楊海山

（湛江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東　湛江　524037）

鴨肝炎病毒的分離與檢測(cè)

楊海山

（湛江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東湛江524037）

在某養(yǎng)鴨場(chǎng)的雛鴨群當(dāng)中出現(xiàn)了傳染性疾病，其主要的臨床特征表現(xiàn)為肝臟出血以及角弓反張，初步判斷為鴨肝炎病毒感染癥狀。針對(duì)送行檢測(cè)的病料采用無(wú)鴨肝炎病毒母源抗體的鴨胚實(shí)行病毒分離及檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，接種病料的鴨胚均致死，且死亡鴨胚均出現(xiàn)了水腫、全身性出血等癥狀；采取解剖檢驗(yàn)?zāi)軌蛎黠@的觀察到鴨內(nèi)臟有明顯的充血情況。在所采取的PCR擴(kuò)增檢測(cè)中得到了和預(yù)期大小相一致的440bp目的片段?；驕y(cè)序的結(jié)果表明擴(kuò)增出的基因部分和鴨肝炎病毒的同源性達(dá)到了98.5%，據(jù)此表明這一鴨群確認(rèn)感染了鴨肝炎病毒。

鴨肝炎病毒；分離；檢測(cè)；PCR

鴨肝炎病毒具有十分迅速的傳播速度，能夠在短時(shí)間之內(nèi)便致使雛鴨死亡，是一種常見(jiàn)于雛鴨群的惡性傳染病毒［1］。這一傳染病毒現(xiàn)已成為了威脅養(yǎng)鴨行業(yè)的主要疾病之一。在目前的鴨肝炎病毒類型當(dāng)中，主要包括I型、II型、III型三種類型，其中尤其是以I型的傳播范圍最廣，傳染性最強(qiáng)。本次研究以某養(yǎng)鴨場(chǎng)雛鴨群為研究對(duì)象，此雛鴨群在發(fā)病初期病鴨主要表現(xiàn)為精神萎靡、食欲降低或抵制進(jìn)食，同時(shí)還存在有部分雛鴨出現(xiàn)了“角弓反張”的情況；對(duì)其進(jìn)行病理性解剖觀察，發(fā)現(xiàn)其肝臟大多已經(jīng)出現(xiàn)出血性壞死，為了更進(jìn)一步予以確診，針對(duì)所有的送檢病料均采用無(wú)母源抗體鴨胚實(shí)施病毒分離，同時(shí)采用PCR方法予以檢測(cè)。

1　材料與方法

1.1檢驗(yàn)材料

1.1.1病料及鴨胚

本次研究所采用病料均為某養(yǎng)鴨場(chǎng)疑似感染鴨肝炎病毒，而致死的7～9日齡雛鴨肝臟。而鴨胚選取某未注射鴨肝炎病毒疫苗的健康母鴨種蛋。

1.1.2毒株

對(duì)于鴨肝炎病毒強(qiáng)毒株采用實(shí)驗(yàn)室分離及檢測(cè)后予以妥善儲(chǔ)存［2］。

1.1.3檢測(cè)試劑

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Mar ker、Agarose Gel、DNA Extraction Kit以及蛋白酶K為寶生物工程有限公司生產(chǎn)，而RNA提取試劑Trizol reagent則由Invitrogen公司所生產(chǎn)；DEPC則由Amresco公司所生產(chǎn)；其余檢測(cè)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純［3］。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1病料處理

將所收集到的疑似出現(xiàn)鴨肝炎病毒的鴨肝臟病灶放入滅菌研磨設(shè)備當(dāng)中，同時(shí)添加5被含有抗生素物質(zhì)PBS液體研成粉末狀，使之呈現(xiàn)出混濁懸浮液之后持續(xù)凍融三次以上，采用8 000 r/min離心設(shè)備進(jìn)行10 min以上的離心處理，在提取到上層離清液之后增加以雙抗，同時(shí)采用密度為0.22 μm濾網(wǎng)膜進(jìn)行細(xì)菌過(guò)濾，將其保存于環(huán)境溫度為-20 ℃的條件下。

1.2.2病毒分離

將處理完成的病料濾除液體依據(jù)0.2 mL/個(gè)的接種數(shù)量進(jìn)行接種，而后將接種完成的鴨胚繼續(xù)放置于37 ℃的環(huán)境之下予以繼續(xù)孵化，而后照胚3次/d，將病死鴨胚放置于3 ℃的冰箱3.5 h左右使其血管發(fā)生收縮反應(yīng)，從而得到尿囊液。

1.2.3PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增過(guò)程依據(jù)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)流程予以操作，將其通過(guò)擴(kuò)增所生成的物質(zhì)借助于濃度比例為1%的瓊脂糖凝膠電泳予以測(cè)定。

1.2.4基因測(cè)序

依據(jù)PCR擴(kuò)增所取得特異性物質(zhì)，對(duì)其予以純化回收而送至相關(guān)的生物公司予以基因測(cè)序，并通過(guò)基因測(cè)序所得到的結(jié)果利用DNA Star軟件予以比對(duì)分析。

2　結(jié)果

2.1病毒分離

在對(duì)鴨胚進(jìn)行鴨肝炎病毒接種之后的95 h之內(nèi)發(fā)生死亡情況，在對(duì)死亡鴨胚進(jìn)行解剖檢驗(yàn)時(shí)可明顯發(fā)現(xiàn)其胚體存在嚴(yán)重的充血及出血情況，且與正常的鴨胚相比還存在明顯的發(fā)育不良情況。詳見(jiàn)下圖1。

圖1　死亡胚體充血和出血（中間為正常胚體）

2.2PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)電泳檢測(cè)結(jié)果表明，采用專門針對(duì)I型鴨肝炎病毒的P1、P2引物由待檢樣品以及標(biāo)準(zhǔn)I型鴨肝炎病毒的核算模板之中均擴(kuò)增出了440bp的特異性條帶狀物質(zhì)，而由正常的鴨胚尿囊液核酸模板之中則未擴(kuò)增出相關(guān)的特異性條帶狀物質(zhì)；采用其他引物也未能夠在待檢樣本當(dāng)中擴(kuò)增出任何的條帶狀物質(zhì)。

2.3基因測(cè)序及分析

在通過(guò)基因測(cè)序所得到的440bp，以及和PCR特異性擴(kuò)增片段大小完全一樣。將之與現(xiàn)已明確的I型鴨肝炎病毒基因開(kāi)展BLAST對(duì)比分析。其分析結(jié)果證實(shí)，此次研究所分離出的病毒主體基因同核苷酸序列以及參考注的同源性達(dá)到了95.2%～98.5%之間，并且與C80株體之間的相似性最為接近，達(dá)到了98.5%。

綜合以上研究結(jié)果證實(shí)，明確了本次研究所檢測(cè)的鴨肝炎病毒為I型鴨肝炎病毒。

3　討論

I型鴨肝炎病毒最初是一種從屬于RNA病毒科的腸病毒屬成員。在之后的研究當(dāng)中發(fā)現(xiàn)鴨肝炎病毒與小RNA病毒科的9項(xiàng)已知屬23類病毒間的衣殼蛋白與保守的2C及3D蛋白氨基酸序列間的同源性均低于40%，因此其從屬于小RNA病毒科當(dāng)中的一項(xiàng)新屬內(nèi)容，因此國(guó)際病毒分類委員會(huì)便將小RNA病毒命名為禽肝病毒屬。此種類型病毒的大小一般為30 nm左右，沒(méi)有囊膜，同時(shí)相應(yīng)的基因組共被劃分為單分子線狀正鏈RNA，其中包含有VP1、VP2以及VP3三類完全不同的蛋白結(jié)構(gòu)［4］。在此當(dāng)中VP1存在有多項(xiàng)免疫輔助優(yōu)勢(shì)特性，其中T細(xì)胞的抗原位點(diǎn)和抗原的決定簇所共同構(gòu)成了T、B淋巴細(xì)胞抗原為，并進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，同時(shí)其同病毒基因型以及血清型之間存在有密切的相關(guān)性。因而，VP1較常會(huì)被應(yīng)用于病毒遺傳變異分子的主要參考依據(jù)。鴨肝炎病毒對(duì)于乙醚、胰蛋白酶以及一些常用的消毒劑具備有一定的耐藥性，其能夠在酸性值為3.0的環(huán)境下正常生存，并且結(jié)尾穩(wěn)定。I型鴨肝炎病毒無(wú)法凝集任何動(dòng)物或是人體的紅細(xì)胞，但是其會(huì)在鴨、雞、鵝等幼體胚胎的絨毛尿囊腔當(dāng)中產(chǎn)生繁殖。鴨肝炎病毒是目前對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)造成最大威脅的傳染病癥。因?yàn)檫@一病癥所主要傳染致死的主要是幼齡雛鴨，并且其傳播速度十分迅速，具有高病發(fā)率、高致死率的顯著特點(diǎn)，對(duì)于廣大的養(yǎng)殖戶而言由此所導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失十分巨大。通常而言，依據(jù)流行病學(xué)、臨床特征以及相關(guān)的解剖檢驗(yàn)特征，可針對(duì)雛鴨所感染的傳染病癥作出初步的判斷。然而，近些年來(lái)在我國(guó)主要的鴨養(yǎng)殖地區(qū)已經(jīng)出現(xiàn)了不少的新型鴨肝炎病毒時(shí)間，同時(shí)新型的鴨肝炎病毒癥狀亦可引起相似的臨床表征及病理性改變。對(duì)此，就實(shí)施以相關(guān)的病毒性鴨肝炎研究工作便具有極其重要的作用與價(jià)值。

當(dāng)前臨床上應(yīng)用在I型鴨肝炎病毒的抗原檢測(cè)方法較為多樣，例如較為常用的例如病毒中和試驗(yàn)、免疫電鏡檢查、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。在此之中應(yīng)用最為普遍也是最為簡(jiǎn)便的即為中和試驗(yàn)，正是基于在鴨肝炎病毒檢驗(yàn)工作當(dāng)中的簡(jiǎn)便性，促使其被經(jīng)常性的應(yīng)用在了雛鴨病毒型肝炎以及相關(guān)的血清檢驗(yàn)當(dāng)中，然而這一方法同時(shí)也存在有明顯的缺陷與不足，即為在對(duì)病原體進(jìn)行分離之時(shí)需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的離心分離，時(shí)間耗費(fèi)較長(zhǎng)，因而難以應(yīng)用在大批量次的樣品測(cè)定工作當(dāng)中，同時(shí)再加之對(duì)于無(wú)母源抗體鴨胚應(yīng)用也存在有一定的困難性，因而這一檢測(cè)方式無(wú)法難以滿足于臨床上的快速診治需求。

本次試驗(yàn)所選用的PCR擴(kuò)增方法成功擴(kuò)增出了和預(yù)期大小相等的440bp目的片段，借助于對(duì)擴(kuò)增片段所開(kāi)展的測(cè)序工作以及相應(yīng)的BLAST分析工作，明確了該養(yǎng)鴨場(chǎng)所送檢的病料為I型鴨肝炎病毒感染，因而采用PCR測(cè)定方法進(jìn)行雛鴨肝炎病毒的檢測(cè)工作是一種較為快速、有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。PCR診斷方法的運(yùn)用對(duì)于鴨肝炎病毒發(fā)病區(qū)域的診治工作具有十分明顯的指導(dǎo)意義，能夠?yàn)殚_(kāi)展積極有效的防治措施提供以必要的參考依據(jù)，并將廣大養(yǎng)鴨戶的經(jīng)濟(jì)損失降低最低，具有十分明顯的現(xiàn)實(shí)意義。

［1］蘇敬良，黃瑜，賀榮蓮，等.新型鴨肝炎病毒的分離及初步鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2014，（32）：15-16.

［2］劉偉，崔國(guó)杰，陳少鶯，等.新型鴨呼腸孤病毒和鴨肝炎病毒混合感染的診斷及病原分離［J］.畜牧與獸醫(yī)，2014，（46）：92-95.

［3］王永娟，李碧春，沈明君，等.抗Ⅰ型鴨肝炎病毒RdRp蛋白噬菌體單鏈抗體庫(kù)構(gòu)建及單鏈抗體的淘選［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，（37）：334-338.

［4］董井泉，張蕾，馬波，等.Ⅰ型鴨肝炎病毒VP1蛋白優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)的鑒定及抗體檢測(cè)ELISA方法的建立［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，（36）：542-546.

（編輯：尹 云）

S852.65

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1006-799X（2016）14-0091-02

楊海山（1973-），男，廣東湛江人，助理獸醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楂F醫(yī)治療。