石岱龍， 田武英， 焦青松， 王慶文， 馮漢青， 賈凌云

( 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070 )

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外源ATP對NaCl脅迫下菜豆葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘恼{(diào)節(jié)

石岱龍， 田武英， 焦青松， 王慶文， 馮漢青， 賈凌云*

( 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 蘭州 730070 )

鹽脅迫是影響植物生長的主要逆境因子之一，外源ATP被發(fā)現(xiàn)可作為信號分子參與植物對逆境脅迫生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)。為了探明外源ATP在植物鹽脅迫響應(yīng)中的作用，以增強(qiáng)植物對土壤鹽漬化的耐性，更好地應(yīng)用于土壤鹽漬化修復(fù)。該研究以菜豆(Phaseolusvulgaris)為材料，通過葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)探討了外源ATP對菜豆葉片在NaCl脅迫下葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓?guī)律。結(jié)果表明：在NaCl脅迫下，葉片光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)潛在最大光化學(xué)量子效率(Fv/Fm)、光適應(yīng)下最大光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)、PSⅡ光適應(yīng)下實(shí)際光化學(xué)效率[Y(Ⅱ)]、光化學(xué)熒光猝滅(qP)、電子傳遞速率(ETR)與對照組相比均有顯著性下降，而非光化學(xué)猝滅(NPQ)和(qN)較對照組有顯著性增加，這表明NaCl脅迫導(dǎo)致菜豆葉片光系統(tǒng)Ⅱ光化學(xué)效率的下降和光能耗散的增加。而外源ATP(eATP)的處理能有效緩解NaCl脅迫所造成的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、qP、ETR下降和NPQ、qN的上升。該研究結(jié)果表明在NaCl脅迫下外源ATP可以有效地提高菜豆幼苗光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的光化學(xué)反應(yīng)效率。

菜豆, 細(xì)胞外ATP, 鹽脅迫, 光系統(tǒng)Ⅱ, 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

三磷酸腺苷(ATP)通常認(rèn)為是存在于細(xì)胞內(nèi)部的“能量貨幣”。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，對植物施加外源的ATP可改變細(xì)胞活性、細(xì)胞生長發(fā)育、抗病反應(yīng)(Wolf et al, 2007; Riewe et al, 2008; Clark et al, 2010)和植物細(xì)胞程序性死亡(Sun et al, 2012)等。進(jìn)一步的研究表明，盡管外源ATP不能自由穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部(Foresi et al, 2007)，但細(xì)胞質(zhì)膜上存在著細(xì)胞外ATP(eATP)的受體(Song et al, 2006; Choi et al, 2014)，可通過結(jié)合eATP使得細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生第二信使(如細(xì)胞自由Ca2+、活性氧和一氧化氮)(Foresi et al, 2007; Demidchik et al, 2003, 2009, 2010)，從而誘導(dǎo)特定基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的多種生理功能(Sun et al, 2012; Chivasa et al, 2010)。目前細(xì)胞外ATP已經(jīng)被證明廣泛存在于各種動(dòng)、植物的細(xì)胞外基質(zhì)中，并作為一種信號分子調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理學(xué)反應(yīng)(Roux & Steinebrunner, 2007; Kiwamu et al, 2010)。

土壤鹽漬化是影響植物生長、限制作物生產(chǎn)力的主要逆境因素之一(Khan & Panda, 2008)。長期以來，鹽脅迫對植物的影響以及如何提高植物的抗鹽性，增加在鹽脅迫下農(nóng)作物的產(chǎn)量一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)問題(楊曉慧等, 2006)。而光合作用作為植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)(劉劍光等, 2010),決定植物的能量吸收和有機(jī)物的積累，是其它一切生命活動(dòng)和生理過程的基礎(chǔ)，與植物生長、發(fā)育密切相關(guān)，因此對植物光合生理特性進(jìn)行研究，可為進(jìn)一步闡明植物生存內(nèi)在機(jī)制提供理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫既可以通過改變細(xì)胞的離子平衡而直接影響植物的生長，也可以通過抑制光合作用，尤其是光反應(yīng)階段(張寶澤, 1997)，而間接影響植物的生長。鹽脅迫下，細(xì)胞中Na+和Cl-的積累使得類囊體膜糖脂的含量顯著下降(Müller & Santarius, 1978),不飽和脂肪酸的含量也下降，而飽和脂肪酸的含量卻隨之上升，從而破壞類囊體膜的光化學(xué)特性，且使垛疊狀態(tài)的類囊體膜的比例減小(Maslenkova et al, 1993)，從而引起光反應(yīng)效率的下降。也有研究報(bào)道,鹽脅迫會(huì)通過影響PSⅡ捕光色素以及電子傳遞體的功能等多種方式，從而降低葉綠體對光能的吸收和利用(Rao GG & Rao GR, 1981)。盡管ATP可作為一種細(xì)胞外信號分子參與植物諸多生理學(xué)反應(yīng)的調(diào)節(jié)，但目前關(guān)于eATP對植物光化學(xué)反應(yīng)影響的研究較少。但最近的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，PSⅡ中的Psbp蛋白等植物光反應(yīng)階段相關(guān)蛋白的表達(dá)水平受到了eATP水平的調(diào)控(Chivasa et al, 2010)，提示了植物的光化學(xué)反應(yīng)很可能也受到了eATP的影響。但在鹽脅迫下植物的光反應(yīng)階段是否可能被eATP所調(diào)節(jié)卻尚無報(bào)道。

綜上所述，本研究分析了外源ATP對鹽脅迫下菜豆幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化的影響，探討了eATP在鹽脅迫下對植物光化學(xué)反應(yīng)的調(diào)控作用，為擴(kuò)展ATP生物學(xué)功能的認(rèn)知以及利用外源化學(xué)物質(zhì)影響植物的抗逆性能提供參考和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)

農(nóng)普12號菜豆種子，源自廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。種子經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% NaClO溶液表面消毒10 min后，用蒸餾水充分沖洗以除去殘余的NaClO溶液。然后，將消毒處理后的種子置于覆蓋有蒸餾水浸濕的多層紗布的培養(yǎng)皿中，于23 ℃下進(jìn)行萌發(fā)。選取萌發(fā)長勢一致的種子移栽到有Hoagland培養(yǎng)液的小錐形瓶內(nèi)，每瓶一株。培養(yǎng)室的晝夜溫度變化為23 ℃/18 ℃，光照強(qiáng)度(150 ± 5) μmol·m-2·s-1，光周期為12 h光照/12 h黑暗?？諝鉂穸?5%，每2 d更換營養(yǎng)液1次保持培養(yǎng)介質(zhì)充足。直至第一對真葉完全展開(約10 d)進(jìn)行以下處理。

1.2 材料處理

選取長勢一致的菜豆幼苗作為供試材料。以去離子水配制濃度為100 μmol·L-1的ATP，調(diào)pH6.7；對照組所用試劑為相同pH的去離子水。先將供試材料移植至NaCl濃度100 mmol·L-1的Hoagland營養(yǎng)液并放置在光照強(qiáng)度為(150 ± 5) μmol·m-2·s-1培養(yǎng)架上培養(yǎng)24 h(以放置在Hoagland營養(yǎng)液中的幼苗作為對照)(李廣魯?shù)? 2015)。然后以1 ml注射器分別取ATP或去離子水，使用無針頭注射法(Chivasa et al, 2005)處理供試葉片，處理4 h后進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定。

1.3 參數(shù)測定

采用葉綠素?zé)晒獬上駜xIMAGING-PAM(Waltz, Germany)完成葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定。參照Adams et al (1996)的方法，測取地點(diǎn)在培養(yǎng)室，空氣濕度45%，溫度(20±3)℃。具體步驟如下：測前對材料進(jìn)行30 min暗適應(yīng)(楊曉青等, 2004)；連接儀器，儀器正常運(yùn)行，開始測定，測得充分暗適應(yīng)下初始熒光(Fo)和最大熒光(Fm)；當(dāng)所測材料在作用光的實(shí)時(shí)熒光(Fs)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后20 s打開飽和脈沖光，測得最大熒光(Fm′)后關(guān)閉光化光；在遠(yuǎn)紅光下，測光最小熒光(Fo′)。根據(jù)以上參數(shù)計(jì)算出充分暗適應(yīng)下PSⅡ潛在最大光化學(xué)量子效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm、光適應(yīng)下最大光化學(xué)效率Fv′/Fm′=(Fm′-Fo′)/Fm′，由儀器直接導(dǎo)出光適應(yīng)下PSⅡ的實(shí)際光化學(xué)效率 [Y(Ⅱ)]光合電子傳遞速率(ETR)，光化學(xué)猝滅(qP)，非光化學(xué)猝滅(qN)和(NPQ)等參數(shù)的值(Li et al, 2006)。測量程序結(jié)束后導(dǎo)出記錄。每組重復(fù)進(jìn)行3～4次。

1.4 相對含水量測定

采用稱重法，測定葉片相對含水量(RWC)(MI et al, 2003)。

鹽脅迫24 h相對含水量的分析: 葉片的水分情況由相對含水量來測定，公式如下：

RWC=(FW-DW)/(TW-DW)×100

FW——葉片的鮮重

TW——葉片的飽和重 (于室溫下去離子水中避光浸泡4 h后的重量)

DW——葉片干重 (烘箱中80 ℃烘烤24 h后的重量)

1.5 數(shù)據(jù)分析

將測得數(shù)據(jù)使用Excel數(shù)據(jù)處理軟件分列并計(jì)算出平均值與標(biāo)準(zhǔn)差(n-1)，后使用Origin 9.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(差異顯著,P<0.05)，及圖表繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對菜豆葉片相對含水量的影響

由圖1可見，在20 h NaCl處理后，與對照組CK相比，鹽脅迫下的葉片RWC下降了11.88%，差異顯著(P<0.05)，表明已經(jīng)對葉片造成了脅迫。

圖 1　鹽脅迫對菜豆葉片相對含水量的影響　CK，NaCl分別代表常溫下對照和鹽脅迫處理組。圖中不同字母表示顯著性差異(P<0.05)，每組數(shù)據(jù)重復(fù)測量4次(4片來自不同個(gè)體的葉片)。下同。 Fig. 1　Effects of NaCl stress on RWC of bean leavesCK, NaCl stands for control and salt stress group at room temperature. With different letters showed significant differences (P<0.05), the experiment was repeated four times(four pieces of leaves from different individuals). The same below.

2.2 外源ATP對NaCl脅迫的菜豆葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

PSⅡ潛在最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)反映了暗適應(yīng)下的植物葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ (PSⅡ)潛在的最大光化學(xué)效率。由圖2:A可知，鹽脅迫則導(dǎo)致了葉片的Fv/Fm明顯下降，與對照CK差異顯著。相似地，圖2:B中鹽脅迫也導(dǎo)致了葉片光適應(yīng)下PSⅡ的最大光化學(xué)效率(Fv′/Fm′)的下降，也與對照CK相比差異顯著。而且，F(xiàn)v′/Fm′在NaCl脅迫下的下降較之Fv/Fm的下降更為劇烈。與對照相比，NaCl脅迫使得Fv/Fm和Fv′/Fm′分別下降5.13%和17.15%，差異顯著(P<0.05)。

與鹽脅迫處理相比，在鹽脅迫下加入外源ATP使得葉片的PSⅡ潛在最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)和Fv′/Fm′均得到顯著回升。說明外源ATP的加入能夠有效提升鹽脅迫下菜豆幼苗葉片PSⅡ潛在的及在光下的最大光化學(xué)效率。

由圖3可知,鹽脅迫導(dǎo)致了PSⅡ光適應(yīng)下實(shí)際光化學(xué)效率 [Y(Ⅱ)](圖3:A)和電子傳遞效率(ETR)(圖3:B)以及光化學(xué)猝滅系數(shù)qP(圖3:C)均顯著下降，與對照CK相比，分別下降了40.76%、

圖 2　外源ATP對NaCl脅迫的菜豆葉片F(xiàn)v/Fm和Fv′/Fm′的影響　CK，NaCl分別代表常溫下對照和鹽脅迫處理組，NaCl+ATP表示鹽脅迫處理注射ATP。下同。Fig. 2　Effects of eATP on Fv/Fm and Fv′/Fm′ of PSⅡ of bean leaves under NaCl stress　CK and NaCl stand for control and salt stress group at room temperature. NaCl+ATP stands for salt stress with ATP treatment group at room temperature. The same below.

圖 3　外源ATP對NaCl脅迫的菜豆葉片Y(Ⅱ)、ETR和qP的影響　Fig. 3　Effects of eATP on Y(Ⅱ)，ETR and qP of bean leaves under NaCl stress

圖 4　外源ATP對NaCl脅迫的菜豆葉qN以及NPQ的影響Fig. 4　Effects of eATP on qN and NPQ of bean leaves under NaCl stress

40.77%以及28.53%，差異顯著(P<0.05)。反映了植物所吸收的光能中用于光化學(xué)的比例在降低、 PSⅡ中電子傳遞速率在減慢，且植物PSⅡ的開放性(或接受電子的能力)在下降。與鹽脅迫處理相比，鹽脅迫下外加ATP能夠引起Y(Ⅱ)、ETR和qP顯著上升，分別為對照的93.04%、93.08%和93.62%。說明外源ATP的加入能夠有效增加植物吸收的光能中用于光化學(xué)的比例，加快PSⅡ中電子傳遞速率、提升鹽脅迫下菜豆葉片光系統(tǒng)Ⅱ的開放性或接受電子的能力。

非光化學(xué)猝滅(qN)(圖4：A)以及調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量(NPQ)(圖4：B)，反映了PSⅡ天線色素所吸收的光能中未用于光合電子傳遞而以熱的形式耗散掉的光能部分或比例。鹽脅迫下NPQ以及qN均顯著上升，表明了脅迫下，以熱的形式耗散掉的光能部分的比例有所增加。與鹽脅迫處理組相比,脅迫下外加ATP的處理使得菜豆幼苗葉片的qN、NPQ顯著降低，恢復(fù)到對照水平。

3　討論

本研究中，NaCl脅迫導(dǎo)致了葉片F(xiàn)v/Fm和Fv′/Fm′以及Y(Ⅱ)、ETR和qP的下降。說明鹽脅迫下，葉片PSⅡ的容量和PSⅡ在光下運(yùn)行效率的降低，并且PSⅡ接受電子和傳遞電子的能力下降。同時(shí)，應(yīng)該注意到，鹽脅迫下葉片Y(Ⅱ)、ETR、qP、以及Fv′/Fm′的降低程度要強(qiáng)于Fv/Fm的下降，說明PSⅡ在光下運(yùn)行時(shí)受到NaCl脅迫的影響更顯著。和上述變化相應(yīng)的是，表征能量耗散的qN和NPQ在NaCl脅迫下均有顯著性增加，表明了NaCl脅迫下更多的光能無法被利用于光反應(yīng)，而被作為熱耗散掉(Groom & Baker, 1992)。

外加ATP可以有效地緩解NaCl脅迫所造成的Fv/Fm、Fv′/Fm′、Y(Ⅱ)、ETR和qP的下降。這說明ATP可以有效提高菜豆葉片PSⅡ的容量、PSⅡ在光下的運(yùn)行效率，以及PSⅡ接受電子和傳遞電子的能力。同時(shí)，施加外源ATP降低了NPQ和qN的上升，說明在NaCl脅迫下外源的ATP可以有效降低光能的熱耗散。

鹽脅迫可以破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，減少其數(shù)目，降低葉綠素的含量、加速老化，嚴(yán)重影響葉綠體對光能的吸收利用(王素平等, 2006)。而Chivasa et al(2010)以蛋白質(zhì)二維電泳及質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，Psbp蛋白及放氧增強(qiáng)蛋白等植物光反應(yīng)階段相關(guān)蛋白的表達(dá)水平受eATP水平調(diào)控，揭示了eATP水平變化對植物光和的影響可能與光反應(yīng)階段有關(guān)。eATP作用于植物光反應(yīng)階段的Psbp蛋白，造成光系統(tǒng)Ⅱ容量首先上升，顯示Fv/Fm、Fv′/Fm′恢復(fù)到對照水平；其次eATP使光系統(tǒng)Ⅱ運(yùn)行加速，顯示為Y(Ⅱ)、qP、ETR的顯著恢復(fù)(Maxwell & Johnson, 2000)。

如前言所述，ATP具有較高的極性而不能自由穿過細(xì)胞膜而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部(Foresi et al, 2007)。而植物PSⅡ的容量、運(yùn)行、接受和傳遞電子等的變化均發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部。因此，本研究所發(fā)現(xiàn)的在NaCl脅迫下外源ATP可有效提高菜豆幼苗光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的光化學(xué)反應(yīng)效率的現(xiàn)象應(yīng)該并非主要由外源ATP使胞內(nèi)ATP含量增加引起的。有對擬南芥突變體的研究發(fā)現(xiàn)，DORN1——植物感知細(xì)胞外ATP必需的受體，當(dāng)eATP作用于受體部位時(shí)，結(jié)合受體使得細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生Ca2+內(nèi)流，從而調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的多種生理功能(Choi et al, 2014)。而有研究也發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下對植物施加Ca2+可以緩解鹽脅迫引起的Na+含量和丙二醛含量的上升(表征質(zhì)膜氧化損傷)，并且提高了K+和Ca2+的吸收(閆永慶等, 2014; 劉雪琴等, 2010)。因此，外源ATP很可能是通過結(jié)合細(xì)胞外ATP受體而引起了細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的上升而緩解了NaCl脅迫對光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)光化學(xué)反應(yīng)的抑制作用(Feng et al, 2015)。當(dāng)然，也不排除外源ATP是通過引起其他細(xì)胞內(nèi)信號分子(如ROS或NO)而緩解了NaCl脅迫對光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)光化學(xué)反應(yīng)的抑制作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深化研究。但目前的研究顯示了外源ATP具有對在鹽脅迫下提升植物光化學(xué)反應(yīng)的生理學(xué)作用。

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Effects of exogenous ATP on chlorophyll fluorescence characteristics of bean leaves under NaCl stress

SHI Dai-Long, TIAN Wu-Ying, JIAO Qing-Song, WANG Qing-Wen,FENG Han-Qing, JIA Ling-Yun*

(CollegeofLifeSciences,NorthwestNormalUniversity, Lanzhou 730070, China )

NaCl stress is an important adverse environmental factor, exogenous ATP (eATP) was found a signal molecule involved in plant responses to stresses. We studied the effects of exogenous ATP (eATP) on chlorophyll fluorescence characteristics of bean (Phaseolusvulgaris) leaves under NaCl stress. The results showed that treatment with NaCl caused a significant decrease in the ratio ofFv/Fm(the potential maximal photochemical efficiency of PS Ⅱ),Fv′/Fm′(the maximum quantum efficiency of PS Ⅱ photochemistry at illumination ),Y(Ⅱ)(effective photochemical quantum yield of PS Ⅱ photosynthetic),qP(photochemical quenching coefficient), andETR(the rate of non-cyclic electron transport through PS Ⅱ), but the levels ofqN(non-photochemical quenching) andNPQ(non-photochemical quenching) were significantly increased. These results suggested that NaCl stress caused the decrease of the photochemical efficiency of bean leaves and dissipation of light energy. However, the application of exogenous ATP effectively mitigated the decreases ofFv/Fm,Fv′/Fm′,Y(Ⅱ),qPandETRand mitigated the increases ofqNandNPQunder NaCl stress. These results suggest that exogenous ATP can improve the photochemical efficiency of photo-system Ⅱ when plants were subjected to NaCl stress.

Phaseolusvulgaris， exogenous ATP， NaCl stress， PSⅡ， chlorophyll fluorescence

10.11931/guihaia.gxzw201510025

2015-10-25

2016-02-11

國家自然科學(xué)基金(31260059,30900105)；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(211190)；甘肅省財(cái)政廳高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31260059, 30900105); Key Project of Chinese Ministry of Education (211190);the Fundamental Research Funds for the Gansu Universities of Gansu Provincial Department of Finance]。

石岱龍(1988-)，男，甘肅蘭州人，碩士研究生，從事植物生理學(xué)研究，(E-mail)1074515619@qq.com。

賈凌云，博士，高級實(shí)驗(yàn)師，從事植物生理生態(tài)研究，(E-mail) lingyunjia1982@126.com。

Q945.78

A

1000-3142(2016)09-1087-06

石岱龍， 田武英， 焦青松，等. 外源ATP對NaCl脅迫下菜豆葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘恼{(diào)節(jié) [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1087-1092

SHI DL, TIAN WY, JIAO QS， et al. Effects of exogenous ATP on chlorophyll fluorescence characteristics of bean leaves under NaCl stress [J]. Guihaia， 2016， 36(9):1087-1092