兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面即刻外用藥物預(yù)防瘢痕增生的實(shí)驗(yàn)研究

楊正兵，喬 柱
（雅安市人民醫(yī)院燒傷整形科 四川 雅安 625000）

目的：本實(shí)驗(yàn)觀察兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用曲安奈德與維拉帕米預(yù)防瘢痕增生的療效。方法：健康的新西蘭大耳白兔48只，制作兔耳創(chuàng)傷模型，隨機(jī)分為A，B，C三組，每組16只計(jì)創(chuàng)面32個(gè)，A組為外用曲安奈德霜，B組外用維拉帕米霜，C組為生理鹽水對(duì)照組。術(shù)后第一天起用藥至4周后兔耳上皮化，切取瘢痕組織計(jì)算瘢痕增生指數(shù)，觀察masson染色膠原纖維的形態(tài)分布及成纖維細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果：A組與B組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A組、B組與C組比較，差異皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異顯著（P＜0.01）。結(jié)論：兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用曲安奈德與維拉帕米能有效預(yù)防抑制瘢痕增生，曲安奈德作用強(qiáng)于維拉帕米，但曲安奈德可能使皮膚萎縮，甚至壞死。

曲安奈德；維拉帕米；創(chuàng)傷；成纖維細(xì)胞；增生性瘢痕；實(shí)驗(yàn)研究

較深的燒傷創(chuàng)傷創(chuàng)面愈合后必然形成瘢痕，嚴(yán)重影響患者的功能及外觀。針對(duì)瘢痕的治療，目前無(wú)良好治療措施，常采用手術(shù)切除聯(lián)合其它輔助方法如按摩［1-2］、藥物注射、加壓［3］、冷凍、激光［4］、超聲波、硅凝膠膜［5］等。臨床常用經(jīng)證實(shí)有效的藥物如糖皮質(zhì)激素［6］，鈣通道阻滯劑等。Lee［7］，京薩［8-9］等研究證實(shí)肌注或者外用維拉帕米均能有效抑制兔耳瘢痕增生。在創(chuàng)傷后立即外用藥物能否有效預(yù)防抑制瘢痕增生，依此本實(shí)驗(yàn)在兔耳創(chuàng)傷后即用曲安奈德與維拉帕米至創(chuàng)面上皮化愈合，觀察其預(yù)防抑制瘢痕增生的療效。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供兔48只，兔耳完好，雌雄不計(jì)，年齡8～12月，體重為2.0～2.5kg。由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心代為飼養(yǎng)。

1.2主要儀器及試劑：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械包（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），三星數(shù)碼相機(jī)（自備），曲安奈德（北京曙光藥業(yè)有限責(zé)任公司），維拉帕米（上海禾豐制藥有限公司），無(wú)菌生理鹽水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）。

1.3兔耳創(chuàng)傷創(chuàng)面模型制作方法：本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作是依據(jù)李薈元［10］研究設(shè)計(jì)的瘢痕模型，創(chuàng)面形成方法：去除兔耳腹側(cè)1.5cm×1.5cm全層皮膚，刮除軟骨膜。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：實(shí)驗(yàn)共48只兔分3組，每組16只共32個(gè)創(chuàng)傷模型。A組為外用曲安奈德（將凡士林99g加熱熔化，緩緩加入到1g曲安奈德注射液，冷卻即得1%的維拉帕米霜），B組為外用維拉帕米（將凡士林99g加熱熔化，緩緩加入到1g維拉帕米注射液，冷卻即得1%的維拉帕米霜），C組為生理鹽水對(duì)照組（將凡士林99g加熱熔化，緩緩加入到1g無(wú)菌生理鹽水，冷卻即得1%的生理鹽水霜）。

1.5用藥方法：術(shù)后第1d，A組32個(gè)兔耳創(chuàng)傷創(chuàng)面外用曲安奈德霜，每日一次，每次均勻涂抹薄層藥霜在創(chuàng)面上，至兔耳上皮化愈合共計(jì)4周。B組C組同A組外用方法，B組外用維拉帕米霜、C組生理鹽水霜至兔耳上皮化愈合共計(jì)4周。

1.6取標(biāo)本及處理：實(shí)驗(yàn)第29d，利用空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，無(wú)菌條件下切取兔耳標(biāo)本，帶有部分正常皮膚軟組織及軟骨膜。將標(biāo)本固定在10%的甲醛溶液里，用石蠟包埋，行HE染色及Msson染色。

2　觀察指標(biāo)

2.1大體觀察：每天觀察并拍照記錄創(chuàng)面手術(shù)區(qū)情況，肉芽生長(zhǎng)情況，創(chuàng)面愈合情況，瘢痕形成情況如：組織的顏色、質(zhì)地、大小、厚度等。大體表現(xiàn)：采用溫哥華瘢痕評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［11］。

2.2瘢痕增生指數(shù)HI：依據(jù)Morris等［12］提出的公式HI=A/ B，A為瘢痕凸起最高點(diǎn)到兔耳軟骨表面的垂直距離，B為瘢痕周緣正常皮膚皮緣到兔耳軟骨表面的垂直距離。

2.3成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)FBI：依據(jù)Weidner等［13］對(duì)瘢痕組織的成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)方法，首先在低倍鏡下尋找HE染色標(biāo)本中清楚顯示并且成纖維細(xì)胞數(shù)最多的區(qū)域，再通過(guò)高倍鏡下觀察計(jì)數(shù)4個(gè)不同區(qū)域，結(jié)果取均數(shù)，此數(shù)為該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的成纖維細(xì)胞數(shù)目。

3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)采用PASW Statistics18（SPSS18.0）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用了t檢驗(yàn)，并且按檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01差異顯著；P＞0.05則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組對(duì)瘢痕的預(yù)防抑制作用無(wú)明顯差異。

4　結(jié)果

4.1一般觀察：A組給藥組肉眼可見(jiàn)瘢痕平，軟，顏色淡，斑塊體積小；B組瘢痕略平，稍軟，顏色稍淡，斑塊體積較??；C組對(duì)照組瘢痕高出皮表，硬，色紅，斑塊體積大。

4.2 Masson染色觀察：A組、B組膠原纖維排列整齊，形態(tài)纖細(xì)；C組膠原纖維藍(lán)染顏色深，纖維排列紊亂，粗大。

4.3瘢痕增生指數(shù)及成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)比較：通過(guò)對(duì)表1及表2數(shù)據(jù)進(jìn)行軟件分析，A組與B組比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組、B組與C組比較，差異皆具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異顯著（ P＜0.01）（見(jiàn)表1、表2）。

表1　瘢痕增生指數(shù)（Hl）比較

表2　成纖維細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

5　討論

曲安奈德抑制前膠原基因的表達(dá)，減少透明質(zhì)酸的含量及膠原酶抑制劑，抑制膠原蛋白的合成，促進(jìn)膠原纖維降解，減少膠原纖維含量，直接抑制成纖維細(xì)胞DNA，抑制肉芽組織形成［14］，抑制瘢痕形成。鈣通道阻滯劑維拉帕米主要作用于Rho激酶（Rho激酶參與如平滑肌收縮、抑制細(xì)胞增殖、形成應(yīng)力纖維、細(xì)胞骨架的重構(gòu)等多種細(xì)胞功能活動(dòng)，在細(xì)胞分化與遷移以及細(xì)胞凋亡中發(fā)揮相應(yīng)的藥理作用［15］）、肌球蛋白輕鏈激酶、蛋白激酶A、C、G等多種蛋白激酶，抑制細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子活動(dòng)，減少產(chǎn)生炎癥介質(zhì)而減輕炎癥反應(yīng)，減輕損傷并保護(hù)受損的組織。維拉帕米引起成纖維細(xì)胞球形化，減少膠原及纖維粘連蛋白合成，重塑細(xì)胞外間質(zhì)而抑制瘢痕增生［16］。另外，許寧［17］等研究表明，維拉帕米增強(qiáng)Smad7表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞α-Smad7 mRNA及細(xì)胞外基質(zhì)合成。劉沖［18］等認(rèn)為，鈣通道阻滯劑能夠改變損傷處血管分布狀況，直接影響瘢痕形成。陶靈［19］等提出，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和分化以及抗瘢痕組織纖維化在瘢痕增生形成過(guò)程中起重要作用。綜上機(jī)制，認(rèn)為維拉帕米通過(guò)抑制Rho激酶、抑制蛋白激酶活性，抑制細(xì)胞增殖，減輕組織器官重構(gòu)，有效地抑制成纖維細(xì)胞的增殖。

深度創(chuàng)傷燒傷創(chuàng)面瘢痕愈合是必然結(jié)局，能否在創(chuàng)傷即期即使用藥物預(yù)防抑制瘢痕的增生?；诖?，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用曲安奈德與維拉帕米，從大體及細(xì)胞學(xué)結(jié)果表明，曲安奈德與維拉帕米皆能預(yù)防抑制瘢痕增生，曲安奈德對(duì)瘢痕的預(yù)防抑制作用強(qiáng)于維拉帕米，但曲安奈德可使皮膚萎縮，甚至壞死；維拉帕米副作用不明顯。本實(shí)驗(yàn)表明，兔耳創(chuàng)傷后創(chuàng)面立即外用曲安奈德與維拉帕米能預(yù)防抑制瘢痕增生，但還存在如用藥頻次、用藥量、以及用藥的最佳濃度還有待進(jìn)一步研究。

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編輯/張惠娟

Experimental study on the prevention of scar hyperplasia by immediate external use of drugs in the wound of rabbit's ears

YANG Zheng-bing， QIAO Zhu
（Department of Burn and Plastic Surgery，Ya'an People's Hospital， Ya'an 625000，Sichuan，China）

Objective The experiment observes the effect of immediate external application of triamcinolone acetonide and verapamil on the prevention of scar hyperplasia in the early stage of traumatic wound of rabbit ears. Methods 48 healthy New Zealand white rabbits were randomly divided into A and B and C three groups， 16 in each group， 32 traumatic wounds altogether. Group A was used triamcinolone acetonide，group B was used verapamil as the experimental group， and Group C was used normal saline as control group. From frst day after surgery to 4 weeks ， traumatic wounds of rabbit ear were epithelial，the scar tissue was taken to calculate the hypertrophic index and observe Masson staining of collagen fiber morphological distribution and the number of fbroblasts. Results There was difference between group A and group B（P ＜ 0.05）. There was signifcant difference between group A，B and group C（P ＜ 0.01）. Conclusion It is concluded that triamcinolone acetonide and verapamil can effectively prevent the formation of hypertrophic scar in rabbit ears. Triamcinolone acetonide has a better effect of inhibition than verapamil on the formation of hypertrophic scar. But triamcinolone acetonide may cause skin atrophy or even necrosis.

triamcinolone acetonide；verapamil；trauma； fbroblast； hypertrophic scar； experimental study

R619+.6

A

1008-6455（2016）08-0050-02

2016-05-12

2016-07-21