杜洪 金榮

三種不同脫鈣液在骨組織石蠟切片中的應(yīng)用比較

杜洪 金榮

目的：比較不同的脫鈣液對骨組織的脫鈣能力，優(yōu)化骨組織石蠟切片的制作流程。方法：選取15例手術(shù)切除的新鮮骨標(biāo)本，運(yùn)用3種不同的脫鈣液（Jenkins脫鈣液、14%硝酸水溶液、14%硝酸甲醛生理鹽水溶液）進(jìn)行脫鈣，記錄脫鈣時間，常規(guī)脫水、切片、HE染色，鏡下觀察，對比3種脫鈣液對骨和骨髓組織常規(guī)病理切片質(zhì)量和HE染色效果。結(jié)果：14%硝酸甲醛生理鹽水溶液組脫鈣能力最強(qiáng)，脫鈣最均勻，耗時最短，既能有效完全除去骨皮質(zhì)中的鈣質(zhì)，又能保護(hù)骨髓組織及細(xì)胞的形態(tài)完好，切片質(zhì)量和HE染色的效果最佳；14%硝酸水溶液組脫鈣液，使骨組織疏松發(fā)泡，組織變黃，對組織的損傷大，脫鈣不均勻，組織切片不完整，制片質(zhì)量和HE的效果最差；Jenkins脫鈣液組對組織的脫鈣能力、損傷程度、制片質(zhì)量和HE染色效果良好，14%硝酸甲醛生理鹽水溶液組和14%硝酸水溶液組之間。結(jié)論：3種脫鈣液對骨和骨髓組織都具有良好的脫鈣能力，制片質(zhì)量及HE染色效果比較，14%硝酸甲醛生理鹽水溶液＞Jenkins脫鈣液＞14%硝酸水溶液；14%硝酸甲醛生理鹽水溶液最適用于臨床常規(guī)病理制片中骨和骨髓組織的脫鈣。

骨組織；脫鈣液；HE染色

骨組織是由骨細(xì)胞和骨基質(zhì)組成的堅硬的結(jié)締組織，骨基質(zhì)富含以磷酸鈣和碳酸鈣為主的無機(jī)鈣鹽，二者的存在造成骨組織的硬度較大，不易切片且極易脫片，即便能夠勉強(qiáng)制成切片，在藍(lán)色鈣鹽背景下也難以看清細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對病理診斷工作造成很大的不便，因此在臨床病理活檢或?qū)嶒炐詣游镅芯恐斜仨氁M(jìn)行脫鈣處理才能進(jìn)行常規(guī)制片和觀察［1］。但是，如果骨組織脫鈣過度又會嚴(yán)重影響組織細(xì)胞染色效果，或使組織抗原丟失，從而影響對病變組織的病理診斷或科學(xué)實驗工作［2］。由于骨組織的特殊性也就有了相應(yīng)的技術(shù)和方法，掌握好骨組織的石蠟制片方法，對于提高診斷率，減少誤診，具有一定的實用價值［3］。本研究針對骨組織的特殊性，選擇三種不同的脫鈣液進(jìn)行脫鈣，比較其脫鈣效果和對HE染色的影響。在固定、脫鈣、堿化、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片及染色等技術(shù)進(jìn)行探討和經(jīng)驗總結(jié)，得到既方便臨床應(yīng)用，又適合科學(xué)研究的骨組織制片方法。

1 材料和方法

1.1 材料 選取我院送檢骨組織標(biāo)本15例，切成1cm×1cm×0.2cm的骨塊，每份樣本取三塊。組織離體后即用新鮮配制的體積分?jǐn)?shù)10%甲醛水溶液充分固定，取材，分別投入14%硝酸甲醛生理鹽水溶液、14%硝酸水溶液和Jenkins水溶液3組脫鈣液中脫鈣，記錄脫鈣終點(diǎn)的時間，包埋盒標(biāo)記脫水。

1.2 試劑及儀器 甲醛、濃鹽酸、冰醋酸、冰乙酸、硝酸、氯仿、無水乙醇、二甲苯（分析純），生理鹽水；石蠟蘇木素染液 伊紅染液。高級智能脫水機(jī)（Leica AsP300S）、組織包埋機(jī)（Thermo）、切片機(jī)（Thermo）、攤片烤片機(jī)（TKY-TKB）、多功能染色機(jī)（Leica ST5020）、自動蓋片機(jī)（CV5030）。

1.3 脫鈣液配制試驗分組處理［4-6］見表1。

表1 脫鈣液配制及方法分組

1.4 方法 將送檢骨組織進(jìn)行常規(guī)取材，浸入預(yù)先配制好的10%甲醛水溶液固定液中固定8h，將固定充分的骨組織取出，分別置于裝有適量的脫鈣液的100m l廣口瓶中，進(jìn)行脫鈣處理，并適時觀察組織顏色及骨組織脫鈣程度，檢查脫鈣效果，定期更換脫鈣液，記錄脫鈣時間。脫鈣“終點(diǎn)”測定：取脫鈣2h后的脫鈣液5ml，加入濃氨水?dāng)?shù)滴，調(diào)制中性（PH7.2），再加入5%草酸鈉，如液體渾濁，說明液體中有鈣質(zhì)，每隔2h重復(fù)測定，當(dāng)反應(yīng)至5分鐘仍無沉淀，表示脫鈣已達(dá)終點(diǎn)，此時骨組織肉眼呈半透明狀，漂浮在脫鈣液面，用手按壓柔軟有彈性，不刺手，無粗糙砂粒感，大頭針可以輕松刺入骨皮質(zhì)。脫鈣終止后將脫鈣完全的骨組織放入堿化液處理2h，流水沖洗1h，依次浸入70%、80%、90%、95%乙醇I、II脫水各1h，100%乙醇I、II各1h；二甲苯I、II各透明30min，常規(guī)浸蠟、包埋、切片、常規(guī)HE染色，鏡下觀察結(jié)果。

1.5 觀察指標(biāo) ①骨組織脫鈣時間；②骨組織HE染色效果。

2 結(jié)果

經(jīng)上述方法比較得出：14%硝酸甲醛生理鹽水溶液脫鈣后，組織常規(guī)制片效果較好，無皺縮、龜裂、膨脹現(xiàn)象，切片平坦，薄厚均勻；染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，骨基質(zhì)、骨原纖維、紅細(xì)胞、軟骨呈不同程度的紅色，脫鈣效果結(jié)果穩(wěn)定。見表2。

表2 三種脫鈣液處理時間以及常規(guī)制片分析比較

3 討論

脫鈣是指用化學(xué)或物理方法將骨組織中的鈣鹽和膠原纖維分離“除去鈣鹽”獲得完整的膠質(zhì)纖維成分［7］，骨組織含有大量的鈣鹽和無機(jī)鹽，需經(jīng)過脫鈣處理，使組織軟化后才能進(jìn)行切片處理。常用的脫鈣劑主要包括單純酸類、混合酸類、螯合劑等［8］。骨組織制片對臨床病理檢查非常重要，因而應(yīng)選擇較好的脫鈣液對所選骨組織標(biāo)本進(jìn)行較好的脫鈣處理，且不破壞細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，形態(tài)清楚，進(jìn)而確保組織制片的效果較好并合適臨床診斷需要［9］。在骨組織石蠟切片觀察骨組織學(xué)形態(tài)的研究中，組織學(xué)切片的制作是關(guān)鍵。石蠟切片的制作過程包括許多步驟，如固定、脫鈣、包埋、切片、染色等。其中，標(biāo)本的固定和脫鈣是骨組織石蠟切片制作中最為重要的步驟，直接影響著切片的質(zhì)量。脫鈣選用甲醛、硝酸和冰乙酸復(fù)合溶液，對骨內(nèi)的磷酸鈣和碳酸鈣，分解較快，對骨組織損害較小，且染色效果較好［10］。

脫鈣：“終點(diǎn)”測定是用化學(xué)方法，草酸鈉沉淀的原理，簡便易行，安全可靠。脫鈣后用堿化液處理，目的在于，在脫鈣過程中，酸性溶液打碎了骨組織中蛋白分子的橫鏈，并釋放出可以同水分子結(jié)合的親水基因，引起骨組織膨脹，經(jīng)堿化液處理，變成中性，保證制片和染色的最佳效果。

在整個制作過程中還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：①取材時骨組織塊不易過厚，一般在5mm左右，以免脫鈣時間過長影響染色效果；②脫鈣液要充足，一般為標(biāo)本體積的20～30倍，并注意多次更換新液；③脫鈣濕度在20℃以上，不宜過低，如在10℃以上，會使脫鈣速度減慢，引起組織傷害；④在整個脫鈣過程中切忌使用金屬容器和器械，盡量采用玻璃器皿；⑤在脫蠟后染色前，要充分水洗，以利于染色；⑥在染蘇木素時要適當(dāng)延長時間，一般比常規(guī)時間長一倍，染伊紅時間不宜過長，這樣可以得到較好的對比度，使色彩鮮艷；⑦切片時刀要鋒利，不要有缺口，卷刀，否則切片困難；⑧骨組織切片染色易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，最好用玻片附貼劑。

［1］張緒斌，熊正文，張華東，等.骨組織脫鈣技術(shù)及其應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)理論與實踐，2011，24（11）:1264-1266.

［2］潘利鋒，吳旭，夏建軍，等.不同脫鈣液對牙齒牙周聯(lián)合石蠟切片HE染色的影響［J］.中國療養(yǎng)醫(yī)學(xué)，2009，18（12）:1123-1125.

［3］胥維勇，楊群.脫鈣方法與脫鈣液的選擇及應(yīng)用［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2002，11（3）:263-263.

［4］羅燦嶠，木瓊，鐘覺民.不同的脫鈣液在骨組織制片中的比較應(yīng)用［J］.中國實用醫(yī)藥，2011，6（19）:27-28.

［5］羅燦嶠，莫木瓊，聶釗銘，等.四種脫鈣液對骨和骨髓組織及結(jié)構(gòu)影響的比較［J］.中國組織工程研究，2015，19（37）:5928-5932.

［6］繆勇建.介紹一種骨髓穿刺活檢的理想脫鈣劑及其HE染色法［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2008，25（2）:311-311.

［7］陳世梁，盧志承，董玉英.介紹一種改良脫鈣液在骨組織制片中的應(yīng)用［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2009，25（5）:557-555.

［8］馬少卿.骨髓活檢標(biāo)本脫鈣方法的改良［J］.診斷病理學(xué)雜志，2012，19（2）:110.

［9］萬蕾，章錦才，軒東英，等.不同脫鈣方式觀察牙髓組織切片的效果比較［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2012，33（7）:917-919.

［10］蘭淼，鞏麗，李艷紅，等.不同脫鈣液對骨髓組織切片HE染色效果的對比研究［J］.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2010，39（10）:1299-1300.

A

1004-2725（2016）05-0368-03

730050甘肅 蘭州，甘肅省腫瘤醫(yī)院病理科

金榮，E-mail:jinrong1024@163.com