何　雨,王成燕,劉　彤,楊嵐嵐,金春香*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 超聲科，吉林 長春130033;2.吉林省腫瘤醫(yī)院;3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院)

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胃動(dòng)素受體在狗胃腸道的表達(dá)及比較

何雨1,王成燕2,劉彤1,楊嵐嵐3,金春香1*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 超聲科，吉林 長春130033;2.吉林省腫瘤醫(yī)院;3.吉林大學(xué)第二醫(yī)院)

目的通過比較胃動(dòng)素受體在狗胃腸道各部位的表達(dá)情況,探索胃動(dòng)素在胃腸道各部位不同功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。方法分別取狗胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近段結(jié)腸、中段結(jié)腸和遠(yuǎn)段結(jié)腸,用免疫組化方法研究狗胃動(dòng)素受體在胃腸道的分布,用半定量RT-PCR檢測比較各部位胃動(dòng)素受體mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果除遠(yuǎn)段結(jié)腸外,在胃腸道其他部位的腸神經(jīng)系統(tǒng)中均可檢測到胃動(dòng)素受體表達(dá);但不同部位的胃動(dòng)素受體mRNA表達(dá)量有顯著性差異(P<0.01);胃動(dòng)素受體mRNA在十二指腸的表達(dá)量最高,其次是回腸,空腸,近段結(jié)腸,胃竇和中、遠(yuǎn)段結(jié)腸。結(jié)論胃動(dòng)素受體在狗胃腸道不同部位的表達(dá)量是不同的,狗胃動(dòng)素受體的最高表達(dá)部位在十二指腸。

胃動(dòng)素受體;狗胃腸道;表達(dá)

(ChinJLabDiagn,2016,20:1432)

胃動(dòng)素是調(diào)節(jié)消化間期胃腸運(yùn)動(dòng)的重要激素,它通過與其受體結(jié)合誘導(dǎo)胃腸移行性復(fù)合肌電運(yùn)動(dòng)(migrating motor complex,MMC) Ⅲ相的發(fā)生[1],從而促進(jìn)消化間期腸內(nèi)容物向前推進(jìn),完成胃腸道機(jī)械性和化學(xué)性排空,又被稱為饑餓激素。胃動(dòng)素受體(motilin receptor,MTLR)作為一種G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor,GPR),業(yè)已成為臨床治療胃腸運(yùn)動(dòng)障礙性疾病的藥物靶點(diǎn)[2],研究其在胃腸道的分布及功能對于治療此類疾病(比如腸梗阻、腸易激綜合征、功能性消化不良等)具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 然而,不同種屬間MTLR在胃腸道的分布是不同的,目前,在人類、樹鼩、狗、牛、鼠和兔體內(nèi)均有MTLR表達(dá)[3],但嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)卻只存在一種MTLR假基因,這與該種屬胃腸道在進(jìn)化過程中喪失嘔吐功能有關(guān)[3,4],因?yàn)槲竸?dòng)素的作用可引發(fā)哺乳動(dòng)物的嘔吐行為。 但是,兔卻是唯一不會(huì)嘔吐的哺乳動(dòng)物,它進(jìn)化過程中保留MTLR的原因是需要胃動(dòng)素來調(diào)節(jié)食糞這個(gè)特殊的消化行為[5]。因此,生存環(huán)境、飲食習(xí)慣等決定了MTLR在不同種屬的解剖分布及由此而衍生出的不同功能。而在同一種屬胃腸道不同部位MTLR的分布情況尚不十分清楚,本研究通過比較MTLR在狗胃腸道各部位的表達(dá)情況,探索胃動(dòng)素在同種屬內(nèi)胃腸道各部位不同功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),有助于提高臨床上以MTLR為靶點(diǎn)治療的針對性和可行性。

1　材料和方法

1.1材料

該研究經(jīng)過吉林大學(xué)第三醫(yī)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將6條狗(雌雄隨機(jī))禁食24小時(shí),氯胺酮麻醉,固定四肢,暴露腹部皮膚,備皮(15 cm),強(qiáng)力碘消毒,切開腹部皮膚,皮下脂肪,肌肉,腹膜后進(jìn)入腹腔,分別取狗的胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近端結(jié)腸(近回盲部)、中端結(jié)腸(近橫結(jié)腸)和遠(yuǎn)端結(jié)腸(近降結(jié)腸),用預(yù)冷的生理鹽水沖洗所取標(biāo)本至潔凈,然后均勻分成兩份,其中一份放入10%的中性福爾馬林固定用于免疫組織化學(xué)染色;另外一份將各部位標(biāo)本分裝于做好標(biāo)記的1.5 ml Eppendorf管中,先迅速置于液氮中速凍,之后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存用于提取組織總RNA。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色分析胃動(dòng)素受體表達(dá)將組織切塊,固定,石蠟包埋,切片(厚度為4 μm),烤片,常規(guī)二甲苯中脫蠟、水化、修復(fù),PBS沖洗;用正常羊血清封閉30分鐘,棄去,加入兔抗狗MTLR抗體(1∶200,由日本RaQualia,Taketoyo饋贈(zèng))4℃孵育過夜，PBS沖洗后,室溫下與生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體和抗生物素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶孵育30分鐘,DAB顯色(Sigma,美國),酒精梯度脫水,透明,封片。 以PBS代替一抗作為陰性對照,陽性反應(yīng)以出現(xiàn)棕黃色顆粒沉著為準(zhǔn)。

1.2.2RT-PCR檢測MTLR mRNA表達(dá)總RNA提取按Trizol試劑(Invitrogen Life Technologies,美國)說明書操作，按二步法(Takara,日本)合成cDNA,以cDNA為模板,MTLR引物序列為:5′-ACC ACC GCC TAC TTC TTC CT-3′和 5′-GCC TGT TTC CCT ACA CAC CT-3′[6],以GAPDH 作為內(nèi)參,其引物序列為:5′-CCA TCA CCA TCT TCC AGG AG-3′和5′-CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG-3′[6]。PCR反應(yīng)總體積為20 μl,反應(yīng)條件為94℃30 s,56℃30 s,72℃30 s,40個(gè)循環(huán),72℃10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(Invitrogen,美國),應(yīng)用Quantity one 4.6.2凝膠成像分析系統(tǒng)(美國)進(jìn)行分析、觀察,用內(nèi)參照(GAPDH)光密度值標(biāo)化MTLR mRNA的光密度值進(jìn)行半定量分析,得到MTLR mRNA表達(dá)的相對含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA),多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較采用最小顯著差法(LSD),P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MTLR在狗胃腸道的分布

在胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近段結(jié)腸、中段結(jié)腸環(huán)形肌和縱形肌之間的肌間神經(jīng)纖維和腸肌間神經(jīng)叢均發(fā)現(xiàn)MTLR的陽性表達(dá),遠(yuǎn)段結(jié)腸內(nèi)未發(fā)現(xiàn)MTLR的陽性表達(dá),整個(gè)胃腸道的平滑肌內(nèi)均未檢測到MTLR的陽性表達(dá)(圖1)。

A:胃竇;B:十二指腸;C:空腸;D:回腸;E:近段結(jié)腸;F:中段結(jié)腸.圖1　胃腸道各部位腸肌間神經(jīng)叢MTLR的分布(SP法,×400)

2.2MTLR mRNA在狗胃腸道各部位的表達(dá)及比較

MTLR mRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為549 bp。六條狗的胃竇、十二指腸、空腸、回腸、近段結(jié)腸、中段結(jié)腸均擴(kuò)增出目的基因片段,遠(yuǎn)段結(jié)腸均未擴(kuò)增出目的基因片段(圖2)。

各部位之間兩兩比較后顯示,MTLR mRNA表達(dá)強(qiáng)度由高到低的排序?yàn)?十二指腸→回腸→空腸→近段結(jié)腸→胃竇→中段結(jié)腸。其中,中段結(jié)腸的表達(dá)量最少,與其他部位相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),其余各部位的表達(dá)與其相鄰排序部位表達(dá)之間無顯著差異,但與其不相鄰排序部位表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1,圖3)。

表1　MTLR mRNA在胃腸道各部位的表達(dá)強(qiáng)度

1:胃竇;2:十二指腸;3:空腸;4:回腸;5:近端結(jié)腸;6:中端結(jié)腸;7:遠(yuǎn)端結(jié)腸

圖2MTLR mRNA在狗胃腸道的表達(dá)

aP<0.01 與十二指腸MTLR mRNA比較;bP<0.01 與回腸MTLR mRNA比較;cP<0.01 與空腸MTLR mRNA比較;dP<0.01 與近段結(jié)腸或胃竇MTLR mRNA比較

圖3胃腸道不同部位MTLR mRNA 表達(dá)的排序及比較

3　討論

關(guān)于MTLR在不同種屬的分布及表達(dá)已有報(bào)道,本研究則針對同一種屬胃腸道各部位胃動(dòng)素受體表達(dá)及分布的差異進(jìn)行探討,試圖更深入理解胃動(dòng)素對胃腸道運(yùn)動(dòng)的作用。研究發(fā)現(xiàn),在總體分布趨勢上,從胃腸道近端至遠(yuǎn)端MTLR表達(dá)呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢;在表達(dá)部位上,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6],MTLR只表達(dá)在狗胃腸道的腸神經(jīng)系統(tǒng)中,并不表達(dá)在平滑肌細(xì)胞中;在表達(dá)量上,十二指腸的表達(dá)量最高,以下依次為回腸、空腸、近段結(jié)腸、胃竇、中段及遠(yuǎn)段結(jié)腸。

本文以狗為研究對象,是因?yàn)槲竸?dòng)素的生理特點(diǎn)在狗和人類之間存在諸多相似性,在消化間期,胃MMC Ⅲ出現(xiàn)時(shí),血中內(nèi)源性胃動(dòng)素濃度達(dá)到峰值,這種吻合在狗和人體內(nèi)都得到證實(shí)[7];當(dāng)用中和抗體中和循環(huán)中的胃動(dòng)素抑制正常MMC Ⅲ運(yùn)動(dòng)后,以一定濃度靜脈輸注外源胃動(dòng)素,在狗和人體內(nèi)均可誘導(dǎo)出提前的MMC Ⅲ[7]。本研究顯示,狗胃動(dòng)素受體在胃腸道總體分布趨勢,也與人類相似,呈現(xiàn)由近端到遠(yuǎn)端逐漸降低的趨勢[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)素衍生物,如紅霉素,不僅對人的上消化道如回腸、上段結(jié)腸等運(yùn)動(dòng)障礙有作用[9,10]，而且也能刺激健康人胃和十二指腸MMCⅢ運(yùn)動(dòng)[11]，但是對遠(yuǎn)段結(jié)腸動(dòng)力問題卻沒有影響[12],這正與MTLR在下消化道的低表達(dá)相吻合。實(shí)際上,許多種屬胃動(dòng)素免疫陽性細(xì)胞(Mo cells)主要位于近端小腸,向肛門方向明顯減少,這也與MTLR在胃腸道近端到遠(yuǎn)端表達(dá)逐漸降低一致。

然而,雖然分布總體趨勢類似,但不同種屬間MTLR分布及高表達(dá)部位仍然存在差異[6,13]。在人和兔的腸神經(jīng)系統(tǒng)和平滑肌上均可檢測到MTLR表達(dá),而狗MTLR僅位于腸神經(jīng)系統(tǒng);人MTLR的最高表達(dá)部位在胃竇[8],兔在結(jié)腸[14],而本研究發(fā)現(xiàn)狗則以十二指腸表達(dá)最多。已知MTLR存在兩種亞型,肌肉型和神經(jīng)型,這兩個(gè)亞型的結(jié)合特性和藥理特征是不同的[14],通過對受體功能的研究顯示神經(jīng)受體較肌肉受體對紅霉素的刺激更敏感[8]。不僅如此,Sanger等指出胃動(dòng)素的作用優(yōu)先表現(xiàn)為促進(jìn)腸膽堿能神經(jīng)活動(dòng)而不是直接收縮平滑肌[15],因此MTLR的神經(jīng)型應(yīng)該是其最原始、最本能的表現(xiàn)形式,也是狗體內(nèi)的唯一形式,人MTLR的最高濃度主要就是在胃竇的神經(jīng)成分中測得的[8]。

關(guān)于MTLR的優(yōu)勢表達(dá)部位應(yīng)與胃動(dòng)素在該處的功能密切相關(guān)。胃動(dòng)素被認(rèn)為是調(diào)節(jié)胃腸MMC的重要的內(nèi)源性物質(zhì),MMC是在消化間期發(fā)生在胃和小腸的周期性的、反復(fù)的運(yùn)動(dòng)模式,進(jìn)食可使其終止。Ⅲ相是MMC中最主動(dòng)的、爆發(fā)性的收縮,起源于胃竇或十二指腸并逐漸向遠(yuǎn)端移行。人體內(nèi),MMC Ⅲ相收縮起源自胃竇[16],而狗的MMC Ⅲ相起源并無明確說明,但研究已發(fā)現(xiàn)十二指腸MMC Ⅲ相常常發(fā)生在胃MMC Ⅲ相之前[17]。已經(jīng)證實(shí),在胃MMC Ⅱ相和Ⅲ相時(shí),5-HT濃度增加發(fā)生在十二指腸內(nèi)[17],而不是胃等其他部位,由此提示胃動(dòng)素與5-HT之間的正反饋?zhàn)饔冒l(fā)生在十二指腸。當(dāng)十二指腸被切除后,胃MMC樣運(yùn)動(dòng)消失,大概1-4個(gè)月以后,又重新出現(xiàn),此時(shí)空腸好像變成了十二指腸發(fā)揮作用[18]。這些研究都表明十二指腸在胃腸MMC中的關(guān)鍵作用,也提示十二指腸是狗胃腸MMC的起源。本研究中得出的MTLR mRNA在十二指腸表達(dá)最多的結(jié)果無疑為十二指腸的重要功能提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和客觀證明.

本研究中,我們發(fā)現(xiàn)胃動(dòng)素受體在狗腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)差異表達(dá),但是我們并沒有確定表達(dá)胃動(dòng)素受體的細(xì)胞類型。因?yàn)槭改c的正反饋機(jī)制,Takahashi推測胃動(dòng)素受體位于十二指腸黏膜的EC細(xì)胞,并介導(dǎo)了胃MMC Ⅲ相[19]。然而,Xu等通過免疫熒光三標(biāo)法檢測到胃動(dòng)素受體位于兔間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal,ICC)膜上[20],并將胃動(dòng)素與ICC偶聯(lián)介導(dǎo)胃運(yùn)動(dòng)。無論MTLR是位于ICC上或EC上,都需要進(jìn)一步研究判斷是否存在種屬差異。目前,從十二指腸黏膜釋放的胃動(dòng)素與十二指腸EC細(xì)胞釋放的5-HT之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程還有待證明,但可以肯定的是十二指腸在啟動(dòng)狗胃腸MMC的過程中具有重要的地位[17],這也是本研究所發(fā)現(xiàn)的狗MTLR最高表達(dá)部位。

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Comparison and expression of motilin receptor throughout dog gastrointestinal tract

HEYu,WANGCheng-yan,LIUTong,etal.

(China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity，Changchun130033,China)

ObjectiveTo compare the expression of motilin receptor in different gastrointestinal regions and explore the structural basis of effect of motilin on various parts of dog gastrointestinal tract.MethodsAntrum,duodenum,jejunum,ileum,proximal colon,middle colon and distal colon were removed from the gastrointestinal tract of six dogs.The localization of motilin receptor was evaluated by immunohistochemistry.Semi-quantitative RT-PCR was performed to measure the expression levels of motilin receptor mRNA in different regions.ResultsMotilin receptor was expressed in the enteric nervous system throughout the gastrointestinal tract in dogs,except distal colon.The motilin receptor mRNA expressions among various regions were significantly different (P<0.01).Motilin receptor mRNA was highly expressed in duodenum,followed by ileum,jejunum,proximal colon,antrum,middle and distal colon.ConclusionThe expressions of motilin receptor in various parts of gastrointestinal tract are different.It is the duodenum that the significantly high expression of motilin receptor mRNA is observed.

motilin receptor;dog gastrointestinal tract;expression

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271235,81201094)；吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201115070)；吉林省科技廳項(xiàng)目(2012073,20130413005GH)

1007-4287(2016)09-1432-04

R574.4

A

2015-07-26)