范彬 邱國玉 石曉峰 藺莉 沈薇 許淑琴 李志俊

祖師麻凝膠膏劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

范彬 邱國玉 石曉峰 藺莉 沈薇 許淑琴 李志俊

目的：建立祖師麻凝膠膏劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對凝膠膏劑中祖師麻藥材進行定性鑒別；采用雙波長高效液相色譜對祖師麻凝膠膏劑中紫丁香苷、祖師麻甲素、7-羥基香豆素進行含量測定。結(jié)果：樣品中檢出祖師麻藥材的特征斑點，圖譜斑點清晰、專屬性強，陰性對照無干擾。紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素的進樣量分別在0.1520～0.9120μg、1.0620～4.9560μg、0.0450～0.4500μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r=0.9993～0.9998）；平均加樣回收率和RSD分別為102.59%、97.01%、97.59%和2.41%、1.59%、2.69%。結(jié)論：所建立的定性、定量分析方法簡便快速、準(zhǔn)確度高，能夠有效控制祖師麻凝膠膏劑的質(zhì)量。

祖師麻凝膠膏劑；紫丁香苷；祖師麻甲素；7-羥基香豆素；薄層色譜法；雙波長高效液相色譜法

祖師麻凝膠膏劑系單味祖師麻或合用獨一味經(jīng)提取加工制成的外用貼劑［1］，其中祖師麻藥材為瑞香科瑞香屬植物黃瑞香Daphne giraldii Nitsche的根皮和莖皮，主要含有香豆素類、黃酮類、木質(zhì)素類、萜類等化學(xué)成分［2］，其中香豆素類成分為祖師麻藥材乃至瑞香科植物的特征成分之一［3］。截至目前從黃瑞香的根莖中分離得到瑞香素（又稱祖師麻甲素，daphnetin）、瑞香苷（daphnin）、7-羥基香豆素（7-hydroxy coumarin）、7-羥基-8-甲氧基香豆素（hydragetin）等6個香豆素類化合物［4，5］，該類化合物具有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎、消腫作用，對風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病的療效尤為顯著［6］。為了建立祖師麻凝膠膏劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文參照文獻方法［7-9］，采用薄層色譜法對祖師麻凝膠膏劑中祖師麻藥材進行了定性鑒別，并采用雙波長高效液相色譜法同時測定了祖師麻凝膠膏劑中紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素的含量，希冀為祖師麻凝膠膏劑的新藥開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），AE260型萬分之一電子天平（瑞士Mettler公司），UV-240紫外分光光度計（日本島津公司），ZF-20D暗箱式紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），SK3310LHC超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 祖師麻凝膠膏劑 （批號：20150415、20150422、20150510）由甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所提供。對照品祖師麻甲素（批號：110900-200405，供含量測定用）、7-羥基香豆素（批號：111739-200501，供含量測定用）、紫丁香苷（批號：111574-200603，供含量測定用）和祖師麻對照藥材（批號：1243-0301，供含量測定用）均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備。 精密稱取祖師麻甲素對照品適量，加50%甲醇配制成每1m l含祖師麻甲素0.708mg的祖師麻甲素對照品溶液；精密稱取7-羥基香豆素對照品適量，加甲醇配制成每1ml含7-羥基香豆素0.150mg的7-羥基香豆素對照品溶液；精密稱取紫丁香苷對照品適量，加甲醇配制成每1ml含紫丁香苷0.152mg的紫丁香苷對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備。取祖師麻凝膠膏劑1貼，剪碎，精密稱取0.5g置25m l容量瓶中，加入50%甲醇20ml，超聲提取0.5h（160W，59kHz），恒重，加50%甲醇定容，取上清液作為供試品溶液。

2.1.3 祖師麻對照藥材溶液的制備。精密稱取祖師麻對照藥材1g，置25m l容量瓶中，加入50%甲醇20ml，超聲提取0.5h（160W，59kHz），恒重，加50%甲醇定容，取上清液作為祖師麻對照藥材溶液。

2.1.4 陰性對照溶液的制備。制備不含祖師麻浸膏粉的凝膠膏劑，按“2.1.2”項下方法操作制備陰性對照溶液。

2.2 薄層鑒別 分別吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液、對照藥材溶液、祖師麻甲素對照品溶液、7-羥基香豆素對照品溶液各10μl，點于同一硅膠G254板上，以氯仿∶醋酸乙酯∶甲酸∶乙醚（10∶1∶1∶3）為展開劑［10］，展開，取出、晾干，置紫外燈（365nm）下檢視，結(jié)果在供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而陰性制劑無干擾，見圖A。

分別吸取上述供試品溶液、陰性對照溶液、對照藥材溶液、紫丁香苷對照品溶液各10μl，點于同一硅膠G254板上，以氯仿∶甲醇∶水（15∶4∶0.2）為展開劑［11］，展開，取出、晾干，碘蒸汽顯色后檢視，結(jié)果在供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，而陰性制劑無干擾，見圖B。

圖1 祖師麻凝膠膏劑的薄層色譜

3 含量測定

3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～15min，8%A；15～20min，20%A；20～35min，8%A；流速：1m l/min；柱溫：30℃；檢測波長：223nm（紫丁香苷）［12］，327nm（祖師麻甲素、7-羥基香豆素）；進樣量：20μl。

3.2 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取上述單一對照品溶液配制成濃度為紫丁香苷15.2μg/ml、祖師麻甲素106.2μg/ml和7-羥基香豆素4.5μg/m l的混合對照品溶液。分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20μl，按照“3.1”項下的色譜條件進樣測定，結(jié)果供試品溶液與對照品溶液中紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素色譜峰保留時間一致，陰性對照無干擾，理論塔板數(shù)按紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素峰面積計不低于3000，分離度＞1.5。色譜圖見圖2。

圖2 祖師麻凝膠膏劑的HPLC圖

3.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下紫丁香苷對照品溶液50、100、150、200、250、300μL，祖師麻甲素對照品溶液75、150、200、250、300、350μL，7-羥基香豆素對照品溶液15、30、60、90、120、150μL，分別將同一序號的三種對照品溶液加至1mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度搖勻，制得系列濃度的混合對照品溶液。在上述色譜條件下依次進樣。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，各成分的回歸方程、線性范圍見表1。結(jié)果表明各成分的進樣量與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

表1 線性關(guān)系

3.4 精密度試驗 精密吸取新鮮配制的濃度為紫丁香30.4μg/m l、祖師麻甲素177.0μg/m l和7-羥基香豆素13.5μg/ml的混合對照品溶液20μl，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，測得紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素峰面積的RSD分別為1.83、1.44、1.08%，表明儀器精密度良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液（批號20150412）20μl，按上述色譜條件，分別于制備后的0、2、4、6、8、10、12、24h進行測定，測得24h內(nèi)紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素峰面積的RSD為1.80%、0.57%、2.80%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 重復(fù)性試驗 取同一批號祖師麻凝膠膏劑1貼（批號20150412），剪碎，精密稱取0.5g，共6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件，進樣20μl，測得紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素的平均含量和RSD分別為1.1561、5.5841、0.625mg/g和2.81%、1.79%、2.28%，表明該方法的重復(fù)性較好。

3.7 加樣回收率試驗 取已知含量（批號20150412）的祖師麻凝膠膏劑1貼，剪碎，精密稱定，共9份，每份約0.25g，按樣品含量的80%、100%、120%分別加入紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依上述色譜條件進樣20μL，測定，計算回收率。結(jié)果紫丁香苷、祖師麻甲素和7-羥基香豆素的平均加樣回收率分別為102.59%、97.01%、97.59%，RSD分別為2.41%、1.59%、2.69%。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗（n=9）

3.8 樣品測定 取祖師麻凝膠膏劑3批，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，依照“3.1”項下的色譜條件進樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 祖師麻凝膠膏劑中3個活性成分的含量測定結(jié)果（mg/g，n=3）

4 討論

文獻報道［12-14］，HPLC法測定祖師麻藥材及其制劑中紫丁香苷含量通常采用的檢測波長為223nm和266nm，測定祖師麻甲素和7-羥基香豆素采用的檢測波長大多為327 nm。本實驗分別對紫丁香苷、祖師麻甲素和-羥基香豆素對照品溶液在200～500nm進行全波長掃描，結(jié)果顯示紫丁香苷在223nm處有最大吸收；祖師麻甲素和7-羥基香豆素的最大吸收波長為327nm，為此本文采用雙波長法測定祖師麻凝膠膏劑中3種苯丙素成分的含量。

本實驗通過對不同的流動相系統(tǒng)甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-醋酸-水溶液、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液的分離效果考察，發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸水溶液的分離效果較好，進而優(yōu)選確定乙腈-0.1%磷酸作為流動相。由于等度洗脫分析時間較長，且極性相近的成分較多，對測定組分有一定的干擾，故使用梯度洗脫；按照優(yōu)化后的色譜條件，3種苯丙素成分色譜峰的基線平穩(wěn)、分離度較好，可滿足同時測定的要求。

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Study on quality standard for zushima cataplasm

Fan Bin1，Qiu Guoyu2，Shi Xiaofeng1，Lin Li1，Shen Wei1，Xv Shuqin2，Li Zhijun2.1.Gansu Institute of Pharmacology，Academy of Medical Science，Lanzhou 730050，China；2.Gansu Lanzhou Institute for Food and Drug Control，Lanzhou 730030，China

Shi Xiaofeng，E-mail：shixiaofeng2005@163.com

Objective:To establish the quality standard for zushima cataplasm.Methods:Thin-layer chromatography was used to identify Zushima in Zushima cataplasm.The contents of syringin，daphnetin and 7-hydroxycoumarin in zushima cataplasm were determined by dual-wavelength HPLC.Results:Characteristic spots of zushima could be detected by TLC from zushima cataplasm，and the spots were clear and specific without interference from negative samples.a good linear correlation in the ranges of 0.1520～0.9120μg，1.0620～4.9560μg，0.0450～0.4500μg（r=0.9993～0.9998）for syringin，daphnetin and 7-hydroxycoumarin.The average recovery rates and RSD were 102.59%、97.01%、97.59%and 2.41%、1.59%、2.69%，respectively.Conclusion:The established qualitative and quantitative methods are simple and accurate，which can be used for the quality control of zushima cataplasm.

zushima cataplasm；syringin；daphnetin；7-hydroxycoumarin；TLC；dual-wavelength HPLC

A

1004-2725（2016）05-0321-04

甘肅省中醫(yī)藥管理局科研項目課題（項目編號：GZK-2011-81，GZK-2014-19）、蘭州市社會發(fā)展類科技計劃項目（項目編號：2013-3-39）

730050甘肅 蘭州，甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥物研究所（范彬、石曉峰、藺莉、沈薇）；730030甘肅 蘭州，蘭州市食品藥品檢驗所（邱國玉、許淑琴、李志?。?/p>

石曉峰，E-mail：shixiaofeng2005@163.com