楊 超

（1.襄陽正大農(nóng)牧食品有限公司，湖北 襄陽 441104；2.長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

一起典型豬瘟病毒感染病例的診斷與分析

楊 超1，2

（1.襄陽正大農(nóng)牧食品有限公司，湖北 襄陽 441104；2.長江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

2015年6月湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的150頭的育肥豬，先后出現(xiàn)了弓背喜臥、糞便干結(jié)、全身皮膚出血等癥狀。病理剖檢可見全身皮膚及心、肝、脾、肺、腎、胃、膀胱等多臟器廣泛出血斑；采集病豬病變組織，提取RNA，用豬瘟病毒基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，病料呈豬瘟病毒核酸陽性，確診病豬為豬瘟病毒感染。

豬瘟；病理剖檢；RT-PCR檢測

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF），曾稱為豬霍亂（Hog Cholera，HC），在我國俗稱爛腸瘟。其是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（CSFV）引起的豬的一種以高熱稽留、全身廣泛性出血、敗血和母豬繁殖障礙為特征的熱性高度致死性傳染病，曾經(jīng)給我國及世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大損失［1-2］。隨著豬瘟疫苗的廣泛使用，豬瘟在世界范圍內(nèi)得到了一定程度的控制，有的國家已經(jīng)消滅了豬瘟［3-4］。近年我國雖無大規(guī)模豬瘟疫情暴發(fā)，但豬瘟仍不時(shí)在一些不注重防疫的中小型養(yǎng)殖場或農(nóng)戶飼養(yǎng)的豬群中散發(fā)或流行。2015年6月湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的150頭育肥豬，先后出現(xiàn)了弓背喜臥、被毛粗亂、糞便干結(jié)、眼角分泌物增多，隨后腹部及四肢內(nèi)側(cè)出現(xiàn)出血斑等癥狀，經(jīng)病理剖檢和RT-PCR診斷確診為豬瘟病毒感染。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料湖北某農(nóng)戶飼養(yǎng)的育肥豬病豬及剖檢采集的淋巴結(jié)和腎臟等病變組織。

分子生物學(xué)試劑：Trizol試劑、RT試劑盒為Invitrogen產(chǎn)品；ExTaq酶，dNTP等PCR相關(guān)試劑為寶生物（大連）有限公司產(chǎn)品，PCR引物參照已報(bào)道的豬瘟病毒Alfort株的基因序列E2保守區(qū)［5-7］設(shè)計(jì)1對(duì)引物HCV-F/HCV-R，擴(kuò)增目標(biāo)片段大小約為440 bp，引物由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司合成，序列分別為：

HCV-F：5′-AATGAGATTGGGTTACTCGG-3′；

HCV-R：5′-ACCACAGTGGAA AACGAA GAT-3′。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 臨床診斷與剖檢：觀察和記錄豬群病豬臨床癥狀，剖檢死亡豬只，檢查大體病變，并采取具有典型病變的組織，-70℃冷凍備用。

1.2.2 總RNA提?。嚎俁NA提取，按Trizol試劑盒操作說明進(jìn)行：取具有明顯病變的淋巴結(jié)或腎臟約 100 mg，置于 1.5 mL EP管中，加入 1 mL Trizol，放入磁力組織破碎勻漿器具中，勻漿破碎10 min，室溫靜置10 min，加入200 μL氯仿，用力顛倒離心管以混勻，靜置2 min，12 000 r/min離心10 min，取上層水相移至新EP管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，-20℃冰箱靜置 20 min，12 000 r/min，高速離心15 min，棄上清液。加入300 μL 75%酒精振蕩洗滌，12000r/min離心，棄上清液。室溫靜置10mim，加入RNase free水，-70℃冷凍保存。

1.2.3 RT-PCR反應(yīng)及電泳：RT反應(yīng)采用20 μL體系:5×Buffer 4 μL，10 mM 的 dNTP 1 μL，40 U/μL的 RNase inhibitor 1 μL，2 mM 的引物 PR 2 μL，5 U/μL 的 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μL， 待 檢 RNA 2.5 μL，RNase free H2O 7.5 μL加入PCR管中，置PCR儀中。 反應(yīng)條件為：42℃60min，95℃5min，4℃10min。

PCR 采用 25 μL 反應(yīng)體系：10×Ex Buffer（Mg2+）2.5 μL，2.5 mM dNTP 2 μL，HCV-F/HCV-R 各 1 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 1 μL，ExTaq 0.25 μL，H2O 17.25 μL。反應(yīng)條件為 94℃預(yù)變性 3 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 40 s，30 循環(huán)；72℃ 10 min；4℃ 10 min。 PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床癥狀臨床觀察豬群，豬只多被毛粗亂、弓背喜臥、眼角可見分泌物和淚斑，有的豬只糞便干結(jié)，有的稀薄，部分豬只腹部及四肢內(nèi)側(cè)皮膚可見出血斑等癥狀。

2.2 剖檢病變對(duì)死亡的豬只進(jìn)行剖檢，可見病豬心肌及心冠脂肪出血明顯；脾臟明顯梗死，邊緣呈鋸齒狀；腎臟表面可見針尖狀出血點(diǎn)，膀胱內(nèi)膜出血有大小不一的出血斑，胃內(nèi)膜出血并有潰瘍斑，見圖1。

圖1 病豬剖檢內(nèi)臟病變

2.3 RT-PCR結(jié)果提取病變淋巴結(jié)和腎臟組織總RNA，用參照已發(fā)表的豬瘟病毒序列E2保守區(qū)設(shè)計(jì)合成的豬瘟特異性引物，進(jìn)行豬瘟病毒核酸RT-PCR檢測，結(jié)果擴(kuò)增出了約440 bp的條帶，顯示病料呈豬瘟核酸陽性，見圖2。

圖2 RT-PCR檢測豬瘟病毒核酸

3 討論

典型的豬瘟往往是由強(qiáng)毒株引起的，開始時(shí)豬群內(nèi)可能僅有個(gè)別豬只食欲減少，神情呆滯，弓背垂尾，體溫升高，便秘［5］。隨著病程的發(fā)展，豬群內(nèi)有更多的豬發(fā)病，最初的病豬可能食欲廢絕，出現(xiàn)眼結(jié)膜炎，兩眼有多量黏液膿性分泌物，隨后下痢，有的發(fā)生嘔吐、驚厥，出現(xiàn)步態(tài)不穩(wěn)等衰弱癥狀，常在幾天內(nèi)死亡。

近年來，豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)已轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑堑湫拓i瘟為主的流行形式，出現(xiàn)了臨床癥狀顯著減輕，發(fā)病率較低，潛伏期及病程較長多呈散發(fā)的溫和型豬瘟，這些病例往往病變不明顯，常需依賴實(shí)驗(yàn)室診斷才能確診［6］。

該研究通過對(duì)豬群進(jìn)行臨床觀察，發(fā)現(xiàn)豬群癥狀符合豬瘟臨床癥狀。對(duì)死亡病豬進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，心臟、心冠脂肪、腎臟、膀胱及胃內(nèi)膜等內(nèi)臟器官廣泛性出血；脾臟梗死，邊緣呈鋸齒狀，呈現(xiàn)典型的豬瘟示病癥狀［7］。在臨床診斷、病理剖檢的基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行RT-PCR病原分子生物學(xué)檢測，擴(kuò)增出了豬瘟病毒核酸，確診該豬群為豬瘟感染。

對(duì)發(fā)病原因進(jìn)行調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)殖戶一直未對(duì)豬群進(jìn)行豬瘟疫苗免疫，可能是造成該次發(fā)病的主要原因。這種免不免疫都無所謂的僥幸心理也有可能正是造成當(dāng)前豬瘟在我國中小型養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶的豬群中仍時(shí)有發(fā)生的根本原因。因此，中小型養(yǎng)殖戶一定要提高防疫意識(shí)，采取積極有效的免疫措施，進(jìn)行科學(xué)養(yǎng)殖，方能降低風(fēng)險(xiǎn)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。

［1］吳憶春．某豬場豬偽狂犬病病毒與豬瘟病毒混合感染的診斷［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35（6）：171-174.

［2］高順．淺談豬瘟病毒［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2015（10）：89．

［3］王在時(shí)．豬瘟防治研究的回顧和展望［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：64-71．

［4］仇華吉，童光志，沈榮顯．豬瘟兔化弱毒疫苗——半個(gè)世紀(jì)的回顧［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（8）：1675-1685．

［5］邱楊，趙麗，盧小雨，等．五種動(dòng)物疫病診斷方法研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，33（12）：156-160．

［6］李文良，毛立，楊蕾蕾，等．豬瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的協(xié)同免疫保護(hù)作用 ［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31（2）：357-361．

［7］MEYERS G，RUMENAPF T，THIE H.Molecular cloning and nucleotide sequencing of hog cholera virus ［J］.Virology，1989，171：55-56．

S858.282.651

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）01-0100-02

2015－12－31

楊超（1977—），男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物疾病防控。

（責(zé)任編輯：趙景娣）