品肉雞中檢測出J亞群白血病病毒［J］.中國家禽學報，1999（1）：1-4．

［4］徐鑌蕊，董衛(wèi)星，何召慶，等．間接熒光抗體法快速診斷海蘭褐蛋雞J亞群禽白血病的研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，2002（9）：7-9．

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［6］石夢霞，王培坤，韋平，等．廣西地方品種雞臨床血管瘤型禽白血病的診斷［J］.中國家禽，2015，37（2）：68-70．

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［9］李拓凡，多婷，梁雄燕，等．J亞群禽白血病病毒env基因主要功能區(qū)和EGFP基因在SSff9細胞中的融合表達［J］.中國家禽，2015，37（11）：23-26．

［10］SMITH L M，BROWN S R，HOWES K，etal．Developmentand application ofpolymerase chain reaction（PCR）tests for the detection of subgroup J avian leukosis virus［J］.Virus Research，1998，54（1）：87-98.

［11］梁雄燕，楊玉瑩，顧玉芳，等．湖北部分肉種雞群J亞群禽白血病血清學調(diào)查及PCR檢測［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2009，48（11）：2636-2638．

［12］趙振華，楊玉瑩，成子強．禽白血?。跰］．北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006：52-80．

Diagnosis of Subgroup J Avian Leukosis of Scatter-feed Huainanwang Native Chicken

WANG Yun1，QIAO Zong-jun2，WANG Guo-ke1，LIANG Xiong-yan1
（1.Yangtze University，Jingzhou 404025，China；2.Animal Husbandry and Veterinary Medicine Service Center of Maguan Township in Zhong County of Chongqing，Zhong County 404317，China）

The diseased 12-week-old scatter-feed Huainanwang native chickens in a farm were anatomized.The white tumor was found in liver of the diseased chicken;The myocardium was found thickened and suspected tumor vegetation was found;The splenatrophy was observed and the color of the section was dark.The suspected case was molecularly diagnosed by PCR assay using specific primers of subgroup J avian leukosis virus.A specific DNA band with the size of 545 bp was obtained,indicating that the tissues of the diseased chicken were positive for subgroup J avian leukosis virus.In a conclusion,the suspected case was pathologically and molecularly diagnosed as infection of subgroup J avian leukosis virus.

Huainanwang native chicken；subgroup J avian leukosis；PCR assay；diagnosis

S858.31

A文章順序編號：1672-5190（2016）01-0028-02

2016－01－08

王云（1986—），男，碩士研究生，主要研究方向為臨床獸醫(yī)學。

梁雄燕（1982—），男，實驗師，博士，主要研究方向為動物病原分子生物學。

（責任編輯：錢英紅）