趙言廷，郭曉慧，白　晶，朱德淳，王金國

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春130021)

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熒光原位雜交技術(shù)在尿路上皮癌輔助診斷中的應(yīng)用價值

趙言廷，郭曉慧，白晶，朱德淳*，王金國*

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林 長春130021)

尿路上皮癌是起源于尿路上皮的一種惡性腫瘤，包括腎盂尿路上皮癌、輸尿管尿路上皮癌及膀胱尿路上皮癌，其中以膀胱尿路上皮癌的發(fā)病率最高，輸尿管鏡下或膀胱鏡下取病理活檢是目前確診尿路上皮癌的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，輸尿管鏡或膀胱鏡為有創(chuàng)性檢查，患者耐受性差，且易出現(xiàn)血尿、排尿疼痛等并發(fā)癥。因此，尋找一種無創(chuàng)、有效的檢查方法，對于可疑尿路上皮癌患者無論是早期篩查、輔助診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測，還是減少有創(chuàng)性檢查的次數(shù)，都具有重要意義。目前尿脫落細(xì)胞學(xué)為尿路上皮癌的常規(guī)無創(chuàng)檢查方法，其特異度較高，但敏感度不盡如人意。隨著人們對尿路上皮癌遺傳學(xué)的不斷深入研究，目前已經(jīng)證實尿液中的脫落細(xì)胞3號、7號、17號及9號染色體p21位點異常與尿路上皮癌的發(fā)生密切相關(guān)[1]。現(xiàn)已有較多的文獻(xiàn)報道，應(yīng)用FISH技術(shù)檢測尿路上皮癌的特異性與尿脫落細(xì)胞學(xué)相當(dāng)，而敏感性明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)[2-5]。本項研究擬用FISH技術(shù)檢測可疑尿路上皮癌患者尿液中脫落細(xì)胞3號、7號、17號及9號染色體p21位點的畸變情況，并與尿脫落細(xì)胞學(xué)進(jìn)行比較，探討FISH技術(shù)檢測尿路上皮癌的臨床應(yīng)用價值。

1　資料和方法

1.1標(biāo)本采集

收集自2014年10月到2016年1月就診于吉林大學(xué)第一醫(yī)院疑似尿路上皮癌患者的尿液，共111例，其中有6例無病理證據(jù)(拒絕鏡檢及手術(shù))，故未納入本項研究，其余105例患者中，男78例，女27例，中位年齡65歲(30-85歲)，均行FISH及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查。留取患者的尿液標(biāo)本取得了患者或其家屬的知情同意，并簽署了知情同意書，同時經(jīng)過了本醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器

探針及前處理試劑均購置于美國Abbott公司生產(chǎn)的UroVysion膀胱癌檢測試劑盒(內(nèi)含膀胱癌檢測探針、DAPI、PBS、NP-40、20×SSC、胃蛋白酶干粉及其緩沖液等)、 封片膠、微型離心機、渦旋混勻器、水浴鍋(溫度準(zhǔn)確)、離心機(可容納50 ml離心管，15 ml離心管)、 ThermoBrite雜交儀、 OLYMPUS-BX51熒光顯微鏡(100瓦水銀燈，200小時以內(nèi))及相應(yīng)的濾光片(DAPI Single Filter，Green/Red Dual Filter，Aqua Single Filter，Yellow Single Filter)等。

1.3FISH檢測

將收集的尿液進(jìn)行多次離心、加固定液、滴片、烤片、胃蛋白酶消化、加探針、變性、雜交等處理后，在熒光顯微鏡下分析結(jié)果。

1.4FISH結(jié)果判定

整個玻片中至少應(yīng)有25個形態(tài)異常的細(xì)胞，否則需重新制片或重新留取尿液標(biāo)本，具有單一染色體多體(3,7,17中的一種)的異常細(xì)胞核不被評估為陽性。在形態(tài)異常的細(xì)胞中≥4個細(xì)胞可觀察到兩種以上的染色體多體信號(3,7 或 17)或≥12個細(xì)胞中都無法觀察到9p21位點信號(純合缺失)則視為FISH陽性，否則評估結(jié)果為陰性。

1.5尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查

同時留取患者的尿液送我院檢驗科行細(xì)胞學(xué)檢查，每個患者連查3天晨尿，至少有1次結(jié)果回報為找到癌細(xì)胞視為尿脫落細(xì)胞學(xué)陽性，找到可疑癌細(xì)胞及未找到癌細(xì)胞視為尿脫落細(xì)胞學(xué)陰性。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

FISH的敏感性和特異性與尿脫落細(xì)胞學(xué)的比較采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析,計數(shù)資料用χ2檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

實際研究的105例中經(jīng)病理證實為尿路上皮癌者80例，包括腎盂尿路上皮癌9例，輸尿管尿路上皮癌3例，膀胱尿路上皮癌68例，其中FISH檢測

陽性者62例，陰性者18例，尿脫落細(xì)胞陽性者19例，陰性者61例。其余25例為非尿路上皮癌，包括前列腺增生7例，泌尿系結(jié)石8例，泌尿系感染5例，內(nèi)翻性乳頭狀瘤2例，鱗癌1例，腺癌1例，移行上皮不典型增生1例，其中FISH檢測陽性者3例，陰性者22例，尿脫落細(xì)胞陽性者0例，陰性者25例。FISH檢測技術(shù)的敏感性為77.5%，特異性為88.0%。尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查的敏感性為23.8%，特異性為100.0%。FISH與尿脫落細(xì)胞學(xué)相比，兩者的特異性相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但敏感性明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1正常細(xì)胞

圖2異常細(xì)胞

在80例尿路上皮癌患者中，病理分期為肌層浸潤性尿路上皮癌48例，F(xiàn)ISH陽性者42例，陽性率為87.5%，陰性者6例，尿脫落細(xì)胞學(xué)陽性者18例，陽性率為37.5%，陰性者30例；非肌層浸潤性尿路上皮癌32例，F(xiàn)ISH陽性者20例，陽性率為62.5%，陰性者12例，尿脫落細(xì)胞學(xué)陽性者1例，陽性率為3.1%，陰性者31例。病理分級為高級別尿路上皮癌42例，F(xiàn)ISH陽性者37例，陽性率為88.1%，陰性者5例，尿脫落細(xì)胞學(xué)陽性者16例，陽性率為38.1%，陰性者26例；低級別尿路上皮癌38例，F(xiàn)ISH陽性者25例，陽性率為65.8%，陰性者13例，尿脫落細(xì)胞學(xué)陽性者3例，陽性率為7.9%，陰性者35例。具體見表1。

表1　FISH和尿脫落細(xì)胞學(xué)在病理不同分期、分級中的檢查結(jié)果及敏感性與特異性分析

3　討論

泌尿系統(tǒng)從腎盞、腎盂、輸尿管、膀胱及后尿道均被覆尿路上皮(又稱移行上皮)，起源于此部位的惡性腫瘤稱尿路上皮癌，是泌尿外科常見的惡性腫瘤，其特點是發(fā)病率高且術(shù)后極易復(fù)發(fā)，其中起源于腎盂和輸尿管的尿路上皮癌多屬于高分期、低分化[6]，惡性程度高，容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)指征。因此如何能對尿路上皮癌做出早期診斷及術(shù)后及時地監(jiān)測復(fù)發(fā)顯得尤為重要。FISH技術(shù)是一項分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，它是在放射性原位雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性原位雜交技術(shù)。其基本原理是用已知標(biāo)記的單鏈核酸為探針，按照堿基互補配對的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被熒光顯微鏡檢測到的雜交雙鏈核酸[7]。近年來，F(xiàn)ISH技術(shù)已廣泛用于血液腫瘤、宮頸癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌等疾病的診斷。2001年7月FISH檢測技術(shù)被美國FDA批準(zhǔn)可以用于尿路上皮癌的診斷。Fadl-Elmula等人研究發(fā)現(xiàn)，起源于上尿路與膀胱的尿路上皮癌在遺傳學(xué)上基本是一致的[8]，換言之，F(xiàn)ISH適用于膀胱和上尿路尿路上皮癌的診斷。

惡性腫瘤組織常發(fā)生染色體或基因等遺傳學(xué)的改變，其中尿路上皮癌易發(fā)生3號、7號和17號染色體數(shù)目的異常及9號染色體p21位點的缺失，其他如1、4、8、10、11、13、14、20及X、Y等染色體亦可能發(fā)生遺傳學(xué)改變，但概率相對較小。眾多研究資料證明CSP3、CSP7、CSP17及GLPp21探針組合診斷尿路上皮癌具有較高的敏感性和特異性[9-11]。本實驗就用此方法進(jìn)行尿路上皮癌診斷。

由本實驗結(jié)果可知，F(xiàn)ISH檢測和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查敏感性分別為77.5%、23.8%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，特異性分別為88.0%、100.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，且FISH檢測技術(shù)在肌層浸潤性、非肌層浸潤性、低級別和高級別的尿路上皮癌的診斷中均明顯高于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查。FISH技術(shù)在診斷尿路上皮癌中與尿脫落細(xì)胞學(xué)相比，具有較高的敏感性和相似的特異性。

臨床中常遇到腎癌侵犯腎盂或腎盂尿路上皮癌侵犯腎實質(zhì)的患者，這兩種腫瘤在影像學(xué)上難以區(qū)分，但兩者的手術(shù)方式完全不同，故術(shù)前對這種患者做出正確診斷至關(guān)重要。從遺傳學(xué)的角度來講，F(xiàn)ISH檢測技術(shù)可以用于兩者的區(qū)分，因為腎癌和腎盂尿路上皮癌的組織來源不同，發(fā)生的遺傳學(xué)改變也不相同。本實驗中未對腎癌患者行FISH檢測，這一結(jié)論尚需大量的實驗來驗證。

綜上所述，作為一種無創(chuàng)、快捷簡便、敏感度和特異度均較高、受其他因素影響小、標(biāo)本易獲取等優(yōu)點，且可以從基因水平并早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷尿路上皮癌，F(xiàn)ISH檢測技術(shù)在臨床上的使用越來越廣泛。但是由于檢測費用昂貴及實驗室技術(shù)人員要求較高，且只是定性診斷，不能對病變組織進(jìn)行定位，只能起協(xié)助診斷作用。目前，該項檢查不能大范圍的推廣。盡管如此，鑒于FISH檢測技術(shù)的眾多優(yōu)點，相信將來會有比較好的應(yīng)用前景。

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吳階平醫(yī)學(xué)基金會臨床科研專項資助基金(3R215P203428)

1007-4287(2016)09-1522-03

2016-03-26)