宋 晶，陳祎寧，劉曉玲，劉少貞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

牛蛙不同體部皮膚的組織學(xué)研究

宋 晶，陳祎寧，劉曉玲，劉少貞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

通過(guò)制作石蠟切片，并利用蘇木精—伊紅染色法進(jìn)行染色，對(duì)牛蛙不同部位的皮膚進(jìn)行組織學(xué)觀察；利用圖像處理軟件Image J 4.21測(cè)量皮膚厚度，運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)不同部位的皮膚厚度進(jìn)行單因素方差分析。鏡下觀察組織切片可見(jiàn)，牛蛙的皮膚分為表皮和真皮，表皮由外向內(nèi)可分為3層：角質(zhì)層、顆粒層和生發(fā)層，真皮由疏松層和致密層組成。疏松層主要由網(wǎng)狀結(jié)締組織構(gòu)成，也包括一些色素、顆粒腺和黏液腺。色素主要分布于表皮下的結(jié)締組織中，顆粒腺和黏液腺的間隙的結(jié)締組織中也有少量色素。鼓膜皮膚厚度顯著小于其他部位皮膚厚度（P<0.05），前肢、后肢、泄殖孔的皮膚厚度差異不顯著（P>0.05）。不同部位皮膚分布的色素細(xì)胞、顆粒腺、黏液腺數(shù)量也不同，內(nèi)側(cè)的黏液腺多于外部，而顆粒腺在表皮分布多，在深層分布少。

牛蛙；皮膚；組織學(xué)

牛蛙 （Rana catesbiana）屬兩棲綱、無(wú)尾目（Anura）、蛙科（Ranidae）、蛙屬（Rana），原產(chǎn)于中北美，是世界著名的大型食用蛙類。牛蛙肉肉質(zhì)鮮美，是一種高蛋白、低脂肪的營(yíng)養(yǎng)食品。自我國(guó)從古巴引進(jìn)牛蛙以來(lái)，牛蛙養(yǎng)殖行業(yè)便開(kāi)始迅猛發(fā)展。然而，近年來(lái)一味地追求高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致了牛蛙病害頻發(fā)，在造成經(jīng)濟(jì)損失之余，也影響著水產(chǎn)品的安全。牛蛙的皮膚對(duì)維持其自身生存和適應(yīng)棲息地多樣化的生態(tài)環(huán)境起著重要作用，牛蛙的皮膚能為其生存提供必需的呼吸作用。作為變溫動(dòng)物，牛蛙的體溫隨著環(huán)境溫度的變化而變化，當(dāng)外界溫度低于15℃時(shí)，牛蛙會(huì)匍匐在水底或水底軟泥中冬眠，其間依靠皮膚呼吸水中的氧氣和體內(nèi)積蓄的營(yíng)養(yǎng)維持基礎(chǔ)代謝［1］。牛蛙的皮膚還具有調(diào)節(jié)水分、抵御捕食、抗微生物入侵、排泄、生殖等功能。此外，利用牛蛙皮加工的皮革，具有光滑、耐磨、彈性好、透氣、防水、花紋美觀等特點(diǎn)，是制作皮鞋、皮包等的極好原料［2］，也可以煉制魚(yú)膠。

皮膚承擔(dān)了牛蛙的多項(xiàng)生理功能，與其生態(tài)適應(yīng)性密不可分，推斷蛙類不同部位的皮膚會(huì)因執(zhí)行生理功能的差異而顯示出不同的組織學(xué)特征。關(guān)于牛蛙皮膚顯微結(jié)構(gòu)［3］及組織化學(xué)［4］方面的研究已有報(bào)道，但皮膚的比較組織學(xué)研究仍鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)制作牛蛙皮膚組織的石蠟切片，并進(jìn)行蘇木精—伊紅（HE）染色，對(duì)牛蛙6個(gè)部位皮膚進(jìn)行組織學(xué)觀察，以期為豐富兩棲類動(dòng)物皮膚比較組織學(xué)研究?jī)?nèi)容提供資料，也為牛蛙疾病的防治和皮膚活性物質(zhì)的利用提供形態(tài)學(xué)依據(jù)［5］。

圖1 腹部皮膚的組織結(jié)構(gòu)（A：100 μm，B：10 μm）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用牛蛙購(gòu)自山西省太原市某水產(chǎn)市場(chǎng)，雌雄各 5 只，體重（240.0±15.3）g，健康狀況良好。

1.2 主要試劑的配制波恩氏液：苦味酸飽和水溶液（約1.22%，按略有不溶物確定）75 mL，加入冰乙酸5 mL和福爾馬林25 mL，混合即可。水溶性伊紅液：稱取水溶性伊紅0.25 g，溶于50 mL蒸餾水中，加1 mL濃鹽酸充分?jǐn)嚢瑁o置過(guò)夜后過(guò)濾，將濾渣同濾紙一起放入烘箱內(nèi)干燥，再用200 mL 95%乙醇將干燥好的濾渣溶解，加入冰乙酸2 mL攪拌均勻。愛(ài)氏蘇木精染液：將1 g蘇木精溶于少量95%乙醇中，加5 mL冰乙酸攪拌，然后加入50 mL甘油和剩余的95%乙醇（總量為50 mL，少量用于之前的蘇木精溶解）；將硫酸鋁鉀研碎溶于50 mL蒸餾水中，加熱使其充分溶解，然后將硫酸鋁鉀水溶液滴入蘇木精混合溶液中，不斷攪拌，然后用雙層紗布扎口，通風(fēng)處晾曬，當(dāng)顏色變?yōu)樽霞t色時(shí)即可使用。

1.3 組織切片的制備及觀察用解剖盤(pán)、剪刀、鑷子等將牛蛙各部位的皮膚取下，放入盛有波恩氏液的樣品管中固定，固定液體積大于組織塊體積10倍以上，然后經(jīng)過(guò)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、烘片、脫蠟、染色、封片等過(guò)程，最后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)處理利用圖像分析軟件Image J 4.21測(cè)量皮膚厚度，以微尺的讀數(shù)進(jìn)行較正。運(yùn)用Excel軟件對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，應(yīng)用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析功能對(duì)牛蛙不同部位的皮膚厚度進(jìn)行比較，差異顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蛙不同部位皮膚的組織學(xué)觀察從染色切片中可以明顯地觀察到：表皮由外向內(nèi)可分為角質(zhì)層、顆粒層和生發(fā)層。表皮之下就是真皮，真皮由疏松層和致密層組成，疏松層由網(wǎng)狀結(jié)締組織構(gòu)成，其內(nèi)分布有色素、顆粒腺和黏液腺。色素主要分布于靠近表皮的結(jié)締組織中，顆粒腺和黏液腺的間隙的結(jié)締組織中也有少量色素。牛蛙各部位的皮膚厚度不同，在所取組織中大腿外側(cè)的皮膚最厚，鼓膜的皮膚最薄。皮膚內(nèi)分布的色素細(xì)胞、顆粒腺和黏液腺等腺體的數(shù)量，在不同部位的皮膚中存在差異。牛蛙腹部的皮膚色素細(xì)胞很少，且特別小，疏松層的網(wǎng)狀結(jié)締組織中大量分布有顆粒腺和黏液腺（見(jiàn)圖 1A、1B）。

圖3 后肢皮膚的組織結(jié)構(gòu)（A：100 μm，B：10 μm）

圖4 前肢（A）和泄殖孔（B）皮膚的組織結(jié)構(gòu)（A：100 μm，B：100 μm）

牛蛙鼓膜的皮膚最薄，表皮層特別薄，疏松層中沒(méi)有顆粒腺和黏液腺，只有大量色素。真皮層由排列緊密且呈平行波浪形的膠原纖維構(gòu)成 （見(jiàn)圖2A）。頭部皮膚中分布有大量腺體，真皮層較厚，有色素分布（見(jiàn)圖2B）。

后肢的皮膚最厚，且真皮層較厚，疏松層中分布有大量的腺體，色素細(xì)胞少（見(jiàn)圖3A，3B）。

前肢皮膚的真皮層中分布有大量色素細(xì)胞，但顆粒腺和黏液腺不發(fā)達(dá)（見(jiàn)圖4A）。泄殖孔附近的皮膚較后腿略薄，但比其他部位的皮膚厚，真皮層中分布有許多顆粒腺和黏液腺，且腺體較大（見(jiàn)圖 4B）。

2.2 牛蛙不同部位皮膚厚度比較單因素方差分析結(jié)果顯示，鼓膜皮膚厚度顯著小于其他5個(gè)部位的皮膚厚度（P<0.05），而其他部位的皮膚厚度之間差異均不顯著（P>0.05）（見(jiàn)圖 5）。由此可知，牛蛙不同部位的皮膚厚度存在一定差異，其中后肢的皮膚最厚，鼓膜的皮膚最薄。

圖5 牛蛙不同部位的皮膚厚度比較

3 討論

牛蛙皮膚的真皮層中分布有大量顆粒腺和黏液腺，黏液腺的分布范圍比顆粒腺更廣。黏液腺分泌黏液潤(rùn)滑體表，保持體表濕潤(rùn)，且體表的黏液有利于逃避敵害。顆粒腺是一種毒腺，在泄殖孔附近較多，這些腺體是兩棲動(dòng)物防御天敵捕食的重要手段。有研究表明，牛蛙各部位都有腺體分布，不同部位的腺體密度不同。體腹的黏液腺多于體表，而顆粒腺則主要分布于體表，體腹極少。牛蛙前肢腹側(cè)分布的顆粒腺密度最大，頭部和軀干腹側(cè)密度較小。與黑斑蛙和虎紋蛙相比，牛蛙全身分布的顆粒腺密度較?。?］。 通過(guò)與其他兩棲動(dòng)物，如齒突蟾屬［6］，角蟾亞科中的異角蟾屬、短腿蟾屬和擬角蟾屬［7］，大凉疣螈［8］，極北鯢［9］，商城肥鯢［10］，爪鯢［11］等比較發(fā)現(xiàn)，牛蛙體腹的黏液腺多于體表，顆粒腺則分布于體表，體腹極少甚至沒(méi)有，無(wú)斑肥螈［12］的皮膚黏液腺少且沒(méi)有顆粒腺；與角蟾、商城肥鯢等水棲的兩棲類動(dòng)物相似，牛蛙的皮膚角質(zhì)程度較低，這一特點(diǎn)與它們的水棲生活相適應(yīng)。

與其他陸棲性強(qiáng)的蛙類相比，牛蛙皮膚較薄，且該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其不同部位的皮膚厚薄也存在差異。牛蛙后腿部的皮膚最厚，因跳躍是其主要的運(yùn)動(dòng)方式，而粗壯的后肢在完成跳躍運(yùn)動(dòng)中起決定性作用。在無(wú)尾類兩棲動(dòng)物中，東北林蛙頭背側(cè)皮膚最厚［13］。牛蛙的排卵和排泄等生理活動(dòng)使得泄殖孔的皮膚厚度僅次于后腿。牛蛙前肢比較纖小，主要用于繁殖期抱對(duì)，其皮膚厚度略薄于后肢。鼓膜的大小可以用來(lái)鑒別牛蛙的雌雄，雌蛙的鼓膜比眼徑小或與眼徑相當(dāng)，而雄蛙的鼓膜明顯大于眼徑。牛蛙的鼓膜司聽(tīng)覺(jué)，不需要大幅度地收縮和舒張，輕薄的質(zhì)地有利于其將感受到的振動(dòng)通過(guò)耳柱骨傳導(dǎo)至中樞神經(jīng)，因此鼓膜的皮膚最薄。牛蛙皮膚的組織結(jié)構(gòu)特征是長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果，與其生活習(xí)性相適應(yīng)。關(guān)于牛蛙皮膚及其分泌物的有效利用等方面的研究，還需進(jìn)行更深層的探索。

［1］曹克駒.名特水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003：251-252.

［2］唐學(xué)飛，王軍.淺談牛蛙皮的制革工藝［J］.中國(guó)皮革，2007，36（1）：1-4.

［3］李洋，金磊，李昌春，等.黑斑蛙、虎紋蛙和牛蛙皮膚的比較組織學(xué) ［J］.安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，32（5）：466-470.

［4］周作紅，彭沙沙，鐘圣偉，等.牛蛙皮膚顯微結(jié)構(gòu)與組織化學(xué)研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（3）：438-443.

［5］賴仞，趙宇，劉衡，等.兩棲類動(dòng)物皮膚活性物質(zhì)的利用兼論中國(guó)兩棲類資源開(kāi)發(fā)的策略［J］.動(dòng)物學(xué)研究，2002，23（1）：65-70.

［6］曹燕，謝峰，江建平.齒突蟾屬四個(gè)物種皮膚的組織學(xué)觀察［J］.四川動(dòng)物，2011，30（2）：214-219.

［7］雷飛宙，江建平，李成，等.角蟾亞科3物種皮膚的組織學(xué)觀察［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2012，47（3）：20-27.

［8］王寧寧，劉紹龍，曾麟.大涼疣螈皮膚的組織學(xué)觀察［J］.四川動(dòng)物，2011，30（1）：66-68.

［9］田川，李淑蘭，賈麗麗.極北鯢皮膚的組織學(xué)觀察［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（35）：92-95.

［10］吳淑輝，呂九全.商城肥鯢皮膚的組織學(xué)觀察［J］.河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，1994，22（3）：109-112.

［11］陸宇燕，王健，劉新海，等.爪鯢皮膚的顯微結(jié)構(gòu)和呼吸作用（圖版Ⅵ）［J］.四川動(dòng)物，2004，23（3）：178-182.

［12］徐劍.無(wú)斑肥螈皮膚的組織學(xué)觀察 ［J］.四川動(dòng)物，2007，26（2）：400-401.

［13］劉滿櫻，肖向紅，徐佳佳，等.東北林蛙皮膚及其腺體組織形態(tài)學(xué)觀察［J］.野生動(dòng)物，2007，28（4）：6-9.

Histological Study on Skin in Different Body Parts of Rana catesbeiana

SONG Jing，CHEN Yi-ning，LIU Xiao-ling，LIU Shao-zhen
（College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The skin in different body parts of Rana catesbeiana were collected to prepared paraffin sections by using HE staining method and were histologically observed.The thickness of skin in different body parts was determined by using image processing software of Image J 4.21 and was statistically analyzed by One-Way ANOVA analysis of variance using SPSS 17.0 statistical software.The skin of Rana catesbeiana consisted of epidermis and dermis.The epidermis could be divided into 3 layers from outside to inside,including cuticle,granular layer and germinal layer.The dermis was composed of loose layer and dense layer.The loose layer was primarily composed of reticular connective tissue and also included some pigments,granular glands and mucous glands.The pigments were mainly distributed in subcuticular connective tissue,and a small amount of pigments were distributed in the connective tissue in gaps between granular glands and mucous glands.The value of thickness of tympanic skin was significantly lower than that of skin in the other parts of Rana catesbeiana(P<0.05).No significant differences in thickness of skin in forelimb,hind limb and cloacal pore were observed(P>0.05).The distributing density of pigment cells,granular glands and mucous glands varied in skin in different body parts of Rana catesbeiana.The number of mucous glands distributing inside was more than that outside,and the granular glands were mainly distributed in epidermis but barely in deep layer.

Rana catesbeiana；skin；histology

Q954.6-33；S917.4

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）01-0024-04

2015－12－23

項(xiàng)目來(lái)源：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)人才引進(jìn)項(xiàng)目（2013YJ13）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2014016）。

宋晶（1983—），男，講師，博士，主要研究方向?yàn)槊貎?yōu)水產(chǎn)養(yǎng)殖。

劉少貞（1983—），女，講師，博士，主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)毒理學(xué)。

（責(zé)任編輯：趙俊利）