季婷 田晨 王云從 劉晗 秦莉 顧金超 宋夢(mèng)丹 楊小娟 謝小冬

L-選擇素基因多態(tài)性在2型糖尿病腎病家系中的相關(guān)性分析

季婷 田晨 王云從 劉晗 秦莉 顧金超 宋夢(mèng)丹 楊小娟 謝小冬

目的：初步探討L-選擇素基因rs4987318、rs2229569、rs4656697、rs78261125單核苷酸多態(tài)性（SNP）與一家族性2型糖尿病腎病的相關(guān)性，為個(gè)體化治療糖尿病腎病提供基礎(chǔ)資料。方法：應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）-基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)同一家系中6名糖尿病腎病患者和13名健康成員L-選擇素基因多態(tài)性。結(jié)果：rs4987318位點(diǎn)基因型在該家系中基因型全部為AA，rs2229569位點(diǎn)基因型在該家系中基因型全部為CC，rs4656697位點(diǎn)在該家系中有GG、GC和CC型，患者組基因型頻率為GG（50%），GC（50%）對(duì)照組基因型頻率為GG（61.54%），GC（30.77%），CC（7.69%），應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。rs78261125位點(diǎn)在該家系中有GG和GC，病例組基因型頻率為GG（33.33%），GC（66.67%），對(duì)照組基因型頻率為GG（69.23%），GC（30.77%），應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：L-選擇素基因rs4987318位點(diǎn)與rs2229569位點(diǎn)在該家系內(nèi)無(wú)多態(tài)性；rs4656697位點(diǎn)與rs78261125位點(diǎn)多態(tài)性與該家族二型糖尿病腎病之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。

糖尿病腎?。籐-選擇素；單核苷酸多態(tài)性；家族性

糖尿病是由免疫功能紊亂、遺傳因素、微生物感染及精神因素、毒素、自由基毒素等各種致病因子作用于機(jī)體后導(dǎo)致的胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的蛋白質(zhì)、糖、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂的綜合征。2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是糖尿病的常見類型，95%以上的糖尿病患者為2型糖尿病。通常認(rèn)為2型糖尿病的發(fā)病不僅與環(huán)境因素有關(guān)，而且與遺傳因素也有著密切的聯(lián)系，不同民族和地域在遺傳和表型上均有異質(zhì)性。糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病全身性微血管病變表現(xiàn)之一，臨床特征為蛋白尿，漸進(jìn)性腎功能損害，高血壓，水腫，晚期出現(xiàn)嚴(yán)重腎功能衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。目前認(rèn)為糖尿病腎病的防治側(cè)重于預(yù)防，應(yīng)積極干預(yù)其危險(xiǎn)因素，因此，了解其發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。

選擇素是細(xì)胞粘附分子選擇素家族的成員之一，為單鏈跨膜的受體糖蛋白，表達(dá)于大多數(shù)外周血白細(xì)胞的表面。它主要介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的選擇性識(shí)別、粘附，在淋巴細(xì)胞歸巢、白細(xì)胞炎性滲出等過(guò)程中起重要作用。編碼L-選擇素的基因定位于人類1號(hào)染色體長(zhǎng)臂上，全長(zhǎng)約30 kb，含有10個(gè)外顯子。國(guó)外關(guān)于L-選擇素基因多態(tài)性與疾病關(guān)系的研究較多，Kretowski等研究發(fā)現(xiàn)L-選擇素基因T668C多態(tài)性與1型糖尿病相關(guān)，Takei等［1］則報(bào)道L-選擇素單核苷酸多態(tài)性與IgA腎病密切相關(guān)。

本研究從L-選擇素基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的相關(guān)性入手，根據(jù)2型糖尿病腎病家系內(nèi)的發(fā)病情況進(jìn)行初步探討，以期為該家系乃至更大范圍的人群的個(gè)體化治療提供基礎(chǔ)資料。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取寧夏回族自治區(qū)一2型糖尿病腎病家系，受試者簽署知情同意書后進(jìn)行相關(guān)檢查。糖尿病診斷按1999年WHO標(biāo)準(zhǔn)，胰島細(xì)胞抗體和谷氨基酸脫羧酶抗體陰性，無(wú)自發(fā)酮癥傾向。共收集到19位成員，男性10例，女性9例，年齡22～65歲，平均年齡（44±14）歲。其中2型糖尿病患者組6例為DN組，健康成員13例為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 資料收集。按照統(tǒng)一的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每位受試者測(cè)量身高、體質(zhì)量、腰圍、臀圍；計(jì)算體重指數(shù)（BMI），腰臀比（WHR）。

1.2.2 DNA的提取。抽取空腹外周靜脈血2ml，乙二胺四乙酸二鈉（EDTANa2）抗凝，常規(guī)酚-氯仿提取法提取DNA。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成。引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。見表1。

表1 PCR引物序列及PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度

1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。取擴(kuò)增產(chǎn)物量1微升，2%瓊脂糖凝膠（EB染色）電泳，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)在紫外燈下觀察。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序。測(cè)序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，結(jié)果使用BioEdit Sequence Alignment Editor軟件顯示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19軟件分析數(shù)據(jù)?；蛐秃偷任换蝾l率采用頻率計(jì)數(shù)法計(jì)算，研究對(duì)象經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)是否符合。基因型和等位基因頻率比較采用fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 rs4656697位點(diǎn)與rs78261125位點(diǎn)PCR產(chǎn)物和測(cè)序結(jié)果圖 rs4656697位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為718bp（如圖1）。rs4656697位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物序列圖譜，基因型分別為a:GC，b:GG，c:CC（如圖2）。rs78261125位點(diǎn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為680bp（如圖3）。Rs4656697位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物序列圖譜，基因型分別為a: GG，b:GC（圖4）。

圖1 rs4656597的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖2 L-選擇素基因rs4656697位點(diǎn)（G/C）測(cè)序圖

圖3 rs7826125的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

圖4 L-選擇素基因rs78261125位點(diǎn)（G7C）測(cè)序圖

2.2 基因型頻率分析 兩組L-選擇素基因rs4656697位點(diǎn)與rs78261125位點(diǎn)基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（p＞0.05）。兩位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布經(jīng)Fisher精確檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 糖尿病腎病組（DN）與對(duì)照組SNP多態(tài)性的比較［例（%）］

3 討論

近年來(lái)，糖尿病的發(fā)病率逐年上升，而且發(fā)病年輕化，糖尿病腎病發(fā)病率也逐年上升。據(jù)調(diào)查，糖尿病腎病的發(fā)生具有相當(dāng)強(qiáng)度的家族聚集現(xiàn)象，即一個(gè)家系中有3個(gè)或3個(gè)以上患有糖尿病，說(shuō)明其發(fā)病具有遺傳傾向，大多數(shù)的糖尿病患者最終不會(huì)發(fā)生腎臟病變，但一些長(zhǎng)期血糖控制良好的患者最后卻發(fā)生糖尿病腎病，這說(shuō)明糖尿病腎病有一定的易感性，遺傳因素在糖尿病腎病的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

有大量實(shí)驗(yàn)及臨床資料表明，糖尿病繼發(fā)的血管病變主要是一種慢性血管炎性反應(yīng)，糖尿病腎病存在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥介質(zhì)水平的升高，有關(guān)炎性細(xì)胞因子在其中作用的研究也愈發(fā)增多，目前已證實(shí)細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）［2］、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）［3，4］、內(nèi)皮素-1（ET-l）［5］、血小板活化因子（PAF）［6］、白介素18（IL-18）［7］、腫瘤壞死因子-α［8］等與糖尿病腎病的發(fā)病有關(guān)，其中粘附分子與糖尿病腎病的關(guān)系最為密切?，F(xiàn)已證實(shí)，糖尿病腎病存在粘附分子表達(dá)增加，粘附分子介導(dǎo)的白細(xì)胞與血小板、白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間的相互作用，在炎癥反應(yīng)、血栓形成和組織損傷的過(guò)程中有著決定性的作用。

目前，對(duì)L-選擇素rs2229569，rs4987318基因位點(diǎn)多態(tài)性與二型糖尿病易感性關(guān)系的研究已經(jīng)有一些，但是他們?cè)诓煌娜巳褐兴@得的結(jié)果不盡相同。有報(bào)道在L-選擇素第5外顯子區(qū)域213位點(diǎn)（rs2229569）處存在C到T的突變，并導(dǎo)致脯氨酸到絲氨酸的替換，可能由此影響其表達(dá)水平及生物學(xué)活性。夏尊恩［9］等在對(duì)中國(guó)湖北地區(qū)漢族人群L-選擇素基因P213S多態(tài)性的研究表明此位點(diǎn)上存在PP，PS，SS三種基因型，以PS雜合子最多見，PP純合子次之，SS純合子最少見。張陽(yáng)東［10］等在對(duì)2型糖尿病患者rs4987318基因位點(diǎn)多態(tài)性和生化指標(biāo)的研究中報(bào)道rs4987318基因多態(tài)性可能與2型糖尿病的易患性、患者血脂代謝紊亂和血管炎癥的發(fā)生有關(guān)。在本研究中，在該家系內(nèi)L-選擇素rs4987318基因位點(diǎn)全部為AA型，rs2229569基因位點(diǎn)全部為CC型，說(shuō)明在該家系內(nèi)無(wú)多態(tài)性。分析以上各研究得到結(jié)果不同的原因，可能是不同的研究人群具有不同的遺傳基礎(chǔ)，也有可能摻雜了環(huán)境因素對(duì)研究的干擾。

本研究中，結(jié)果顯示，L-選擇素rs4656697基因位點(diǎn)在該家系內(nèi)，GG型在糖尿病腎病患者組與對(duì)照組分別為50%、61.54%，GC型50%、30.77%，CC型0%、7.69%，G等位基因頻率為75%、76.92%，C等位基因頻率為25%、23.08%?；蛐秃偷任换蝾l率在兩組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明L-選擇素rs4656697基因位點(diǎn)多態(tài)性與二型糖尿病腎病可能無(wú)相關(guān)性。rs78261125基因位點(diǎn)在該家系中有GG和GC，病例組基因型頻率為GG（33.33%），GC（66.67%），對(duì)照組基因型頻率GG（69.23%），GC（30.77%），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明L-選擇素rs4656697基因位點(diǎn)多態(tài)性與二型糖尿病腎病可能無(wú)相關(guān)性。但是本研究只選擇一個(gè)家系，樣本量小，今后需要擴(kuò)大樣本量，在多個(gè)家系中進(jìn)行基因多態(tài)性與相關(guān)性的研究來(lái)驗(yàn)證。

綜上所述，對(duì)于L-選擇素基因多態(tài)性與2型糖尿病腎病的研究，還有待于繼續(xù)進(jìn)行大樣本，多中心研究。通過(guò)對(duì)2型糖尿病腎病遺傳學(xué)因素的探討，將會(huì)為2型糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)，診斷及治療提供一條新的線索和途徑。

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Study on the association between a family with type 2 diabetes nephropathy（DN）and the L-selection（SELL）genes polymorphism

Ji Ting1，Tian Chen3，Wang Yuncong1，Liu Han3，Qin Li1，Gu Jinchao1，Song Mengdan2，Yang Xiaojuan2，Xie Xiaodong21.The first Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；2.School of Basic Medical Science，Institute of Genetic，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China；3.The Second Clinical Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China

Xie Xiaodong，E-mail:18298343353@163.com

Objective:To discussed the association between single nucleotide polymorphisms（SNPs）as rs4987318，rs2229569，rs4656697，rs78261125 in L-selectin（SELL）gene with familial type 2 diabetic nephropathy（DN），to provide basic statistics for individualized treating of diabetic nephropathy.Methods:Four SNPs as rs4987318，rs2229569，rs4656697 and rs78261125 of SELL gene in six patients of DN and thirteen healthy members from a family were analyzed with polymerase chain reaction-gene sequencing technology.Genotype of L-selectin was determined in 6 patients with familial type 2 diabetic nephropathy and 13 healthy controls by polymerase chain reaction-ligase dection reaction（PCR-LDR）technique.Results:The genotype of rs4987318 locus in this family all are AA.The genotype of rs2229569locus in this family all are CC.The genotype of rs4656697locus in this family are GG，GC and CC.Genotype frequencies of patients are GG（50%）and GC（50%），and genotype frequencies of the controls are GG（61.54%），GC（30.77%）and CC（7.69%）.The genotype of rs78261125locus in this family are GG and GC.Genotype frequencies of patients are GG（33.33%）and GC（66，67%），and genotype frequencies of the controls are GG（69.23%）and GC（30.77%）.There was no significant difference in Fisher'sprecise test（P＞0.05）.Conclusion:The SNPS（rs4987318 and rs2229569）in SELL gene have no polymorphism in this family.And the polymorphisms of SELL rs4656697 and rs78261125 have no association with this DN family.

diabetic nephropathy；L-selectin；single nucleotide polymorphisms；family

A

1004-2725（2016）05-0326-04

2014年“本科教學(xué)工程”國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201410730139）

730000甘肅 蘭州，蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（季婷、王云從、秦莉、顧金超），基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳研究所（宋夢(mèng)丹、楊小娟、謝小冬），第二臨床醫(yī)學(xué)院（田晨、劉晗）

謝小冬，E-mail:18298343353@163.com