趙　峰　何　薇　張國平　劉少俊　王　輝　石　碩

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科，河北　石家莊　050031)

?

透明質(zhì)酸對(duì)骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中細(xì)胞蛋白多糖分泌功能的影響

趙峰何薇1張國平劉少俊王輝石碩

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科，河北石家莊050031)

目的探討透明質(zhì)酸(HA)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠骨關(guān)節(jié)炎(OA)細(xì)胞增殖率及蛋白多糖分泌功能的影響。方法選取無特定病原體(SPF)級(jí)成年雄性SD大鼠1只，機(jī)械分離膝關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶消化，CO2恒溫培養(yǎng)，取第三代傳代細(xì)胞，將其與DMEM培養(yǎng)液混合制成的細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為三組，每組8個(gè)孔，接受不同的處理方法。模型組以白細(xì)胞介素(IL)-1β建立體外OA細(xì)胞模型；HA組造模外加入不同濃度(10、50、100、150 μg/L)的透明質(zhì)酸(HA)；對(duì)照組不加IL-1β和HA，均孵育72 h。分別采用四氮甲基唑藍(lán)(MTT)法及二甲基亞藍(lán)(DMB)比色法檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞的增殖率及蛋白多糖的含量。結(jié)果模型組與HA組的細(xì)胞增殖率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而模型組與HA組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；模型組與HA組(10、50 μg/L)的蛋白多糖含量均顯著低于對(duì)照組，而HA 100、150 μg/L組的含量高于模型組(P<0.05)，而兩組與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)論外源性HA可促進(jìn)OA細(xì)胞對(duì)蛋白多糖的分泌功能，但對(duì)細(xì)胞增殖率無影響。

骨關(guān)節(jié)炎；透明質(zhì)酸；蛋白多糖

骨關(guān)節(jié)炎(OA)病理基礎(chǔ)是關(guān)節(jié)軟骨中細(xì)胞減少和組織結(jié)構(gòu)破壞〔1，2〕，研究表明，軟骨中蛋白多糖(PG)減少是造成軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞的重要原因〔3〕。透明質(zhì)酸(HA)是一種酸性黏多糖，是關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)中的重要組分，在潤滑關(guān)節(jié)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和水電解質(zhì)的擴(kuò)散及運(yùn)轉(zhuǎn)、調(diào)節(jié)血管壁通透性、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、抑制炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用；同時(shí)，HA也是PG組成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)保證軟骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的正常不可或缺。雖然美國骨科醫(yī)師學(xué)會(huì)(AAOS)在最新的骨關(guān)節(jié)炎治療指南中不推薦使用關(guān)節(jié)腔注射HA治療OA，但近年來有觀察發(fā)現(xiàn)，HA對(duì)改善OA患者的臨床癥狀作用顯著〔4〕，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過分析HA對(duì)PG分泌功能的影響，為探索OA的臨床治療方案及其作用機(jī)制提供新的線索。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物選取無特定病原體(SPF)級(jí)成年雄性SD大鼠1只，體質(zhì)量120 g，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證編號(hào)：DK0709-0165。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室自由飲食喂養(yǎng)，室溫(25.0±2.0)℃，自然光照。

1.2方法

1.2.1大鼠軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)將大鼠麻醉、處死，摘取膝關(guān)節(jié)軟骨，手術(shù)過程注意無菌操作。將軟骨剪成1 mm3左右的小碎塊后，分別以胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶對(duì)軟骨碎片消化1 h，得到軟骨細(xì)胞懸液。將軟骨細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)液中(含10%胎牛血清)，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后約2～3 d換液。待細(xì)胞匯集成片后棄去原培養(yǎng)基，以磷酸鹽緩沖液(PBS)(含1%青鏈霉素)漂洗2遍，后加入0.25%的胰蛋白酶(含0.01%EDTA)搖勻置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)消化3～5 min，傳代培養(yǎng)，取第三代細(xì)胞待用。

1.2.2OA細(xì)胞模型的建立與分組以DMEM培養(yǎng)液(含0.5%胎牛血清)將第三代軟骨細(xì)胞稀釋成細(xì)胞懸液，濃度為4×107/L。吸取100 μl置于96孔板上。分別取8個(gè)孔用于空白對(duì)照組(對(duì)照組)及OA細(xì)胞模型組(模型組)，另取32孔作為HA干預(yù)組(HA組)。其中，模型組及HA組均進(jìn)行OA細(xì)胞模型建立：取1 μl白細(xì)胞介素(IL)-1β溶液(美國Sigma公司)加入各孔中(終濃度10 μg/L)，混勻，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，棄上清。造模成功判定標(biāo)準(zhǔn)為顯微鏡下軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)胞質(zhì)回縮，且胞內(nèi)可見空泡。本次研究中40個(gè)孔均造模成功，成功率為100%。

1.2.3處理方法HA組在孵育前于各孔中加入100 μl不同濃度的HA(分子量為2×106U，美國Sigma公司)，使HA的終濃度分別為10、50、100、150 μg/L，各濃度HA組均為8個(gè)孔；對(duì)照組不加IL-1β和HA，模型組不加HA，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育72 h。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1四氮甲基唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)軟骨細(xì)胞的增殖率于各孔依次加入20 μl 5 g/L的MTT試劑(美國Sigma公司)及100 μl培養(yǎng)液(不含血清)，置于恒溫培養(yǎng)箱中再孵育4 h，棄上清，后加入甲瓚溶液200 μl。以酶標(biāo)儀測(cè)定各溶液光密度值(OD)，設(shè)置主波長為570 nm，參比波長為690 nm。增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.2二甲基亞藍(lán)(DMB)比色法檢測(cè)軟骨細(xì)胞中PG的含量取稀釋的細(xì)胞懸液(濃度為1×108/L)接種于24孔板上，每孔加入1 ml DMEM液(含10%胎牛血清)后，恒溫培養(yǎng)24 h。各組實(shí)驗(yàn)方法中除所加IL-1β及HA溶液均為10 μl外，其他處理方法同上。孵育72 h后分離上清。于每孔加入1 ml細(xì)胞懸液裂解細(xì)胞，反應(yīng)完全后移入5 ml試管內(nèi)。加入1 ml 32 mg/L DMB溶液(美國Sigma公司)，充分混勻5 min后，以分光光度計(jì)比色(波長為525 nm)讀取吸光度值。

由于硫酸軟骨素是軟骨中PG的主要組成成分，且其含量與DMB比色法讀取的吸光度值呈良好的線性關(guān)系，因此，本研究以硫酸軟骨素含量的吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.028X-0.147，R Sq Linear=99.9%，可作為PG的標(biāo)準(zhǔn)曲線。操作：取濃度為5、10、15、20、25、30 mg/L的硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)液各1 ml，均加入DMB顯色劑1 ml，混勻，5 min后讀取各濃度液體于525 nm波長處的吸光度值，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。將所測(cè)軟骨細(xì)胞溶液的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得PG的含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS14.0軟件，正態(tài)分布、方差齊性資料進(jìn)行單因素方差分析及兩兩比較的SNK-q檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

模型組與HA組的細(xì)胞增殖率均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而模型組與HA組比較均無差異(P>0.05)。模型組與HA組(10、50 μg/L)的PG含量均顯著低于對(duì)照組，而HA組(100、150 μg/L)組均顯著高于模型組(P<0.05)，而與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1　HA對(duì)大鼠OA細(xì)胞增殖率和PG含量的影響

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3　討　論

OA是骨科常見的慢性疾病，以軟骨的變性、破壞和骨質(zhì)增生為主要特征，好發(fā)于中老年人群。目前OA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，而細(xì)胞因子〔IL-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α等〕是研究OA發(fā)病機(jī)制的重要因素，有研究認(rèn)為，IL-1是OA產(chǎn)生的始動(dòng)因子〔5〕，在促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡、降解細(xì)胞外基質(zhì)等骨代謝過程中發(fā)揮重要作用。本研究顯微鏡下觀察顯示，IL-1β可造成軟骨細(xì)胞的形態(tài)變化，誘導(dǎo)OA細(xì)胞的產(chǎn)生。HA是一種由滑膜B細(xì)胞分泌的高分子黏多糖，在關(guān)節(jié)滑液和軟骨基質(zhì)的組成中必不可少，對(duì)于維持細(xì)胞及基質(zhì)的穩(wěn)定和平衡、潤滑關(guān)節(jié)、營養(yǎng)和保護(hù)軟骨、抑制炎癥等具有重要作用〔6〕。有研究表明，關(guān)節(jié)液中HA含量的減低與OA的形成密切相關(guān)，可作為反映OA嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)〔7〕。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)OA患者注射外源性HA可顯著緩解臨床癥狀〔8〕，具有良好的治療效果。其作用機(jī)制主要有：①對(duì)關(guān)節(jié)軟骨應(yīng)力進(jìn)行覆蓋、潤滑和緩沖作用；②降低關(guān)節(jié)內(nèi)炎癥反應(yīng)；③正反饋促進(jìn)內(nèi)源性HA的分泌〔9〕。此外，HA在細(xì)胞增殖、合成和分化等方面也具有促進(jìn)作用〔10〕，而本研究未發(fā)現(xiàn)其在退變軟骨細(xì)胞中的促增殖作用，這可能與本實(shí)驗(yàn)僅為體外實(shí)驗(yàn)，未形成體內(nèi)軟骨組織相似的細(xì)胞外環(huán)境有關(guān)。另外，HA是關(guān)節(jié)內(nèi)PG的主干成分，PG鏈上的大量糖胺多糖支鏈(GAG)可外伸與陽離子和水分子結(jié)合，使關(guān)節(jié)及組織具有巨大的抗壓力作用。同時(shí)，PG也是軟骨基質(zhì)的主要成分。因此，關(guān)節(jié)內(nèi)PG含量的穩(wěn)定對(duì)于維持軟骨組織的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的支撐作用〔11〕。本研究結(jié)果顯示，高濃度的外源性HA可增加退變軟骨細(xì)胞中PG的含量，提示外源性HA可促進(jìn)OA細(xì)胞中PG的合成和分泌。而研究未發(fā)現(xiàn)低濃度HA(10、50 μg/L)對(duì)PG的促分泌作用，提示低濃度HA對(duì)于PG的合成作用不顯著。原因可能是低濃度HA合成的PG含量較低，還不足以對(duì)其合成作用形成正反饋。

1Tsonga T，Michalopoulou M，Malliou P，etal.Analyzing the history of falls in patients with severe knee osteoarthritis〔J〕.Clin Orthop Surg，2015；7(4)：449-56.

2孟祥苗.葛根素對(duì)經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)的影響〔D〕.福州：福建中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

3Suutre S，Kerna I，Lintrop M，etal.Evaluation of correlation of articular cartilage staining for DDR2 and proteoglycans with histological tissue damage and the results of radiographic assessment in patients with early stages of knee osteoarthritis〔J〕.Int J Clin Exp Pathol，2015；8(5)：5658-65.

4Altman RD，Manjoo A，F(xiàn)ierlinger A，etal.The mechanism of action for hyaluronic acid treatment in the osteoarthritic knee：a systematic review〔J〕.BMC Musculoskelet Disord，2015；16(1)：321.

5霍雷.透明質(zhì)酸鈉注射配合自體富血小板血漿注射治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床及實(shí)驗(yàn)研究〔D〕.蘇州：蘇州大學(xué)，2014.

6魏明波，吳燕麗.氨基葡萄糖聯(lián)合透明質(zhì)酸鈉治療顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)病的臨床觀察〔J〕.口腔醫(yī)學(xué)研究，2013；29(6)：563-4，568.

7Sasaki E，Tsuda E，Yamamoto Y，etal.Serum hyaluronic acid concentration predicts the progression of joint space narrowing in normal knees and established knee osteoarthritis-a five-year prospective cohort study〔J〕.Arthritis Res Ther，2015；17(3)：283.

8Migliore A，Procopio S.Effectiveness and utility of hyaluronic acid in osteoarthritis〔J〕.Clin Cases Miner Bone Metab，2015；12(1)：31-3.

9劉契，鄧廉夫.骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)細(xì)胞因子及蛋白的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013；13(1)：187-90.

10Wang Z，Wu G，F(xiàn)eng Z，etal.Microarc-oxidized titanium surfaces functionalized with microRNA-21-loaded chitosan/hyaluronic acid nanoparticles promote the osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells〔J〕.Int J Nanomedicine，2015；10：6675-87.

11拉希德，劉世清.透明質(zhì)酸對(duì)體外培養(yǎng)大鼠退變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響〔J〕.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007；28(2)：177-80，184.

〔2015-12-13修回〕

(編輯袁左鳴)

河北省2015年度醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(No.20150640)

趙峰(1978-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事關(guān)節(jié)損傷與修復(fù)方面的研究。

R68

A

1005-9202(2016)18-4417-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.18.006

1河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院手外科