張小卿，顧　煒，樸美淑，吳景東（.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 遼寧 沈陽(yáng) 0847；. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 遼寧 沈陽(yáng) 00；.韓國(guó)圓光大學(xué) 韓國(guó)首爾）

痤瘡合劑對(duì)兔耳痤瘡模型動(dòng)物血清中IL-1α、IL-6影響的實(shí)驗(yàn)研究

張小卿1，顧煒2，樸美淑3，吳景東1
（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 遼寧 沈陽(yáng) 110847；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 遼寧 沈陽(yáng) 110032；3.韓國(guó)圓光大學(xué) 韓國(guó)首爾）

目的：本研究以遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑——痤瘡合劑為處理因素，采用兔耳痤瘡模型，從毛囊角化程度、抗炎效應(yīng)角度研究痤瘡合劑對(duì)痤瘡?fù)枚Ｐ偷寞熜Р⑻接懫渥饔脵C(jī)理。方法：以煤焦油外涂兔耳制作痤瘡模型，每次約0.5ml，連續(xù)2周。造模成功后，將動(dòng)物分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，低、中、高劑量組和藥物對(duì)照組，通過(guò)觀察局部病理變化并檢測(cè)血清中IL-1α、IL-6含量觀察內(nèi)服痤瘡合劑對(duì)痤瘡的炎癥抑制作用。結(jié)果：痤瘡合劑確能減少兔耳毛囊角栓和結(jié)節(jié)，減輕兔耳毛囊口擴(kuò)張程度，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；造模后各組IL-1α、IL-6含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，痤瘡合劑低、中、高劑量組及藥物對(duì)照組含量均顯著下調(diào)（P＜0.01）；高劑量組及藥物對(duì)照組下調(diào)更為顯著；其中IL-1α高劑量組下調(diào)最為明顯，和藥物對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-6高劑量組和藥物對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：痤瘡合劑治療痤瘡作用機(jī)制與抑制血液中相關(guān)炎癥因子有關(guān)。

痤瘡；痤瘡合劑；IL-1α；IL-6

痤瘡（Acne）是常見(jiàn)皮膚病之一，屬于慢性的炎癥性皮膚疾病，它通常累及到毛囊、皮脂腺，好發(fā)于皮脂腺分泌旺盛的部位，其可表現(xiàn)為粉刺、丘疹、膿皰、結(jié)節(jié)、囊腫及瘢痕等特點(diǎn)的多形性皮損。本研究以遼寧中醫(yī)藥大學(xué)院內(nèi)制劑——痤瘡合劑為干預(yù)因素，以清肺胃濕熱，解毒散結(jié)為治療原則，通過(guò)觀察痤瘡合劑低、中、高三個(gè)劑量組對(duì)兔耳痤瘡模型的抑制作用，進(jìn)行痤瘡合劑動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，并初步探討其抗炎作用的機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康家兔48只，雄性，體重2.5～3kg，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥品及制備：痤瘡合劑（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑）；清熱暗瘡膠囊（批號(hào)：Z20070425）；痤瘡合劑的方藥組成有：夏枯草、枇杷葉、地黃、牡丹皮、黃連、桑白皮、連翹、金銀花、黃芩、牛蒡子、川芎、防風(fēng)、牡蠣、蟬蛻、北沙參、葛根、香附。

1.1.3主要試劑耗材：煤焦油（批號(hào)：81511）；IL-1α試劑盒（批號(hào)：SEA071Rb）；IL-6試劑盒（批號(hào)：SEA079Rb）。

1.1.4主要儀器及設(shè)備：酶標(biāo)儀（anthos2010型）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH·B11·500型）；恒溫水浴振蕩器（SHA-B）；脫水機(jī)（LEICA 300）；石蠟包埋機(jī)（EG1150）；切片機(jī)（LEICA RM2235）；生物顯微鏡（CHA型）；離心機(jī)（PB300）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)：家兔于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性觀察飼養(yǎng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。家兔飼以白菜、胡蘿卜，自由飲食、飲水。

1.2.2動(dòng)物分組：家兔50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，死亡2只，其余48只隨機(jī)分成6組，每組8只，即 ①空白對(duì)照組；②模型對(duì)照組；③痤瘡合劑低劑量組；④痤瘡合劑中劑量組；⑤痤瘡合劑高劑量組；⑥藥物對(duì)照組（清熱暗瘡膠囊）。

1.2.3造模：除空白對(duì)照組外，其余各組共40只家兔按照美國(guó)皮膚病學(xué)會(huì)1989年制定的兔耳模型規(guī)范 Kligman法［1］，分別在其雙耳內(nèi)側(cè)面耳管開(kāi)口處2cm×2cm范圍，每日用玻璃棒涂煤焦油1次，每次約0.5ml，連續(xù)2周。造模第14天取耳部痤瘡病變皮膚活檢，用10%的甲醛固定然后進(jìn)行石蠟蠟塊包埋再切片，每個(gè)標(biāo)本需要連續(xù)切片4張并以HE染色，然后切片并烘干，其后在顯微鏡下觀察，確定造模成功后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4干預(yù)方法：除空白對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物在造模成功后灌胃給藥，模型對(duì)照組每日給予20ml生理鹽水。成人臨床痤瘡合劑常用量為58.48g/d，分2次服用，按兔與人的等效劑量直接折算為2.92g/kg/d，痤瘡合劑低劑量組按等效劑量的3倍劑量給藥，即8.76g/kg/d；痤瘡合劑中劑量組按等效劑量的6倍劑量給藥，即17.52g/kg/d；痤瘡合劑中劑量組按等效劑量的9倍劑量給藥，即26.28g/ kg/d。低、中、高劑量藥物按每天用藥量不同分別煎煮成20ml水煎液，每日灌胃1次。清熱暗瘡膠囊臨床成人常用量為2.4g/d，分2次服用。經(jīng)等效劑量換算后，兔用藥量為0.12g/kg/d，溶于20ml生理鹽水后，每日灌胃1次，各組均連續(xù)治療14d。

1.2.5耳部組織取材：末次給藥20h后，以10%水合氯醛，按3ml/kg體重，進(jìn)行耳緣靜脈麻醉，麻醉后迅速取耳部痤瘡處組織，去除血液，濾紙拭干，經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定后進(jìn)行病理檢測(cè)。

1.2.6血清的采集：麻醉后，耳緣靜脈取血，分裝于離心管中，靜置30min，1 000r/min，離心5min，取上清，分裝于離心管中，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1α、IL-6的含量。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1肉眼觀察兔耳痤瘡變化：HE染色后光鏡下觀察模型病理變化。

1.3.2ELISA法檢測(cè)血清中IL-1α、IL-6含量：將用于家兔血清IL-1α、IL-6含量檢測(cè)的ELISA試劑盒從4℃冰箱中取出，室溫靜置30min，然后按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS（19.0）軟件，運(yùn)用多個(gè)樣本均數(shù)比較的方差分析檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以x-±s表示，并用最小顯著差法（LSD法）作兩兩比較。P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1兔耳痤瘡模型肉眼觀察結(jié)果：正常對(duì)照組肉眼觀察兔耳薄、柔軟，其上毛細(xì)血管清晰可見(jiàn)，兔耳管開(kāi)口處毛囊口排列整齊，不見(jiàn)角栓；模型對(duì)照組造模后14d兔耳部仍發(fā)紅，表皮明顯增厚，可見(jiàn)明顯黑色毛囊角栓，毛囊口呈突起，結(jié)節(jié)增多增大；痤瘡合劑低劑量組兔耳表皮增厚有所減輕，毛囊角栓和結(jié)節(jié)明顯減少，但仍有較多未治愈粉刺存在；痤瘡合劑中劑量組兔耳表皮厚度已達(dá)正常水平，毛囊角栓和結(jié)節(jié)顯著減少；痤瘡合劑高劑量組兔耳局部毛囊角栓少見(jiàn)，部分角栓脫落后遺留點(diǎn)狀凹陷的毛囊，丘疹變平減少；藥物對(duì)照組皮損恢復(fù)狀態(tài)與痤瘡合劑高劑量組相近，見(jiàn)圖1～6。

2.2組織學(xué)觀察結(jié)果：正常對(duì)照組兔耳表皮層較薄，毛囊，真皮、表皮交界清楚，真皮內(nèi)稀疏單一核細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組角化過(guò)度，表皮及毛囊上皮的顆粒層、棘層仍增生明顯，毛囊口及漏斗部仍見(jiàn)角化物質(zhì)堆積，漏斗部擴(kuò)大如壺狀，真皮內(nèi)仍見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。痤瘡合劑低劑量組兔耳毛囊口擴(kuò)張程度減輕，其內(nèi)角化物疏松，炎癥細(xì)胞有所減少；痤瘡合劑中劑量組兔耳鏡下觀察炎癥細(xì)胞明顯減少，毛囊口擴(kuò)張程度減輕；痤瘡合劑高劑量組兔耳可見(jiàn)表皮增厚明顯減輕，但仍見(jiàn)少部分毛囊口輕度擴(kuò)張，有少量疏松角化物質(zhì)充填，未見(jiàn)毛囊漏斗部擴(kuò)大如壺狀，真皮炎癥細(xì)胞明顯減少；藥物對(duì)照組鏡下可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞，毛囊口輕度擴(kuò)張。見(jiàn)圖7～12。

圖1　正常對(duì)照組兔耳皮膚

圖2　模型對(duì)照組兔耳皮膚

圖3　低劑量組兔耳皮膚

圖4　中劑量組兔耳皮膚

圖5　高劑量組兔耳皮膚

圖6　藥物對(duì)照組兔耳皮膚

圖7　正常對(duì)照組病理學(xué)觀察（HE染色，×40）

圖8　 模型對(duì)照組兔耳皮膚（HE染色，×40）

圖9　低劑量組兔耳皮膚（HE染色，×40）

圖10　中劑量組兔耳皮膚（HE染色，×40）

圖11　高劑量組兔耳皮膚（HE染色，×40）

圖12　藥物對(duì)照組兔耳皮膚（HE染色，×40）

2.3治療后各組家兔血清IL-1α、IL-6含量檢測(cè)結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，其余5組IL-1α、IL-6含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，痤瘡合劑低、中、高劑量組及藥物對(duì)照組含量均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與低劑量組比較，中、高劑量組及藥物對(duì)照組含量顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與中劑量組比較，高劑量組含量顯著下調(diào)，差異有極顯著意義（P＜0.01），藥物對(duì)照組含量亦顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-1α高劑量組和藥物對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-6高劑量組和藥物對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1　各組家兔血清lL-1α、lL-6含量 （n=8，x-±s）

3　討論

痤瘡的發(fā)病主要是由于雄性激素分泌的增加使皮脂腺肥大，致使皮脂分泌逐漸旺盛，毛囊皮脂腺導(dǎo)管開(kāi)口處角化過(guò)度，皮脂腺開(kāi)口變小或閉塞，影響皮脂的排出，使皮脂瘀積在毛囊內(nèi)［2］。滯留的皮脂在痤瘡丙酸桿菌的作用下，分解產(chǎn)生游離脂肪酸從而導(dǎo)致痤瘡的炎癥反應(yīng)；炎癥和感染又進(jìn)一步加重本病的皮損，因此炎癥是痤瘡發(fā)病的重要因素之一，參與痤瘡炎癥反應(yīng)的主要有IL-1α、IL-6、IL-8及TNF-α等細(xì)胞因子。IL-1是一個(gè)炎癥細(xì)胞因子家族，包括 IL-1α、IL-1β和IL-1Ra，其中IL-1α是其在皮膚的內(nèi)主要存在形式，IL-1α?xí)鹈移ぶ賹?dǎo)管的過(guò)度角化，以致痤瘡疾病的發(fā)生與發(fā)展；IL-6是炎性反應(yīng)的促發(fā)劑，由于在急性炎癥期時(shí)水平會(huì)升高的特質(zhì)，所以認(rèn)為其是許多炎癥性疾病的重要介質(zhì)［3-7］。

痤瘡臨床治療常采用抗生素、雌性激素或抗雄性激素、異維A酸等藥物治療。但上述各類藥物具有較大副作用［8］。近代醫(yī)家認(rèn)為本病發(fā)生與飲食不節(jié)，過(guò)食辛辣油膩之品有關(guān)，過(guò)食辛辣油膩導(dǎo)致濕熱內(nèi)生，循經(jīng)上壅，則粉刺易生；熱郁不解，濕邪留滯，久而化毒，兼痰凝血熱，則見(jiàn)皮疹從生［9］。筆者認(rèn)為痤瘡患者多處于青春期，生機(jī)旺盛，發(fā)病多由于素體陽(yáng)熱偏盛，嗜辛辣、肥甘厚味之品，引起肺胃濕熱積蘊(yùn)，以致濕熱火毒郁于肌膚腠理，引起疾病發(fā)生。治宜清熱祛濕，解毒散結(jié)。針對(duì)上述理論，結(jié)合祖國(guó)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)尋常痤瘡發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)。遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院以清肺胃濕熱，解毒散結(jié)為治則，研制了痤瘡合劑，方中金銀花清熱解毒，芳香透邪，連翹清熱解毒，消癰散結(jié)，二藥相伍，為治熱毒瘡癰要藥［10］。黃芩清肺熱，黃連瀉胃火，二藥合用以清瀉肺胃濕熱火毒。桑白皮、枇杷葉瀉肺胃之熱且降逆氣，俾火不上逆；沙參清熱并能養(yǎng)陰，以防邪熱傷陰。夏枯草清熱散結(jié)，牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)，合用以助消癰散結(jié)。牛蒡子疏散熱毒，散結(jié)消腫，防風(fēng)辛散透表，蟬蛻宣散透邪，葛根解肌散邪，四藥合用，促使熱毒邪氣從肌表而散。熱毒蘊(yùn)結(jié)，氣血郁滯不暢，故以地黃涼血清熱，牡丹皮涼血散瘀，川芎活血行氣，香附行氣止痛，如此血暢氣行，則郁熱火毒易解。諸藥合用，共奏清肺胃濕熱，解毒散結(jié)之功，治療尋常痤瘡具有科學(xué)依據(jù)，臨床療效可靠。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了痤瘡合劑的作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)痤瘡合劑除了能減少兔耳毛囊角栓和結(jié)節(jié)，減輕兔耳毛囊口擴(kuò)張程度，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)血液中相關(guān)炎癥因子也具有抑制作用，通過(guò)抑制IL-1α和IL- 6的產(chǎn)生進(jìn)一步抑制毛囊的炎癥損傷，從而阻斷痤瘡的形成和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

通過(guò)本研究還能發(fā)現(xiàn)目前國(guó)內(nèi)對(duì)痤瘡研究多停留在療效觀察層面，對(duì)其作用機(jī)制也沒(méi)有深入到細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)水平，今后的研究有待繼續(xù)深化。

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Experimental study of the impact of acne mixture on animal serum IL-1α and IL-6 on rabbit ears acne models

ZHANG Xiao-qing1，GU Wei2，PIAO Mei-shu3，WU Jing-dong1
（1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Shenyang Liaoning 110847； 2.The Affliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine hospital， Shenyang Liaoning 110032；3.Korean Wonk Wang University，Seoul Korea）

Objective In this study， acne mixture is the treatment factors， which is hospital preparation from Liaoning University of Traditional Chinese Medicine hospital， and using rabbit ear as acne model， from follicular keratosis degree and the perspective of anti-infammatory effects to study effcacy of acne mixture on acne rabbit ears model， and explore the mechanism of action. Methods Painted coal tar on rabbit ears to make acne models， every times 0.5 ml， for two consecutive weeks. After determine the successful model， the animals were divided into normal control group， model control group， low dose group，medium dose group，high dose group and drug control group. By observed local pathological changes and detection of serum IL-1α，IL-6 content to observed inhibition of oral acne mixture on acne infammatory. Results Acne mixture can reduce the rabbit ear follicular keratinous plug and nodules， reduce rabbit ears hair follicle dilation， and reduce infammatory cell infltration. Each group of IL-1α， IL-6 content were signifcantly increased after modeling（P＜0.01）. Compared with model control group，acne mixture low， medium and high dose group and drug control group content were signifcantly reduced （P＜0.01）.High dose group and drug control group was signifcantly down-regulated more；IL-1α decline was most obvious in the high dose group，there were statistical signifcance compared with drug control group（P＜0.05）. IL-6 had no statistic signifcance between high dose group and drug control group（P＞0.05）. Conclusion Acne mixture acne treat mechanism of action is related to inhibition related infammatory factors in blood.

acne； acne mixture； IL-1α； IL-6

R622 Q813.1

A

1008-6455（2016）08-0047-04

2016-05-15

2016-07-25

編輯/張惠娟

遼寧省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（課題編號(hào)L2014363）

吳景東，男，黑龍江哈爾濱人，教授，博士研究生導(dǎo)師，博士；研究方向：中醫(yī)藥抗皮膚衰老。E-mail:lnzywjd0719@163.com