曾俊芬，王新桂，魯建武，宋金春

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢　430060；2.湖北省中醫(yī)院藥事部，湖北 武漢　430061)

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桂枝湯方劑不同提取部位免疫抑制活性的考察

曾俊芬1，王新桂2，魯建武1，宋金春1

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430060；2.湖北省中醫(yī)院藥事部，湖北 武漢430061)

目的篩選桂枝湯方劑免疫抑制活性部位。方法處方藥材分別水煎濃縮為水提部位，乙醇提取為乙醇提取部位。同時(shí)將乙醇部位分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部和正丁醇部位。CCK-8法考察桂枝湯不同提取物對(duì)ConA激活T細(xì)胞和LPS激活B細(xì)胞增殖的抑制作用。同時(shí)用二硝基氯苯對(duì)昆明種小鼠皮膚致敏和誘發(fā)，制成遲發(fā)型超敏反應(yīng)模型，觀察桂枝湯方劑不同部位對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)的干預(yù)作用。結(jié)果桂枝湯方劑水提物、乙醇提取物、石油醚萃取部位有顯著免疫抑制功效，乙醇和石油醚提取物效果最佳。濃度200 mg·L-1時(shí)T細(xì)胞增殖抑制率分別為48.3%、45.9%，B細(xì)胞抑制率大于30%。乙醇提取物、石油醚萃取部位對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠耳廓腫脹有顯著抑制作用，對(duì)胸腺和脾臟無(wú)明顯影響。結(jié)論桂枝湯方劑乙醇提取物和石油醚萃取物為免疫抑制活性部位，能顯著抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖，抑制小鼠耳廓腫脹，對(duì)正常細(xì)胞、胸腺、脾臟無(wú)毒性。

桂枝湯/分析;化學(xué)分餾法;超敏反應(yīng),遲發(fā)型;催化域

桂枝湯來(lái)源于《傷寒論》，該方由桂枝、生姜、甘草、白芍、大棗組成，有解肌發(fā)表，調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的功效。臨床上常將桂枝湯用來(lái)抗過(guò)敏反應(yīng)和抑制炎癥，以及治療風(fēng)濕等疾病[1]。過(guò)敏反應(yīng)、風(fēng)濕等屬于自身免疫性疾病，有研究表明桂枝湯可通過(guò)免疫抑制和抗炎作用達(dá)到抗過(guò)敏治療風(fēng)濕的作用[2-4]，但并未有其活性部位的研究報(bào)道。免疫抑制作用被廣泛應(yīng)用于控制一些異常的免疫應(yīng)答反應(yīng)，中藥來(lái)源的免疫抑制劑有作用廣、毒性小、藥價(jià)低等特點(diǎn)，開(kāi)發(fā)與研究中藥的免疫抑制作用，具有廣闊前景。本文以免疫抑制作用為考察指標(biāo)對(duì)桂枝湯不同部位的免疫抑制活性進(jìn)行了探討。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠，體重18～20 g，4～6周齡，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(鄂) 2014-0013。清潔級(jí)雄性昆明小鼠，體重(20±2)g，購(gòu)自武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0007。

飼養(yǎng)溫度(22±1) ℃，濕度(55±5)%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動(dòng)物自由攝取，所有實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.2藥物及試劑桂枝(批號(hào)20141103)、生姜(批號(hào)20150201)、甘草(批號(hào)20141005)、白芍(批號(hào)20141010)、大棗(批號(hào)20150304)均購(gòu)于湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司；RPMI Medium 1640 培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào)：11875093)；二甲基亞砜(DMSO，上海國(guó)藥)；小牛血清(Logan)；刀豆蛋白A(Con A，Sigma，批號(hào)：C5275)；LPS(Sigma，批號(hào)：L2630)；CCK-8(碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：C0038)。2,4-二硝基氯苯(DNCB)(上海化學(xué)試劑公司，批號(hào)：20140317)，地塞米松磷酸鈉注射用粉針(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：140208)。

1.3儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱：德國(guó)Heraeus公司；SW-C型超凈工作臺(tái)：上海錦屏儀器儀表有限公司；SPECTRAMAX Plus型酶標(biāo)儀：美國(guó)Molecular Devices；TL-18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：上海市離心機(jī)械研究所；BL150S電子天平：德國(guó)Sartorius；直徑8 mm的金屬打孔器。

2　方法

2.1藥品制備按桂枝湯處方配齊藥物(桂枝10 g、芍藥 10 g 、生姜 10 g 、甘草 7 g 、大棗 10 g)47 g，水煎2次合并藥液，過(guò)濾濃縮為水提部位8.5 g(浸膏得率18.1%)備用。另按方將藥物粉碎(235 g)，95%乙醇室溫提取3次，每次一周，提取液減壓濃縮后得乙醇提取部位39 g(得率16.6%)，取適量乙醇提取部位備用。其余乙醇提取部位用熱水混懸，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、 正丁醇溶液萃取并減壓濃縮各萃取液，分別得石油醚部位6.1 g干浸膏、氯仿部位3.8 g干浸膏、乙酸乙酯部6.7 g干浸膏和正丁醇部位7.6 g干浸膏。

2.2小鼠脾淋巴細(xì)胞懸液的制備BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死后摘取脾臟，PBS清洗后放至Mesh網(wǎng)上研磨，1500 rpm離心15 min，棄上清加入紅細(xì)胞裂解液3 mL，混勻并避光5 min，再加入7 mL PBS終止裂解液，1 800 r·min-1，離心10 min，棄上清，加入含小牛血清的RPMI-1640 3 mL混勻，吸取10 μL混懸液，加入90 μL臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞活率達(dá)95%以上，制成密度為5×109個(gè)·L-1的脾淋巴細(xì)胞。

2.3CCK-8法檢測(cè)化合物對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響[5]實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組(100 1500 rpmμL細(xì)胞懸液+100 μL RPMI-1640)，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)組(100 μL細(xì)胞懸液+50 μL化合物+50 μL RPMI-1640)，ConA對(duì)照組(100 μL細(xì)胞懸液+50 μL ConA+50 μL RPMI-1640)，LPS對(duì)照組(100 μL細(xì)胞懸液+50 μL LPS+50 μL RPMI-1640)，T細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(100 μL細(xì)胞懸液+50 μL ConA+50 μL萃取物)，B細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組(100 μL細(xì)胞懸液+50 μL LPS+50 μL萃取物)。實(shí)驗(yàn)組各部位取適量干浸膏，DMSO溶解后再RPMI-1640稀釋至所需濃度。

小鼠脾臟淋巴細(xì)胞懸液2.5×106/孔接種于96孔板，加入ConA(終濃度5 mg·L-1)，加入LPS(終濃度10 mg·L-1)，同時(shí)加入不同部位提取物(濃度分別為10、50、200 mg·L-1)，并設(shè)相應(yīng)的無(wú)ConA、LPS對(duì)照孔以及無(wú)藥物對(duì)照孔(建立ConA激活的T細(xì)胞增殖模型和LPS激活的B細(xì)胞增殖模型)，每組濃度設(shè)3個(gè)孔。放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，結(jié)束培養(yǎng)前8～10 h加入CCK-8溶液。至培養(yǎng)結(jié)束，于酶標(biāo)儀450 nmol·L-1(參比650 nmol·L-1)處測(cè)定OD值。分別計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞增殖抑制率，當(dāng)抑制率大于10%即可考慮有免疫抑制活性的趨勢(shì)。通過(guò)檢測(cè)T細(xì)胞和B細(xì)胞的變化，反映受試藥物對(duì)免疫調(diào)節(jié)的影響，從而說(shuō)明桂枝湯不同部位的免疫抑制作用，結(jié)果見(jiàn)表1。

細(xì)胞存活率=(試驗(yàn)組OD平均值 / 空白對(duì)照組OD平均值)×100%

抑制率=[(試驗(yàn)組OD平均值-對(duì)照組OD平均值) /對(duì)照組OD平均值] ×100%

2.4遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠模型[6]將小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，分別為模型組、水提組、乙醇提組、石油醚萃取組、氯仿萃取組，乙酸乙酯萃取組、正丁醇萃取組、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松)。各組小鼠每天給藥一次，連續(xù)給藥7 d。實(shí)驗(yàn)第1天將各組小鼠腹部刮毛面積約2 cm×2 cm，第2天和第3天于刮毛部位涂5%二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液。第7天用1%DNCB丙酮溶液涂布于左耳進(jìn)行攻擊，右耳涂布丙酮溶液作為對(duì)照。攻擊24 h后(即第8天)于給藥后1 h，小鼠處死，用打孔器在左右耳同一位置打下兩只耳片，并取出胸腺及脾臟，稱重，計(jì)算腫脹度，胸腺和脾臟指數(shù)。

表1　桂枝湯方劑不同部位對(duì)T細(xì)胞和B細(xì)胞增殖的抑制率

注：與對(duì)照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

3　結(jié)果

3.1桂枝湯方劑對(duì)免疫細(xì)胞增殖的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，所有部位在高濃度時(shí)對(duì)ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖均有一定的免疫抑制功效。除氯仿和乙酸乙酯萃取物，其它部位對(duì)LPS誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖也有不同的抑制作用。水提物、乙醇提物、石油醚萃取部位高濃度時(shí)均能顯著抑制T細(xì)胞增殖，尤其乙醇提取物和石油醚萃取物在50和200 mg·L-1時(shí)抑制效果相當(dāng)，對(duì)T細(xì)胞抑制率分別大于30%和45%(P<0.05；P<0.01)，在200 mg·L-1時(shí)對(duì)B細(xì)胞抑制率大于30%(P<0.05)，同時(shí)結(jié)果還顯示所有部位對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響。

3.2對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠的作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明桂枝湯方劑的乙醇提物、石油醚萃取物能減輕小鼠耳廓的腫脹程度，與模型組相比這兩組耳廓腫脹度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明對(duì)小鼠的變應(yīng)性接觸性皮炎有明顯的改善作用。而桂枝湯方劑各組對(duì)免疫器官胸腺和脾臟無(wú)顯著抑制作用(表2)。

表2　桂枝湯方劑對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)小鼠的影響

注：與模型組比較，aP<0.05,bP<0.01。

4　討論

脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，是成熟的T、B 細(xì)胞存在和參與免疫應(yīng)答的重要場(chǎng)所。脾內(nèi)淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞占約40%，B細(xì)胞占約55%，因此體外培養(yǎng)小鼠原代脾淋巴細(xì)胞被認(rèn)為是研究淋巴細(xì)胞比較合適的方法。ConA和脂多糖(LPS)作用于脾細(xì)胞，可分別刺激T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖，是用來(lái)檢測(cè)兩種細(xì)胞功能的常規(guī)方法。CCK-8法靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好，且對(duì)細(xì)胞毒性低，已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。本課題中運(yùn)用CCK-8法對(duì)植物提取物進(jìn)行活性篩選，能快速檢測(cè)試藥對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞活性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物高濃度時(shí)(200 mg·L-1)也有一定抑制作用，但低劑量時(shí)對(duì)B細(xì)胞增殖幾乎無(wú)影響。水提物、乙醇提物、石油醚萃取部位ConA誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖和LPS誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖均有顯著抑制作用，且乙醇和石油醚的活性優(yōu)于水提物。

2,4-二硝基氯苯誘導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)是一種皮膚接觸小分子半抗原所引起的接觸性超敏反應(yīng)，是T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究采用這種典型的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的動(dòng)物模型，以期追蹤其該作用的活性部位。結(jié)果顯示桂枝湯方劑的乙醇提物、石油醚萃取物對(duì)遲發(fā)型超敏反應(yīng)引起的小鼠變應(yīng)性接觸性皮炎有明顯的改善作用，提示桂枝湯方劑抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的免疫抑制作用部分為乙醇提物和石油醚萃取部分。

水提物是桂枝湯處方各藥材經(jīng)過(guò)高溫煎煮得到，藥材在煎煮過(guò)程中高溫對(duì)各藥材中的成分產(chǎn)生影響，其有效成分會(huì)隨高溫減少發(fā)生化學(xué)變化，影響藥效。乙醇提取物是在室溫條件下提取，溫度未對(duì)各藥材成分產(chǎn)生影響，且三次提取能較完全將藥材中有效成分提取，因而其藥效得以充分發(fā)揮。本試驗(yàn)中乙醇提取部位用極性由低到高的不同溶劑萃取，得到不同極性的部位，易使極性相同的活性成分富集而使不同部位產(chǎn)生不同活性。桂枝湯方劑中主要藥材為桂枝、生姜、甘草、白芍等，桂枝主要成分為桂皮醛、桂皮酸、醋酸苯丙酯、醋酸桂皮脂、肉桂醇、香豆素等揮發(fā)油[7]，研究發(fā)現(xiàn)桂枝揮發(fā)油有免疫抑制功能[8-9]；生姜中含有有α-姜烯、反-β-金合歡烯、α-金合歡烯、β-紅沒(méi)芍烯等揮發(fā)油，有抗炎作用，且能抑制T細(xì)胞增殖的免疫抑制作用[10]，同時(shí)桂枝湯方劑中的甘草含有甘草素、甘草查耳酮A和甘草酸具有抗炎抗變態(tài)的作用[11]，白芍中主要成分為白芍苷，其具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[12]。石油醚極性較低，萃取桂枝湯乙醇提取部位時(shí)易將其中低極性的揮發(fā)油成分富集在石油醚部位，石油醚萃取部位可能因富含揮發(fā)油而免疫抑制活性優(yōu)于其他萃取部位。

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Screening for immunosuppressive function on different fraction of Guizhi Decoction

ZENG Junfen1,WANG Xingui2,LU Jianwu1,et al

(1.DepartmentofPharmacy,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China;2.DepartmentofPharmacy,HubeiProvincialHospitalofTCM,Wuhan430061,China)

ObjectiveTo screen the immunosuppressive fraction of Guizhi decoction.MethodsMedicinal materials of Guizhi decoction was extracted by water and ethanol to get water extraction and ethanol extraction.Ethanol extraction was extracted with petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol to get petroleum ether fraction,chloroform fraction,ethyl acetate fraction,and n-butanol fraction respectively.CCK-8 method was used to detect the activity of different extracts on lymphocytes in the spleen of mice.ConA and LPS were added to the spleen cells of BALB/c mice to activate T cells and B cells respectively.Different extracts of Guizhi decoction were added to the activated spleen cells to investigate the immunosuppressive effect.The model of delayed-type hypersensitivity was established by sensitizing the skin of Kunming mice with DNCB.Effects of different fractions of Guizhi decoction were observed on delayed-type hypersensitivity mice.ResultsWater extraction,ethanol extraction and petroleum ether fraction had significant immunosuppression.Ethanol extraction and petroleum ether fraction showed the greatest activities with inhibitory rates of T cells 48.3% and 45.9%,and B cells inhibitory rate was more than 30% at the concentration of 200 mg·L-1.Ethanol extraction and petroleum ether fraction could alleviate obviously the degree of swollen-auricle of mice and without significant influence on spleen and thymus.ConclusionsThe ethanol extraction and petroleum ether fraction were the main immunosuppressive fraction,which could significantly inhibit the proliferation of T and B cells and alleviate the swollen-auricle of mice without toxicity to normal cells and spleen and thymus.

Guizhi decoction/analysis;Chemical fractionation;Hypersensitivity,delayed;Catalytic domain

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.004

2016-03-23，

2016-06-11)