侯　珺， 羅建讓， 肖菲菲， 張延龍， 牛立新

( 西北農(nóng)林科技大學(xué) 風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100 )

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21種野生百合親緣關(guān)系的ISSR分析

侯珺， 羅建讓， 肖菲菲， 張延龍*， 牛立新

( 西北農(nóng)林科技大學(xué) 風(fēng)景園林藝術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100 )

該研究選用7條ISSR標(biāo)記引物對百合屬21種野生百合的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，使用POPGEN1.32和MEGA5.1數(shù)據(jù)處理軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果表明：7條引物擴(kuò)增出149條條帶，其中136條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率為91.06%，平均有效等位點(diǎn)數(shù)為1.762 4，平均Nei’s基因多樣度為0.421 4，平均Shanon信息指數(shù)0.608 5。遺傳距離變化范圍為0.307 5～0.887 3，紫脊百合和尖被百合的遺傳距離最大，均值為0.887 3，表明21份材料中二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；紫脊百合和宜昌百合遺傳距離最小，均值為0.307 5，表明二者親緣關(guān)系最近。聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類大致吻合，21個供試材料可被分成5個類群，大理百合、寶興百合、卷丹百合、紫斑百合、乳頭百合、川百合、蘭州百合、山丹百合、綠花百合和毛百合為第Ⅰ類群；紫脊百合、宜昌百合、岷江百合、通江百合和淡黃花百合為第Ⅱ類群；野百合和百合為第Ⅲ類群；青島百合為第Ⅳ類群；第Ⅴ類群包括玫紅百合、有斑百合和尖被百合。毛百合與卷瓣組百合親緣關(guān)系較近，鐘花組百合與卷瓣組百合存在基因交流，說明不能僅僅依靠形態(tài)學(xué)對野生百合進(jìn)行分類。聚類分析結(jié)果中野百合與百合單獨(dú)聚為一類，這說明是否具葉柄對野生百合的分類是一個重要的形態(tài)學(xué)特性。ISSR分子標(biāo)記適合用于百合屬植物的親緣關(guān)系分析。

百合屬, 野生百合, ISSR, 親緣關(guān)系, 樹狀圖

百合屬(Lilium)為百合科百合族的一個多年生屬，有90余種，大多分布在北半球的溫帶和寒帶地區(qū)，少數(shù)分布在熱帶高海拔山區(qū)，中國為世界百合起源中心，約46種18個變種(趙祥云等，1999)，分布于27個省市自治區(qū)(陳心啟等，1980)。百合屬植物具多年生地下鱗莖，花色多樣，藥用及觀賞價值極高。雖然野生百合種質(zhì)資源豐富，但對百合屬的屬下類群劃分、起源、進(jìn)化等問題仍爭議頗多?，F(xiàn)國際最常采用的分類系統(tǒng)是Comber(1949)依據(jù)15個形態(tài)特征建立的，他將百合屬分為7組?！吨袊参镏尽穼俸蠈僦参飫澐譃?個組(陳心啟等，1980)。Nishikawa et al(1999)最早對百合屬進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)國際分類系統(tǒng)的毛百合組與卷瓣組親緣關(guān)系較近，國際分類系統(tǒng)中屬于毛百合組的毛百合被劃分在中國分類系統(tǒng)中的鐘花組，由此可見毛百合的系統(tǒng)位置較復(fù)雜。我國百合屬分組中屬于百合組的野百合和百合，在Comber的分組中被劃分在具葉柄組(sect.Archelirion)。中國是百合屬植物的自然分布中心之一，因此研究中國百合屬植物親緣關(guān)系對于探討百合屬起源、進(jìn)化、遷移以及建立科學(xué)的分類系統(tǒng)至關(guān)重要。目前國內(nèi)百合系統(tǒng)研究多以形態(tài)學(xué)(向地英等，2006)、染色體特征(張藝萍等，2014)、花粉形態(tài)(顧欣等，2013)為依據(jù)。利用分子標(biāo)記研究百合親緣關(guān)系多見于栽培品種，原生種的分子標(biāo)記有RAPD，AFLP，SRAP分析，較全面的針對野生種系統(tǒng)學(xué)的研究較少。

簡單重復(fù)序列間擴(kuò)散多態(tài)性(ISSR)是由加拿大蒙特利爾大學(xué)Ziekiewicz et al(1994)基于SSR標(biāo)記創(chuàng)建來的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，其基本原理就是在SSR的3′或5′端加錨1～4個隨機(jī)核苷酸作為引物，對兩側(cè)具有反向排列SSR的一段DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行電泳、染色，根據(jù)所讀取譜帶的有無及相對位置差異，來分析不同樣品間 ISSR標(biāo)記的多態(tài)性。由于 ISSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RAPD和SSR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)操作簡便快捷、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好、成本較低、所揭示的遺傳多態(tài)性十分豐富，因此，ISSR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物育種、植物遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、品種鑒定、基因定位、遺傳作圖等研究中(Tsumura et al，1996；Qian et al，2011；Pradeep et al，2002；Devarumath et al，2002；Guo et al，2011)。 本研究將此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于中國百合屬的親緣關(guān)系分析，首次對我國百合屬四個組21種野生類群進(jìn)行研究，希望為百合屬系統(tǒng)學(xué)研究及資源合理利用提供科學(xué)依據(jù)，并對分類上存在爭議的種的歸屬進(jìn)行確定。

1　材料與方法

1.1 材料

供試的野生百合材料有21個種或變種，來自陜西、甘肅、云南、四川和山東省(表1)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)牛立新教授鑒定，種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)百合資源溫室內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取采用Biospin植物基因組DNA提取試劑盒提取21份植物材料的基因組DNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度與濃度，稀釋至80 ng·μL-1于-20 ℃保存。

表 1　供試21種野生百合采集地

表 2　7條ISSR引物的退火溫度及其擴(kuò)增結(jié)果

Y = (C, T)

1.2.2 引物篩選及優(yōu)化體系建立基于早期ISSR標(biāo)記在木蘭亞屬植物應(yīng)用中的研究報道，本研究引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的序列和日本Yamagishi et al(2002)在研究百合所采用的3A引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，利用Eppendorf梯度PCR擴(kuò)增儀(Mastercycler pro型)確定引物最佳退火溫度和篩選引物，最終從163條引物中篩選出7條穩(wěn)定且重復(fù)性好的ISSR引物。利用單因素設(shè)計，對影響PCR反應(yīng)的模板濃度、引物濃度、循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，建立適合野生百合ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系。

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，含10 μL 2 ×TaqPCR Master Mix，RNase-free water 8 μL ，DNA模板80 ng，10 μmol·L-1引物1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，51.1～58.1 ℃(因引物不同而異)退火45 s，72 ℃ 延伸1.5 min，39個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min，4 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，對清晰且易于辨認(rèn)的條帶，在相同遷移位置上有帶標(biāo)為“1”，無帶標(biāo)為“0”，構(gòu)建出樣品分子標(biāo)記0、1矩陣。應(yīng)用POPGEN 1.32軟件，采用SM相似系數(shù)法計算21份野生百合材料的多態(tài)性條帶百分比(PPB)、有效等位基因樹(Ne)、Nei’s基因多樣度(H)、Shanon信息指數(shù)(I)、和遺傳距離。應(yīng)用MEGA5.1軟件，采用鄰接法(Neighbor-joining)進(jìn)行聚類分析，得出野生百合親緣關(guān)系聚類圖。

2　結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴(kuò)增結(jié)果

選用野生百合四個組的四種野生百合材料，分別為輪葉組的青島百合、鐘花組的玫紅百合、卷瓣組的卷丹百合和百合組的宜昌百合，篩選ISSR引物，從169條引物中篩選出7條擴(kuò)增效果較好的引物，用于野生百合材料的ISSR擴(kuò)增。多態(tài)性條帶的分子量主要分布在250～750 bp之間，擴(kuò)增結(jié)果及多態(tài)性信息見表2，共得到清晰條帶149條，多態(tài)性條帶136條，多態(tài)性條帶比率為91.06%。經(jīng)重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn) ISSR標(biāo)記穩(wěn)定性較強(qiáng)，多態(tài)性條帶豐富，利用7條引物能有效地將所有樣品進(jìn)行區(qū)分，因而ISSR可用于野生百合種質(zhì)的鑒定。其中引物UBC842對 21 份百合材料的擴(kuò)增結(jié)果見圖 1 。

2.2 親緣關(guān)系分析

21份供試材料的遺傳距離變化范圍為0.307 5～0.887 3。ISSR引物組合平均有效等位基因數(shù)、Nei’s 基因多樣度和 Shannon 信息指數(shù)均值分別為1.762 4，0.421 4和0.608 5(表2)。表2表明供試材料多態(tài)性高，遺傳變異豐富。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，紫脊百合和尖被百合的遺傳距離最大，均值為0.8873，表明21份野生百合材料中二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；紫脊百合和宜昌百合遺傳距離最小，均值為0.3075，表明二者親緣關(guān)系最近(表3)。

圖 1　引物UBC842對21個野生百合樣品擴(kuò)增的凝膠電泳圖譜　1. 有斑百合； 2. 尖被百合； 3. 野百合； 4. 山丹百合； 5. 綠花百合； 6. 通江百合； 7. 川百合； 8. 淡黃花百合； 9. 紫脊百合； 10. 宜昌百合； 11. 岷江百合； 12. 百合； 13. 玫紅百合； 14. 蘭州百合； 15. 青島百合； 16. 乳頭百合； 17. 大理百合； 18. 紫斑百合； 19. 毛百合； 20. 寶興百合； 21. 卷丹百合。Fig. 1　Electrophoresis result of amplification of 21 wild species of Lilium using primer U842　1. L. concolor var. pulchellum; 2. L. lophophorum; 3. L. brownie; 4. L. pumilum; 5. L. fargesii; 6. L. sargentiae; 7. L. davidii; 8. L. sulphureum; 9. L. leucanthum var. centifolium; 10. L. leucanthum; 11. L. regale; 12. L. brownii var. viridulum; 13. L. amoenum; 14. L. davidii var. unicolor; 15. L. tsingtauense; 16. L. papilliferum; 17. L. taliense; 18. L. nepalense; 19. L. dauricum; 20. L. duchartrei; 21. L. lancifolium.

2102000.53061900.49380.40181800.44670.58190.55591700.43530.44670.48180.48181600.49380.54320.55590.62220.56881500.72300.65000.59520.66420.65000.62221400.62220.49380.50590.43530.51820.55590.50591300.51820.58190.69310.65000.65000.58190.62220.67851200.49380.43530.62220.59520.60860.55590.59520.60860.63601100.67850.50590.47000.58190.58190.56880.54320.53060.54320.54321000.43530.59520.63600.59520.63600.66420.56880.56880.60860.51820.4938900.30750.45830.59520.75380.42400.63600.55590.49380.47000.58190.59520.5952800.51820.59520.40180.63600.73830.58190.62220.59520.63600.58190.70800.63600.6360700.56880.48180.72300.48180.49380.58190.38010.58190.50590.47000.54320.50590.67850.5688600.60860.44670.55590.60860.53060.59520.63600.56880.66420.69310.62220.42400.63600.54320.6785500.54320.54320.50590.56880.65000.56880.60860.59520.50590.54320.51820.55590.50590.54320.58190.5559400.42400.60860.60860.54320.58190.63600.53060.59520.66420.56880.75380.55590.54320.51820.48180.70800.4938300.55590.54320.55590.72300.56880.53060.53060.55590.47000.58190.56880.66420.69310.62220.59520.58190.51820.6500200.78550.75380.65000.72300.78550.65000.88730.66420.63600.65000.58190.62220.72300.63600.80180.80180.60860.67850.6500100.41280.81830.75380.62220.75380.58190.59520.75380.63600.60860.70800.53060.62220.69310.63600.67850.80180.66420.70800.8018123456789101112131415161718192021

注： 表內(nèi)野生百合順序同圖1。

Note: see Figure 1 for the sequence ofLilium.

圖 2　21種野生百合聚類圖Fig. 2　Cluster analysis of 21 wild species of Lilium based on ISSR data using UPGMA

2.3 聚類分析

根據(jù)ISSR擴(kuò)增結(jié)果，得到21份野生百合材料的親緣關(guān)系樹狀圖(圖2)。由圖2可見， 21個供試材料可分成5類：Ⅰ類包括卷瓣組的大理百合、寶興百合、卷丹百合、紫斑百合、乳頭百合、川百合、蘭州百合、山丹百合和綠花百合，鐘花組的毛百合；Ⅱ類包括百合組的紫脊百合、宜昌百合、岷江百合、通江百合和淡黃花百合；Ⅲ類包括百合組的野百合、百合；Ⅳ類有輪葉組的青島百合；Ⅴ類有鐘花組的玫紅百合、有斑百合和尖被百合。

3　討論與結(jié)論

本研究采用7個ISSR標(biāo)記引物對原產(chǎn)中國的21個百合野生種基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，得到清晰條帶149條，多態(tài)性條帶136條，多態(tài)性比率為91.06%。統(tǒng)計結(jié)果顯示供試材料間的遺傳距離較大，這說明我國野生百合種間差異明顯、基因資源豐富。由此可見，ISSR標(biāo)記適合于百合屬植物親緣關(guān)系分析，是一種有效、可靠的分子標(biāo)記。

21份材料的遺傳距離變化范圍為0.307 5～0.887 3。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，紫脊百合和尖被百合的遺傳距離最大，均值為0.887 3，說明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；紫脊百合為宜昌百合的變種，紫脊百合和宜昌百合遺傳距離最小，均值為0.307 5，說明二者親緣關(guān)系最近。蘭州百合為川百合變種，二者遺傳距離為0.380 1，百合為野百合變種，二者遺傳距離為0.47，遺傳距離均較小，種間遺傳距離多大于0.47，可見變種與原種親緣關(guān)系比種間親緣關(guān)系近。

通過對21種野生百合的聚類分析，可以將供試材料分成5類。其中卷瓣組全部聚為一類，百合組大多數(shù)種聚為一類，輪葉組自成一類，鐘花組大多數(shù)聚為一類，聚類結(jié)果大致上與形態(tài)學(xué)分類一致。聚類結(jié)果中第Ⅰ類中，大多數(shù)野生種花被片反卷程度大，與其他類形態(tài)學(xué)上差異明顯；第Ⅱ類中花呈喇叭狀，花被先端向外反卷，程度小于卷瓣組反卷程度；第Ⅲ類與第Ⅱ類花的性狀一致，區(qū)別在于葉子具葉柄；第Ⅳ類為輪葉組的青島百合，其葉片輪生，與其他類群葉片著生方式大不相同；第Ⅴ類野生百合花呈鐘狀，花瓣先端微彎。由此可見，花被片的反卷以及葉子的性狀都是野生百合分類重要的依據(jù)。

傳統(tǒng)分類中，毛百合被劃分在鐘花組，本研究中毛百合與卷瓣組所有種聚為一類。根據(jù)國際野生百合形態(tài)學(xué)分組，屬于中國野生百合鐘花組(sect.Lophophorum)的毛百合被放入一個中國分組中沒有的毛百合組(sect.Daurolirion)中，在Michael & Harris(2002)的百合進(jìn)化樹圖中，鐘花組的毛百合與卷瓣組的卷丹、山丹劃在一個進(jìn)化樹分支上，Lee(2011)通過DNA測序研究朝鮮百合屬植物進(jìn)化分支，聚類結(jié)果第6分支將毛百合組與大多數(shù)的卷瓣組百合聚為一類，說明毛百合組與卷瓣組百合之間親緣關(guān)系較近。這與 Dubouzet & Shinoda(1999)研究結(jié)果相同。智利等(2011)在對中國23個野生種通過SRAP分子標(biāo)記對其進(jìn)行遺傳多樣性研究表明，毛百合與卷瓣組聚為一類。由此可見，鐘花組的毛百合與卷瓣組聚為一類，是符合野生百合形態(tài)學(xué)和分子水平分類的，證實(shí)了Nishikawa et al(1999)的發(fā)現(xiàn)，國際分類系統(tǒng)的毛百合組與卷瓣組親緣關(guān)系較近，鐘花組與卷瓣組之間存在基因交流。毛百合雖未能與同樣花冠的種聚在一起，而與花被反卷的卷瓣組聚在一起，說明毛百合系統(tǒng)位置可能比較復(fù)雜，有待隨后繼續(xù)研究。

在中國野生百合分組中，野百合和百合屬于百合組，而在Comber(1949)的野生百合分組中，野百合和百合被放在具葉柄組(sect.Archelirion)中，中國分組中無具葉柄組。本研究聚類結(jié)果顯示，野百合與百合單獨(dú)聚為一類，因此支持了國際野生百合形態(tài)學(xué)上的分組，并且說明是否具葉柄對野生百合的分類是一個重要的形態(tài)學(xué)性狀。Nishikawa et al(1999)研究證實(shí)很難依據(jù)形態(tài)特征對百合屬進(jìn)行分類，因?yàn)橛行┓N雖然親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但其形態(tài)特征尤其是花型卻非常相似，本研究種毛百合、野百合、百合的聚類形式與傳統(tǒng)形態(tài)分類結(jié)果不盡相同，一定程度上印證了此觀點(diǎn) 。

本研究證實(shí)了ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能較好地從分子水平揭示野生百合種間的親緣關(guān)系，肯定了形態(tài)學(xué)分類的科學(xué)性，并發(fā)現(xiàn)毛百合與卷瓣組百合的親緣關(guān)系相近，鐘花組與卷瓣組野生百合存在基因交流。我國野生百合種類豐富、生態(tài)類型多樣，曾為百合育種做出了突出貢獻(xiàn)。如20世紀(jì)初，利用野生百合(岷江百合)的抗逆性，瀕臨滅絕的歐洲百合得以拯救?，F(xiàn)今栽培百合雜種系中的亞洲百合雜種系、麝香百合雜種系、喇叭百合雜種系和白花百合雜種系等均有我國原生種參與雜交而成。因此，進(jìn)一步加強(qiáng)我國百合遺傳多樣性與親緣關(guān)系研究，對于野生資源科學(xué)保護(hù)和有效利用具有重要意義 。

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Genetic relationship analysis of 21 wild species ofLiliumby ISSR markers

HOU Jun, LUO Jian-Rang, XIAO Fei-Fei, ZHANG Yan-long*, NIU Li-Xin

(CollegeofLandscapeArchitectureandArts,NorthwestA&FUniversity, Yangling 712100, China )

To probe the infrageneric phylogenetic relationship ofLilium, seven inter-simple sequence repeat (ISSR) primers were chosen to analyze genetic diversity of 21 wild species ofLilium. POPGENE1.32 and MEGA5.1 were used for data analysis. Results showed that a total of 149 clear DNA bands were amplified, 136 of which were polymorphic, the proportion was 91.06%. The average value of effective number of alleles was 1.762 4. The average value of Nei’s gene diversity was 0.421 4, and the average value of Shannon's Information index was 0.608 5. The genetic distance ranged from 0.307 5 to 0.887 3. The genetic distance betweenL.leucanthumandL.leucanthumvar.centifoliumwas a maximum of selected 21 parts of wild lily material, average value 0.887 3, which indicated that the genetic relationship between them was the fartherest. Whereas the genetic distance betweenL.leucanthumvar.centifoliumandL.lophophorumwas a minimum of selected 21 parts of wild lily material, average value 0.307 5, which indicated genetic relationship between them was the closest. The clustering results were basically consistent with the morphology classification. Twenty-one wildLiliumspecies were classified into five clustering groups by neighbor joining method.L.taliense,L.duchartrei,L.lancifolium,L.nepalense,L.papilliferum,L.davidii,L.davidiivar.unicolor,L.pumilum,L.fargesiiandL.dauricumwere clustered in the first group. AndL.leucanthumBaker var.centifolium,L.leucanthum,L.nepalense,L.regale,L.sargentiaebelong to the second group.L.brownie,L.browniivar.viridulumwere clustered in the third group.L.tsingtauenseformed a distinct group andL.lophophorum,L.amoenum,L.concolorvar.pulchellumwere clustered in the fifth group.L.dauricumhas close genetic relationship with sect. Sinomartagon, and there were gene exchanges existed between Sect. Lophophorum and Sect. Sinomartagon. This indicated that it was not accurate to classify the wildLiliumall depend on the morphology.L.browniivar. viridulum andL.browniewere clustered into one individual group in cluster analysis results. This result showed that whether it has petioles was an important morphological character in the classification of wild lilies. And all the results indicated that ISSR markers were suited to study the phylogenetic relationship of wild lilies.

Lilium, wild lilies, ISSR, genetic relationship, tree plot

10.11931/guihaia.gxzw201504028

2015-04-19

2015-05-19

國家林業(yè)局重點(diǎn)科研項(xiàng)目(2006-73)；陜西省林業(yè)廳項(xiàng)目(陜林計字 [2011]70號)；國家自然科學(xué)基金(305021110)；西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Z109021002) [Supported by Key Scientific Research Project of State Forestry Administration (2006-73)； Project of Shaanxi Forestry Department ( [2011]70); National Natural Science Foundation of China (305021110)； Foundamental Scientific Research Fund of Northwest A & F University (Z109021002)]。

侯珺(1990-)，女，陜西渭南人，碩士，主要從事野生百合遺傳多樣性研究，(E-mail)346144734@qq.com。*

張延龍，教授，主要從事園林植物資源與育種研究，(E-mail) zhangyanlong@nwsuaf.edu.cn。

Q949

A

1000-3142(2016)09-1032-07

侯珺， 羅建讓， 肖菲菲， 等. 21種野生百合親緣關(guān)系的ISSR分析 [J]. 廣西植物， 2016， 36(9):1032-1038

HOU J, LUO JR, XIAO FF，et al. Genetic relationship analysis of 21 wild species ofLiliumby ISSR markers [J]. Guihaia， 2016， 36(9):1032-1038