劉兆斌

（臨沂大學生命科學院，山東臨沂 276000）

光子晶體水凝膠膜在多元生物分子檢測中的應用

劉兆斌

（臨沂大學生命科學院，山東臨沂 276000）

我們發(fā)展了一種利用單分散硅球的自組裝過程中的靜電排斥作用形成非密堆積型的光子晶水凝膠膜的方法。通過調節(jié)硅球的大小和濃度來形成不同的反射峰來作為載體的編碼，利用具有不同反射峰的水凝膠光子晶體膜作為編碼載體用作蛋白的多元檢測分析。實驗證實這種載體適合于多元標記檢測，并且具備優(yōu)異的編碼性能和加工性能。

光子晶體水凝膠膜；非密堆積型光子晶體；多元生物檢測

自從人類基因組被破解以來，獲得更多生物分子信息的要求也不斷增加。為了同時區(qū)分不同的分析物，應當對分子進行編碼。最常見的方法是平面載體技術。這種技術是在平面固相載體上建立二維探針分子（抗體，核酸，藥物替代物等）的坐標，對于一種已知靶分子來說每個陣列坐標代表一個探針。平面陣列對于高濃度分子檢測具有重要作用，但是結果的好壞和獲得結果的速度被平面面積嚴重制約。近年來，將探針固定在編碼載體表面的懸浮陣列在多元分析中成為一種有吸引力的選擇。這種陣列對于檢測新分析物具有高流動性，由于分析物和探針能更廣泛的擴散，懸浮陣列在溶液中顯示出更快的反應動力學。目前有很多編碼方法，包括使用熒光分子，形狀編碼，量子點等在這些編碼方法中，光譜編碼載體由于其編碼解碼的簡便得到了很好的應用。熒光染料和量子點是主要的光譜編碼元素，熒光編碼的微粒子已經被Luminex和其他公司商業(yè)化。然而，熒光染料會發(fā)生淬滅和漂白，量子點通常具有生物毒性［1，2］。而且，熒光載體會與標記分子的信號相混合從而影響檢測極限。作為一種新的光譜編碼載體，光子晶體的編碼信號是來自其禁帶的特征反射峰［3-7］。由于反射峰來源于光子晶體的周期結構，編碼十分穩(wěn)定而且熒光本底低，使得光子晶體在高靈敏度檢測上更加穩(wěn)定。

本文首次嘗試將非密堆積型膠體晶體水凝膠薄膜作為一種光譜編碼的載體進行生物分子檢測。凝膠薄膜可以提供三維網狀結構，從而固定更多的生物分子。此外，高分子水凝膠更具柔性，相比PDMS、PMMA等物質應該具有更好的加工特性，可以期待利用水凝膠鎖定有序結構的膠體晶體膜作為編碼載體應該具有更好的應用前景。

1　實驗和方法

1.1實驗材料和儀器

丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺（上海博光生物科技有限公司）；AIBN，實驗室自制；無水乙醇；

去離子水：Millipore-Q純水機，110 nm二氧化硅膠體晶體（日本尼桑公司）；離子交換樹脂（美國Biorad公司），掃描電鏡：Hitachi S-3000N。

1.2非密堆積型膠體晶體薄膜的制備

將非緊密堆積型二氧化硅膠體晶體用10%（質量體積比）丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺混合液（丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺=29∶1，摩爾比）稀釋至為12.3%～18.8%（體積比），加引發(fā)劑偶氮異二丁腈（1%，質量體積比）混勻后，通入氮氣2～4 min或真空脫氣2～4 min，灌入模具中，靜置20 min，形成非密堆積型膠體晶體。如圖1所示，高壓汞燈照射聚合40～60 min，即得膠體晶體凝膠。將膠體晶體凝膠從模具上剝落，用純水充分洗滌后置于純水中保存。利用機械的辦法將光子晶體水凝膠膜切割成形狀規(guī)則的1 cm×1 cm的光子晶體膜。

1.3非密堆積型膠體晶體薄膜上的生物分子的固定

將膠體晶體凝膠薄膜切割成邊長為1 cm，厚度為0.125 mm的正方形小塊。取已知制備好的膠體凝膠薄膜，分別放入不同濃度的戊二醛的PB溶液（0.5%～5%）中4 h后，用PBS溶液洗膠體凝膠薄膜3～5次，除去未反應的戊二醛。然后，固定濃度為10 mg/mL的人IgG分子，過夜反應，反應過后用PBS溶液洗滌光子晶體薄膜3～5次，除去未反應的人IgG分子。加入相同濃度（100 μg/mL）的FITC標記的羊抗人IgG，在37℃下反應2 h后，用PBS進行清洗，然后用熒光顯微鏡進行熒光信號的檢測。

圖1　紫外交聯非秘堆積型水凝膠光子晶體膜

1.4非密堆積型膠體晶體薄膜上的生物多元檢測

用丙烯酰胺濃縮液與SiO2納米微球制備的光子晶體薄膜，利用機械加工的方式將他們加工成規(guī)則的光子晶體薄膜，通過在水凝膠上結合抗體，將標記有熒光的抗原雜交在抗體上。當抗原結合到抗體上時，我們利用膠體晶體膜的反射光譜來編碼抗原分子的種類，利用目標分子的熒光來鑒定目標分子的有無。因此我們可以利用水凝膠光子晶體膜來實現多元生物檢測。

2　結果和討論

2.1非密堆積型膠體晶體薄膜的制備

二氧化硅膠體顆粒表面帶有負電荷，顆粒間的靜電排斥作用使其在溶液中能夠保持穩(wěn)定而不聚集。膠體顆粒通過靜電排斥作用自組裝形成非緊密堆積型光子晶體。膠體顆粒表面有效電荷、膠體的濃度以及膠體溶液的離子強度是影響顆粒之間靜電排斥作用的重要因素，控制這些參數可以控制膠體顆粒的自組裝過程。圖2所示。膠體顆粒濃度為體積比18.8%時衍射波長為475 nm，隨著濃度的減小，晶面間距增加，衍射峰發(fā)生紅移，濃度減小至12.3%時，衍射峰移至625 nm，體積比繼續(xù)減小，衍射峰移出可見光范圍。

圖3是一張掃描電子顯微鏡圖。從圖中可以看出膠體顆粒呈六角有序排列，說明制備的膠體凝膠薄膜的質量相當高。

2.2非密堆積型膠體晶體薄膜上的生物分子的固定

IgG分子中有很多可供偶聯的官能團，如賴氨酸或末端氨基、天冬氨酸、谷氨酸或末端羧基。由于聚丙烯酰胺和抗體上均有-NH2，而醛基能與氨基發(fā)生化學反應，形成希夫堿，所以選擇用戊二醛來固定抗體。

圖2　二氧化硅非緊密堆積型光子晶體反射光譜

圖3　非秘堆積型水凝膠光子晶體膜掃描電子顯微鏡圖

為了方便進行生物檢測試驗，將膠體晶體凝膠薄膜切割成邊長為1 cm，厚度為0.125 mm的正方形小塊。取已知制備好的膠體凝膠薄膜，分別放入不同濃度的戊二醛的PB溶液（0.5%～5%）中4 h后，用PBS溶液洗膠體凝膠薄膜3～5次，除去未反應的戊二醛。然后，固定相同濃度（10 mg/mL）的人IgG分子，過夜反應，反應過后用PBS溶液洗滌光子晶體薄膜3～5次，除去未反應的人IgG分子。加入相同濃度（100 μg/mL）的FITC標記的羊抗人IgG，在37℃下反應2 h后，用PBS進行清洗，然后用熒光顯微鏡進行熒光信號的檢測。結果如圖4所示。

通過實驗結果可以得到，當戊二醛濃度超過4.5%時，膠體晶體凝膠薄膜的熒光信號達到穩(wěn)定，這說明對于邊長為1 cm厚度為0.125 mm的膠體凝膠薄膜而言，在大于4.5%的戊二醛濃度下所進行的化學反應是在飽和狀態(tài)下進行的，凝膠薄膜上的酰胺基和戊二醛的醛基進行了完全的反應，在醛基飽和的狀態(tài)下進行的生物分子固定才能充分完全。所以，我們選擇4.5%作為固定探針分子的戊二醛溶液濃度。

圖4　不同戊二醛濃度濃度下的熒光信號

2.3非密堆積型膠體晶體薄膜上的生物分子的多元檢測

采用膠體晶體凝膠薄膜為生物分子檢測載體具有很好的優(yōu)越性，這一點在前言部分已經闡述，在這里就不再贅述。在本實驗中，我們采用三種顏色（藍色，綠色，紅色）的邊長為1 cm厚度為0.125 mm的正方形膠體晶體凝膠薄膜進行蛋白分子的多元檢測實驗。取三種顏色（藍色，綠色，紅色）的光子晶體凝膠薄膜，分別固定相同濃度（10 mg/mL）的人IgG，兔IgG，小鼠IgG，以固定小鼠IgG的光子晶體凝膠薄膜作為對照組，過夜反應后用PBS進行充分清洗；將其放入相同試管中加入濃度為100 μg/mL的FITC標記的羊抗人IgG與FITC標記的羊抗兔IgG，放入37℃下反應2 h。取出薄膜，用PBS清洗。反應過后的膠體晶體凝膠薄膜放在倒置熒光顯微鏡下進行拍照，結果如圖5所示。

圖5　以膠體晶體膜為載體進行多元生物監(jiān)測的熒光顯微鏡圖像

由于一抗蛋白分子只能夠與其相應的二抗蛋白分子進行特異性結合，而不與其他種類的蛋白分子進行反應，所以我們推測只有固定了人IgG和兔IgG的膠體晶體凝膠薄膜發(fā)生了特異性反應，而對照組薄膜上沒有發(fā)生特異性反應。從圖5中可以看出，結果顯示只有固定了人IgG和兔IgG的膠體晶體凝膠薄膜在激發(fā)后顯示出了FITC的綠色熒光，說明了反應的發(fā)生，而對照組薄膜上幾乎看不到任何綠色熒光。

3　結論

我們利用單分散硅球的自組裝過程中的靜電排斥作用形成非密堆積型的光子晶體聚丙烯酰胺水凝膠膜。膜用作生物大分子的多元檢測載體進行生物檢測具有廣泛的應用前景。

［1］Trau M，Battersby B J.Novel Colloidal Materials for High-Throughput Screening Applications in Drug Discovery and Genomics［J］.Advanced Materials，2001，13（12-13）：975-979.

［2］Lee H J，Wark A W，Corn R M.Enhanced bioaffinity sensing using surface plasmons，surface enzyme reactions，nanoparticles and diffraction gratings［J］.Analyst，2008，133（5）：596-601.

［3］Rich R L，Myszka D G.Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis［J］.Current Opinion in Biotechnology，2000，11（1）：54-61.

［4］Jiang P，Bertone J F，And K S H，et al.Single-Crystal Colloidal Multilayers of Controlled Thickness［J］.Chemistry of Materials，1999，11（8）：2132-2140.

［5］Fulton R J，Mcdade R L，Smith P L，et al.Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix［TM］system.［J］.Clinical Chemistry，1997，43（9）：1749-56.

［6］Cunin F，Schmedake T A，Link J R，et al.Biomolecular screening with encoded porous-silicon photonic crystals［J］.Nature Materials，2002，1（1）：39-41.

（編輯：晏兵兵）

O657.1

B

1006-799X（2016）17-0089-03

臨沂大學博士啟動基金（LYDX2013BS032）資助項目

劉兆斌（1978-），男，山東臨沂人，講師，主要從事生化分析的研究工作。