劉少貞，趙凌瑞，朱玉婷，曹謹(jǐn)玲，宋 晶

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

17α-甲基睪酮對麥穗魚雌魚肝臟組織學(xué)的影響

劉少貞，趙凌瑞，朱玉婷，曹謹(jǐn)玲，宋 晶

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

為評價(jià)外源性雄激素17α-甲基睪酮（MT）對水生動(dòng)物肝臟組織學(xué)結(jié)構(gòu)的影響，對麥穗魚雌魚進(jìn)行半靜水MT暴露試驗(yàn)，探討MT對麥穗魚雌魚的體重、肝臟重量、肝體指數(shù)以及肝臟組織學(xué)的影響。結(jié)果顯示，MT暴露前期和中期，麥穗魚體重變化不明顯，但暴露后期體重顯著降低（P<0.05）；暴露于不同濃度的MT時(shí)，麥穗魚雌魚的肝臟重量與對照組相比均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢；肝體指數(shù)的變化情況與肝臟重量一致，在暴露的中期和后期，麥穗魚的肝體指數(shù)顯著低于對照組（P<0.05）。不同濃度的MT暴露后，麥穗魚肝臟均受到不同程度的損傷，出現(xiàn)肝臟空泡化、肝細(xì)胞核固縮等現(xiàn)象，且空泡化和核固縮現(xiàn)象隨著MT濃度的升高和暴露時(shí)間的延長而加劇。

17α-甲基睪酮；麥穗魚；肝臟；肝體指數(shù)

近年來，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Endocrine Disrupting Chemicals，EDCs）受到社會(huì)各界的極大關(guān)注。1995年，美國環(huán)境與自然資源委員會(huì)將環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的研究列為最優(yōu)先的項(xiàng)目之一［1］。1998年，美國環(huán)保局（USEPA）公布了60余種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物［2］，而歐盟委員會(huì)在2000年公布了564種環(huán)境中的有毒物質(zhì)［3］。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，又稱為環(huán)境激素，主要是指可通過干擾生物體內(nèi)保持自身平衡和調(diào)節(jié)發(fā)育過程的天然激素的合成、貯存、分泌、體內(nèi)運(yùn)輸、結(jié)合、反應(yīng)和代謝等過程，從而對生物體的生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等的功能產(chǎn)生影響的外源性物質(zhì)，包括環(huán)境雌激素、環(huán)境性激素和環(huán)境甲狀腺激素。研究表明，內(nèi)分泌干擾物會(huì)對動(dòng)物產(chǎn)生影響［4-6］，引起動(dòng)物繁殖障礙、發(fā)育異常、性別轉(zhuǎn)換等［7-10］。人類成年后發(fā)生的肥胖、心臟病和生育障礙等也可能是在胚胎時(shí)期受內(nèi)分泌干擾物的影響所致［11］。低濃度的外源性雌激素EE2（25 ng/L）暴露28 d后會(huì)使稀有鮈鯽的體長顯著降低并使其體重顯著下降［12］。 100 mg/（kg·BW）的 4-硝基酚（PNP）會(huì)造成大鼠肝臟組織病理損傷，影響肝臟正常生理功能［13］。雙酚A（BPA）達(dá)到一定濃度時(shí)會(huì)改變大鼠靶器官的生長、發(fā)育和生理功能，進(jìn)而影響機(jī)體免疫功能［14］。 氯化鎘（CdCl2）暴露會(huì)影響斑馬魚肝型脂肪酸結(jié)合蛋白相關(guān)基因lfabp的表達(dá)，抑制肝細(xì)胞的成熟［15］。2,3,7,8-四氯代二苯并二噁英（TCDD）和 3，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯（PCB77）對斑馬魚進(jìn)行水域染毒5 d后便可引起斑馬魚肝臟丙二醛 （MDA）含量增加，同時(shí)使超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活力降低［16］。環(huán)境雌激素雙酚A對斑馬魚的肝臟也會(huì)產(chǎn)生有害作用［17］。大量研究表明，環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對生物體的影響很大。前人的研究多集中在環(huán)境激素對性腺的影響，而肝臟作為重要的解毒器官，環(huán)境激素對其組織結(jié)構(gòu)和功能的影響也不容忽視［18］。

17α-甲基睪酮（MT）是一種人工合成的雄激素類藥物［19-20］，作為激素的替代物在養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)中被普遍應(yīng)用。不同濃度的MT對魚類有不同的生物學(xué)作用［21］，低濃度的MT可作為飼料添加劑促進(jìn)魚類的生長發(fā)育，而高濃度的MT則會(huì)抑制魚類的生長發(fā)育，甚至導(dǎo)致魚類畸形和死亡［22］。MT屬于雄激素，在生產(chǎn)單一雄魚方面發(fā)揮重要作用［23-25］。隨著MT在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應(yīng)用，各地水體中的MT濃度越來越高，對水生生物的健康造成了危害，對人類的健康也造成了威脅。

麥穗魚（Pseudorasbora parva）屬鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鮈亞科（Gobioninae）［26］，是一種小型魚類，廉價(jià)易得，對環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，容易在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、繁殖［27-29］。 近年來，不少環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)都以麥穗魚作為實(shí)驗(yàn)材料［30］。筆者以麥穗魚雌魚為研究對象，探討半靜水MT暴露對其體重、肝臟重量、肝體指數(shù)以及肝臟組織學(xué)的影響，為從基因和蛋白水平揭示MT對水生生物肝臟功能的影響機(jī)制提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為麥穗魚作為指示生物在環(huán)境激素動(dòng)態(tài)監(jiān)測方面的應(yīng)用提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麥穗魚，采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)思想湖，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)馴化1個(gè)月后，挑選體形勻稱、體表無機(jī)械損傷、健康有活力的個(gè)體作為試驗(yàn)材料。該研究所用的麥穗魚體重為（0.96±0.21）g。

1.2 藥品與主要儀器17α-甲基睪酮，購自Sigma公司；無水乙醇、苦味酸、冰醋酸、二甲苯等試劑，購自天津市化學(xué)工業(yè)有限公司；蘇木精、伊紅，購自南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司；石蠟切片機(jī)（Leica RM 2245），顯微鏡成像系統(tǒng)（RCH1-NK50i）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)共設(shè)3個(gè)MT處理組，濃度分別為25、50、100 ng/L，以及 1 個(gè)溶劑對照組［0.001%（v/v）無水乙醇水溶液］。各試驗(yàn)組和對照組均設(shè)置2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)45尾麥穗魚，共360尾。采用半靜水暴露方法對麥穗魚進(jìn)行MT暴露試驗(yàn)［19］。水溫恒定在（22±2）℃，每天定時(shí)定量投餌，觀察實(shí)驗(yàn)魚的健康狀況，及時(shí)撈出死魚并做好記錄。

1.4 取樣及生物學(xué)指標(biāo)測定經(jīng)過7、14、21 d的MT暴露后，分別撈取處理組和對照組的麥穗魚進(jìn)行解剖取樣。每次每缸隨機(jī)撈取15尾魚，用吸水紙吸干其體表水分，然后用分析天平稱量魚的體重并記錄，然后迅速解剖，摘取其肝臟并稱重，用于計(jì)算肝體指數(shù)。隨后將其置于波恩氏液中固定，備用。肝體指數(shù)計(jì)算公式如下：

肝體指數(shù)（%）=肝臟重量（g）/體重（g）×100%

1.5 石蠟切片的制作麥穗魚的肝臟經(jīng)過波恩氏液固定48 h，用自來水沖洗12～24 h，以梯度濃度的乙醇脫水，用二甲苯透明；組織浸蠟（熔點(diǎn)為54～56℃的軟蠟和熔點(diǎn)為56～58℃的硬蠟），硬蠟包埋，包埋后過夜，切片，制成6 μm厚的連續(xù)蠟帶；用蘇木精—伊紅（H E）染色，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察麥穗魚肝臟組織切片并拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的單因素方差分析法（One-Way ANOVA）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物學(xué)指標(biāo)變化由表1可知，麥穗魚雌魚在不同濃度的MT中暴露7 d和14 d時(shí)，其體重未發(fā)生顯著變化；當(dāng)暴露于50 ng/L和100 ng/L的MT中21 d時(shí)，其體重顯著低于對照組（P<0.05）；暴露于不同濃度的MT 7、14、21 d時(shí)，麥穗魚雌魚的肝臟重量與對照組相比均顯現(xiàn)不同程度的下降，其中，100 ng/L的MT暴露7 d時(shí)，麥穗魚雌魚的肝臟重量顯著低于對照組（P<0.05）；肝體指數(shù)的變化情況與肝臟重量一致，當(dāng)暴露于50 ng/L和100 ng/L的MT 7 d和14 d時(shí)，麥穗魚雌魚的肝體指數(shù)顯著低于對照組（P<0.05）；當(dāng)暴露于50 ng/L的MT 21 d時(shí)，麥穗魚雌魚的肝體指數(shù)顯著低于對照組 （P<0.05）。

表1 MT不同暴露時(shí)間麥穗魚的相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)測定結(jié)果

圖1 不同濃度MT暴露7、14、21 d后麥穗魚雌魚的肝臟組織學(xué)觀察

2.2 肝臟組織學(xué)變化對照組麥穗魚的肝臟形態(tài)正常，肝細(xì)胞完整，細(xì)胞呈橢圓形或多邊形，肝細(xì)胞索清晰可見，細(xì)胞界限明顯，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核大而清晰可見，位于細(xì)胞中央，肝細(xì)胞排列緊密（圖 1 A1、B1、C1）。25 ng/L MT 處理組麥穗魚的肝臟受到外源性雄激素MT的影響，肝臟組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化：MT暴露7 d時(shí)，肝細(xì)胞依然圍繞中央靜脈緊密排列，但放射狀不明顯，部分肝細(xì)胞的橢圓外形出現(xiàn)變形，細(xì)胞核變小（圖1 A2）；延長MT暴露時(shí)間至14 d，肝細(xì)胞形狀變形明顯，細(xì)胞膜少量溶解，細(xì)胞界限不明顯，同時(shí)，細(xì)胞排列松散（圖1 B2）；MT暴露21 d時(shí)，肝細(xì)胞變形嚴(yán)重，排列松散而紊亂，細(xì)胞膜溶解增多，細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清晰，甚至有的肝細(xì)胞核溶解消失，有的出現(xiàn)核固縮（PN）現(xiàn)象（圖 1 C2）。50 ng/L MT 處理組的麥穗魚肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷較明顯：MT處理7 d時(shí)，肝細(xì)胞排列松散，部分細(xì)胞膜溶解，細(xì)胞界限模糊，少量肝細(xì)胞核變?。▓D1 A3）；MT暴露14 d時(shí)，肝細(xì)胞膜溶解加劇，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞質(zhì)溶解，細(xì)胞形狀扭曲，細(xì)胞核變小，有些肝細(xì)胞核已經(jīng)溶解（圖1 B3）；MT暴露21 d后，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞變形嚴(yán)重，細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞核溶解的細(xì)胞增多（圖1 C3）。100 ng/L MT處理組的麥穗魚肝臟組織結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重：MT暴露7 d后，肝細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞松散，排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，出現(xiàn)裂縫，細(xì)胞變形，部分細(xì)胞核溶解（圖1 A4）；MT處理14 d時(shí)，肝細(xì)胞扭曲變形，排列松散而紊亂，細(xì)胞核溶解加劇，出現(xiàn)空泡（圖1 B4）；MT處理21 d時(shí)，肝組織細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，裂縫增多，細(xì)胞嚴(yán)重變形，界限模糊，細(xì)胞核溶解嚴(yán)重，空泡增多（圖 1 C4）。

3 討論

該研究的實(shí)驗(yàn)對象為成熟的雌性麥穗魚，其在濃度為 25、50、100 ng/L 的 MT 暴露 7、14、21 d 后，肝臟形態(tài)受到嚴(yán)重影響，并且隨著MT濃度的增大，抑制作用增強(qiáng)，且MT暴露的時(shí)間越長，抑制作用也越明顯。與對照組相比，高濃度MT暴露21 d后麥穗魚的體重顯著降低，而MT短期暴露并沒有對其體重產(chǎn)生顯著抑制作用。在不同濃度的MT暴露一段時(shí)間后，麥穗魚的肝臟重量呈現(xiàn)出降低的趨勢，且肝體指數(shù)的變化也表現(xiàn)出相似的趨勢，表明外源性雄激素MT對麥穗魚的肝臟有一定的損傷作用。

肝臟是魚類最主要的解毒器官，當(dāng)魚類受到外界毒物浸染時(shí)，肝臟成為最主要的靶器官。許多研究表明，當(dāng)受到外界毒物浸染時(shí)，魚類的肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生不同程度的組織形態(tài)學(xué)變化。當(dāng)魚類的肝臟受到損傷時(shí)，肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生水腫、脂肪沉淀、肝血竇擴(kuò)張充血、空泡化、細(xì)胞核固縮偏移等現(xiàn)象［31］，肝臟損傷嚴(yán)重時(shí)，肝細(xì)胞甚至?xí)芙庀?、壞死，形成局部病灶?2］。 苯并（a）芘侵染黑鯛后，可造成其肝臟損傷，具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞水樣變性，肝竇狀隙擴(kuò)張，細(xì)胞核固縮偏向核膜，部分細(xì)胞質(zhì)溶解，細(xì)胞界限模糊［33］。該研究中，麥穗魚經(jīng)過MT暴露，肝臟也出現(xiàn)了肝細(xì)胞變形、細(xì)胞排列紊亂、界限模糊、細(xì)胞空泡化、細(xì)胞核固縮偏移現(xiàn)象，甚至還出現(xiàn)了細(xì)胞核溶解消失，這與前人的研究結(jié)果一致。該研究發(fā)現(xiàn)，麥穗魚肝臟損傷程度隨MT濃度的增加而逐漸嚴(yán)重，同時(shí)，隨著暴露時(shí)間的延長，損傷也逐漸加重，這也與苯并（a）芘暴露黑鯛肝臟試驗(yàn)結(jié)果一致，只是苯并（a）芘暴露下的黑鯛肝臟出現(xiàn)了一段時(shí)間的穩(wěn)定期［33］。外源性雌激素雙酚A對斑馬魚的肝臟也有毒害作用，并且隨著雙酚A濃度的增加，斑馬魚肝臟細(xì)胞腫大情況不斷加劇，出現(xiàn)核萎縮和空泡化現(xiàn)象［14］。 綜上所述，17α-甲基睪酮對麥穗魚雌魚肝臟有一定的損傷作用，并且隨著暴露濃度的增大和暴露時(shí)間的延長，損傷不斷加重。此外，該研究結(jié)果表明，MT暴露下的麥穗魚肝臟組織學(xué)變化比較明顯，且麥穗魚分布廣泛、廉價(jià)易得，因此，麥穗魚具有作為監(jiān)測環(huán)境MT的敏感生物標(biāo)志物的應(yīng)用潛力。

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《畜牧與飼料科學(xué)》入選《中國學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)》統(tǒng)計(jì)源期刊

2015年10月，中國學(xué)術(shù)期刊（光盤版）電子雜志社有限公司、中國科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)評價(jià)研究中心聯(lián)合發(fā)布了《中國學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)（自然科學(xué)與工程技術(shù)·2015版）》?！缎竽僚c飼料科學(xué)》入選統(tǒng)計(jì)源期刊，并獲頒《中國學(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)統(tǒng)計(jì)刊源證書》?！吨袊鴮W(xué)術(shù)期刊影響因子年報(bào)》依據(jù)科技期刊在同學(xué)科、同研究層次的總被引頻次、影響因子、下載頻次等多項(xiàng)指標(biāo)，每年按照“優(yōu)入劣汰”的原則對其收錄的科技期刊進(jìn)行綜合篩選、評定。該年報(bào)的學(xué)術(shù)影響力已被眾多學(xué)術(shù)單位和科研院所廣泛認(rèn)可，是我國重要的科技期刊學(xué)術(shù)水平評價(jià)體系之一。

Effect of 17α-Methyltestosterone Exposure on Liver Histology of Female Pesudorasbora parva

LIU Shao-zhen，ZHAO Ling-rui，ZHU Yu-ting，CAO Jin-ling，SONG Jing
（College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

In order to understand the effect of exogenous androgen 17α-methyltestosterone(MT)on liver histological structure of aquatic animals,the semi-static water test was conducted using female Pesudorasbora parva as material to evaluate the effect of MT exposure on their body weight,liver weight,hepatosomatic index (HSI)and liver histology.The results showed that in early and middle phase of MT exposure,no significant changes in body weight of female Pesudorasbora parva were observed,however,in the late phase of MT exposure,their body weight were significantly reduced(P<0.05).The liver weight of female Pesudorasbora parva which were subjected to exposure of different dosage MT were reduced in different degrees compared with that of CK.The change of HSI exhibited the similar trend with liver weight.In the middle and late phase of MT exposure,the HSI of female Pesudorasbora parva were significantly lower than that of CK (P<0.05).The histological injuries of liver after MT exposure were observed,including vacuolization and karyopyknosis of hepatocyte,and the injuries were gradually aggravated with the increase of MT dosage and extend of duration of MT exposure.

17α-methyltestosterone；Pesudorasbora parva；liver；hepatosomatic index

R994.6

A文章順序編號：1672-5190（2016）01-0001-05

2015－12－29

項(xiàng)目來源：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才博士科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目（2014YJ08）。

劉少貞（1983—），女，講師，博士，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)。

宋晶（1983—），男，講師，博士，主要研究方向?yàn)樗飳W(xué)。

（責(zé)任編輯：趙俊利）