令世鑫，馬桂蘭，徐水林，王家敏，馬忠仁，喬自林*

（1.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州　730030；

2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州　730010）

灘羊種質(zhì)資源細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建及細(xì)胞的生物學(xué)鑒定

令世鑫1，馬桂蘭2，徐水林2，王家敏1，馬忠仁1，喬自林1*

（1.甘肅省動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730030；

2.蘭州民海生物工程有限公司，甘肅蘭州730010）

目的：通過(guò)對(duì)灘羊體細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和保存，在細(xì)胞水平上保存其種質(zhì)資源。方法：用胰蛋白酶消化分離培養(yǎng)腎和睪丸組織的原代細(xì)胞，用組織塊法培養(yǎng)耳緣組織的原代細(xì)胞，經(jīng)傳代擴(kuò)大培養(yǎng)后在液氮中保存。細(xì)胞復(fù)蘇后進(jìn)行了活力、形態(tài)、生長(zhǎng)特性和微生物污染的檢查。結(jié)果：灘羊腎、睪丸和耳緣組織的原代細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞凍存后復(fù)蘇檢查的細(xì)胞活力在91.12%～97.74%，細(xì)胞形態(tài)和長(zhǎng)勢(shì)良好，生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈近“S”型曲線(xiàn)，最大增殖濃度為在2.12～3.19×105/ml，倍增時(shí)間在24.62～28.1 h，細(xì)菌、真菌、支原體和病毒檢查為陰性。結(jié)論：灘羊的種質(zhì)資源細(xì)胞庫(kù)成功構(gòu)建，使這一物種的種質(zhì)資源在細(xì)胞水平上得到保存。

灘羊；種質(zhì)資源；細(xì)胞庫(kù)；鑒定

灘羊?qū)倜晒叛?，是我?guó)獨(dú)特的裘皮羊品種，以“二毛皮，九道灣”馳名中外，主要產(chǎn)于寧夏賀蘭山東麓的銀川市及甘肅環(huán)縣、靖遠(yuǎn)、景泰、白銀、皋蘭等附近各縣。灘羊長(zhǎng)期在西北荒漠或半荒漠地區(qū)放牧形成的耐干旱、耐鹽堿、耐粗飼、強(qiáng)抗病性及強(qiáng)抗逆性等特征，且具有優(yōu)良的遺傳穩(wěn)定性，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)品種。自從國(guó)家實(shí)行封山禁牧政策以來(lái)，灘羊由完全的放牧模式轉(zhuǎn)變?yōu)槿ρ?，使其生存條件發(fā)生改變，加之沒(méi)有系統(tǒng)開(kāi)展科學(xué)的繁育飼養(yǎng)模式，品種退化現(xiàn)象較嚴(yán)重［1］。在實(shí)施國(guó)家自然科技資源共享平臺(tái)項(xiàng)目《畜禽種質(zhì)資源收集、整理與保存》以來(lái)，先后有幾百個(gè)品種的家養(yǎng)和野生畜禽的種質(zhì)資源在細(xì)胞或基因水平上得到了長(zhǎng)期保存。通過(guò)對(duì)灘羊體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、保存和鑒定，在細(xì)胞水平長(zhǎng)期保存了該優(yōu)良地方品種遺傳資源同時(shí)，也為該品種基因組文庫(kù)構(gòu)建和遺傳多樣性研究提供生物學(xué)材料。

1　材料

灘羊腎、睪丸和耳緣組織采自甘肅靖遠(yuǎn)某屠宰場(chǎng)，DMEM與胰蛋白酶（Gibco）、胎牛血清（蘭州民海生物，添加比例為10%）、DMSO（ThermoFisher）、無(wú)菌和支原體檢查培養(yǎng)基（北京三藥）、Hoechst33258（Sigma）、病毒檢查用Vero細(xì)胞和牛腎原代細(xì)胞（本室保存）、雞和豚鼠紅細(xì)胞等。

主要儀器設(shè)備有CO2培養(yǎng)箱（Thermo，3111型）、倒置相差顯微鏡（Olympus，CK40-32PH型）、熒光倒置相差顯微鏡（Olympus，IX71型）、液氮罐（樂(lè)山東亞）等。

2　方法

2.1樣品采集及處理

選擇精神狀態(tài)良好、膘肥體健的30～50日齡灘羊羔羊經(jīng)頸動(dòng)脈放血處死，在剝皮之前，用手確定兩個(gè)睪丸都在陰囊中時(shí)，用線(xiàn)繩扎緊陰囊，使從結(jié)扎1 cm處剪取時(shí)睪丸在陰囊中并保持無(wú)菌，切口用碘伏反復(fù)消毒后放進(jìn)消毒好的樣品袋中并標(biāo)記。剖腹后連同包裹的脂肪一起摘取腎臟，且保留2 cm以上的血管和輸尿管，在干凈的開(kāi)口容器內(nèi)放置待脂肪固化后裝入自封袋，標(biāo)記性別。割下整個(gè)耳朵，裝入自封袋，標(biāo)記性別。所有組織裝入事先放有冰塊的樣品箱，宰后6 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。共采集了20個(gè)個(gè)體的腎和耳朵，公母各半，10個(gè)個(gè)體的睪丸。

2.2原代培養(yǎng)

按文獻(xiàn)方法采用胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)腎和睪丸組織細(xì)胞［2］，用組織塊法培養(yǎng)耳緣組織細(xì)胞［3］。

2.3傳代培養(yǎng)和凍存

生長(zhǎng)致密的單層原代細(xì)胞用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，其中腎和睪丸組織細(xì)胞以1∶3比例分種，耳緣細(xì)胞第一次傳代按1∶2比例，其后按1∶3比例分種培養(yǎng)。待細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至總量達(dá)2×107以上時(shí)采用常規(guī)方法在液氮中保存（-196℃），用凍存保護(hù)液（10%DMSO+20%胎牛血清+70%DEMEM）調(diào)整細(xì)胞密度至2× 106～3.0×106/ml。

2.4細(xì)胞復(fù)蘇及活力檢查

從液氮中取出細(xì)胞凍存管，在39℃左右的水浴中快速解凍，用培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后800 r/min，10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液重新懸浮后以2.0×105/ml左右接種培養(yǎng)，并用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢查細(xì)胞活力。

2.5生長(zhǎng)曲線(xiàn)

將復(fù)蘇培養(yǎng)的細(xì)胞傳代一次培養(yǎng)到單層用胰蛋白酶消化，用培養(yǎng)液調(diào)整濃度至1.0×104/ml，接種到24孔培養(yǎng)板，每孔1 ml，置37℃5%CO2，每隔24 h取3孔細(xì)胞進(jìn)行消化計(jì)數(shù)求平均值，直至細(xì)胞密度降低為止，用培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)并求得最大增殖濃度和倍增時(shí)間。

2.6細(xì)菌、真菌和支原體污染檢查

按文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行［4］。

2.7病毒檢測(cè)

運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)法對(duì)復(fù)蘇培養(yǎng)一代的細(xì)胞檢查非血吸附病毒和血吸附病毒［5］。

3　結(jié)果

3.1原代培養(yǎng)

灘羊腎組織消化培養(yǎng)的原代細(xì)胞從第3天起可見(jiàn)大部分培養(yǎng)瓶中有較多的細(xì)胞貼壁分裂生長(zhǎng)，第4天在培養(yǎng)瓶生長(zhǎng)面70%以上長(zhǎng)滿(mǎn)了細(xì)胞，多為長(zhǎng)梭形和多角形型細(xì)胞，第6天細(xì)胞成較致密單層，以長(zhǎng)梭形為主（如圖1A和1B）。

圖1　灘羊腎細(xì)胞（A原代4d，10XB原代6d，20XC傳代第1代72h，10XD復(fù)蘇第1代72h，20X）

灘羊睪丸組織消化培養(yǎng)的原代細(xì)胞生長(zhǎng)比腎組織的原代細(xì)胞要快，培養(yǎng)2 d時(shí)可見(jiàn)有細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，第4天生長(zhǎng)面90%以上長(zhǎng)滿(mǎn)了細(xì)胞，細(xì)胞以長(zhǎng)梭形和多

角形細(xì)胞為主（如圖2A和2B）。

圖2　灘羊睪丸細(xì)胞（A原代2d，20XB原代4d，20XC傳代第1代48h，10XD復(fù)蘇第1代48h，20X）

灘羊耳緣組織塊法培養(yǎng)時(shí)第5天有部分組織塊附近有大量細(xì)胞長(zhǎng)出，第7天時(shí)有明顯致密的單層細(xì)胞，細(xì)胞均呈長(zhǎng)梭形，形態(tài)整齊均勻（如圖3A和3B）。

圖3　灘羊耳緣細(xì)胞（A原代5d，10XB原代7d，10XC傳代第1代48h，20XD復(fù)蘇第1代48h，20X）

3.2傳代培養(yǎng)和凍存

灘羊腎組織原代細(xì)胞按1∶3傳代后72 h可形成致密的單層細(xì)胞，視野內(nèi)可見(jiàn)成片的上皮型細(xì)胞區(qū)（如圖1C）；睪丸組織細(xì)胞按1∶3傳代后48 h可形成單層細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則整齊，有似“水流樣”和“漩渦狀”走向（如圖2C）；耳緣組織細(xì)胞首次按1∶2傳代后48 h也能形成單層，以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主，細(xì)胞間隙比腎細(xì)胞和睪丸細(xì)胞大，其后按1∶3傳代生長(zhǎng)速度變快，48 h形成單層細(xì)胞（如圖3C）。

3.3復(fù)蘇和活力檢查

灘羊腎、睪丸和耳緣組織細(xì)胞的平均復(fù)蘇活力為94.48%、91.12%和97.74%。復(fù)蘇后腎細(xì)胞在72h形成致密單層（如圖1D）；睪丸和耳緣組織細(xì)胞48h形成單層（如圖2D和3D），細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)均良好，可連續(xù)培養(yǎng)5代以上。

3.4生長(zhǎng)曲線(xiàn)

圖4　灘羊體細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖

三種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線(xiàn)均呈“S”型（如圖4），腎、睪丸和耳緣細(xì)胞的最大增值濃度為2.82×105/ml、2.12×105/ml和3.19×105/ml，倍增時(shí)間為25.53h、28.1h和24.62h。

3.5細(xì)菌、真菌和支原體檢查

培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基檢查細(xì)菌和真菌，培養(yǎng)7 d均沒(méi)有菌生長(zhǎng)；在支原體液體基中培養(yǎng)14 d顏色沒(méi)有變化，在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d也沒(méi)有菌落生長(zhǎng)；細(xì)胞凍融處理的上清液接種Vero細(xì)胞上用Hoechst 33258染色后只觀察到細(xì)胞核有藍(lán)色熒光，其它部位沒(méi)有熒光。3.6病毒檢測(cè)

在原代與傳代培養(yǎng)過(guò)程中，利用倒置相差顯微鏡觀察未見(jiàn)病毒引起的細(xì)胞病變；將細(xì)胞培養(yǎng)物分別接種到Vero和牛腎原代細(xì)胞培養(yǎng)21 d，看不到細(xì)胞病變現(xiàn)象；雞和豚鼠紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)為陰性。

4　結(jié)論

畜禽種質(zhì)資源是大自然留給人類(lèi)的寶貴財(cái)富，是保障人類(lèi)良好生存環(huán)境和衣食住行必不可少的物質(zhì)，是關(guān)系到一個(gè)國(guó)家和民族競(jìng)爭(zhēng)力的重要戰(zhàn)略物資，收集和研究各種畜禽種質(zhì)資源，建設(shè)各類(lèi)國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)，建立功能基因開(kāi)發(fā)和利用的國(guó)家基礎(chǔ)條件共享平臺(tái)具有重要的社會(huì)價(jià)值。灘羊?yàn)閲?guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，是2001年被農(nóng)業(yè)部列入第一批畜禽品種保護(hù)名錄，其品質(zhì)退化嚴(yán)重已是不爭(zhēng)的事實(shí)。通過(guò)種質(zhì)資源細(xì)胞庫(kù)的構(gòu)建使這一重要的種質(zhì)遺傳資源在細(xì)胞水平上得以保存下來(lái)，也為相關(guān)遺傳學(xué)研究提供了有效的理論依據(jù)和理想的生物材料。

［1］郭天芬，高雅琴，劉慶霞，等.灘羊產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀分析及發(fā)展建議［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2007，（05）：10-11.

［2］令世鑫，徐水林，馬偉等.蘭州黑白花奶牛腎組織細(xì)胞系的建立［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2016，46（5）：68-69，72.

［3］喬自林，馮玉萍，李明生，等.蘭州大尾羊耳緣組織成纖維細(xì)胞系的建立［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)2012，（10），64-68.

［4］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典三部2010年版［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)人民共和國(guó)藥典三部2010年版［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

（編輯：高真貞）

Q954.6-3

B

1006-799X（2016）15-0092-02

國(guó)家科技基礎(chǔ)條件平臺(tái)-家養(yǎng)動(dòng)物平臺(tái)，西北民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（zyp2015）

令世鑫（1966-），男，甘肅通渭人，工程師，主要從事家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源保護(hù)利用工作。

喬自林（1976-），男，甘肅永靖人，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。