劉慶陽(yáng)，盧建熙，周智華，郭新雯，潘舒亞，李　平，姚宸維（.上海仁愛(ài)醫(yī)院美容外科 上海 005；.上海貝奧路生物材料有限公司 上海 04；.上海市第一人民醫(yī)院 上海 00080）

·基礎(chǔ)研究·

注射填充β-磷酸三鈣生物陶瓷透明質(zhì)酸混懸液的實(shí)驗(yàn)研究

劉慶陽(yáng)1，盧建熙2，周智華3，郭新雯1，潘舒亞1，李平1，姚宸維2
（1.上海仁愛(ài)醫(yī)院美容外科 上海 200235；2.上海貝奧路生物材料有限公司 上海 201114；3.上海市第一人民醫(yī)院 上海 200080）

目的：通過(guò)β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質(zhì)酸混合后形成穩(wěn)定的混懸液進(jìn)行注射填充，初步了解其在兔體內(nèi)的組織反應(yīng)、有無(wú)刺激增生及其誘導(dǎo)骨生成的可能性。方法：按預(yù)先設(shè)計(jì)制成2 種不同比例的混懸液（β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質(zhì)酸的比例分別為3∶17、3∶12），分別標(biāo)記為A、B，對(duì)照組為生理鹽水。12只新西蘭大白兔隨機(jī)分成3組，在三組白兔背部上下區(qū)域進(jìn)行注射，按組別隨機(jī)注射。注射后分別于第2、4、12 周提取標(biāo)本，行相應(yīng)觀察。結(jié)果：混懸液注射區(qū)未見(jiàn)明顯排異反應(yīng)，皮膚無(wú)紅腫，無(wú)滲出，對(duì)照組未見(jiàn)明顯異常反應(yīng)，1～12 周的β-磷酸三鈣生物陶瓷與周?chē)M織結(jié)合逐漸緊密，周?chē)M織細(xì)胞形態(tài)典型，細(xì)胞分布致密，未見(jiàn)明顯異常。材料周?chē)匆?jiàn)明顯的纖維包膜形成，未見(jiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）陽(yáng)性反應(yīng)。結(jié)論：β-磷酸三鈣生物陶瓷透明質(zhì)酸混懸液有良好的組織相容性，無(wú)刺激性，吸收慢、不會(huì)在軟組織出現(xiàn)成骨現(xiàn)象，可通過(guò)注射方式進(jìn)行填充治療，有望成為一種新型的注射性填充劑應(yīng)用于整形美容領(lǐng)域。

β-磷酸三鈣生物陶瓷；透明質(zhì)酸；注射；組織填充劑；骨形態(tài)發(fā)生蛋白2

β-磷酸三鈣生物陶瓷是一種骨填充材料，主要應(yīng)用在骨科、口腔、整形等領(lǐng)域。研究表明，β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性，無(wú)細(xì)胞毒性和排斥反應(yīng)，有良好的誘導(dǎo)成骨能力，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，并能夠在體內(nèi)獲得完全降解［1-3］。目前其多用于手術(shù)時(shí)進(jìn)行填塞植骨，無(wú)法通過(guò)微創(chuàng)方法注入體內(nèi)達(dá)到填充效果。透明質(zhì)酸作為軟組織填充劑已經(jīng)應(yīng)用于臨床，效果良好，但其持續(xù)時(shí)間短，一直是影響其臨床療效的主要因素［4-6］。能否將兩種材料混合一起，形成可注射的混懸液進(jìn)行注射填充，利用β-磷酸三鈣的長(zhǎng)代謝時(shí)間來(lái)達(dá)到相對(duì)時(shí)間較長(zhǎng)的填充效果，目前還沒(méi)有見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道。另觀察β-磷酸三鈣的誘導(dǎo)成骨情況，可能為以后臨床骨性結(jié)構(gòu)的缺損，凹陷甚至發(fā)育不足（如小頦畸形）導(dǎo)致的畸形通過(guò)注射方法達(dá)到骨性修補(bǔ)提供可能幫助。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料：β-磷酸三鈣生物陶瓷購(gòu)自上海貝奧路生物材料有限公司，粒徑為300～500μm，純度為95%，透明質(zhì)酸購(gòu)自山東華熙生物科技有限公司，濃度為17mg/ml；以上兩種產(chǎn)品均為無(wú)菌包裝，在無(wú)菌操作下將β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質(zhì)酸按照2種不同的比例（3∶17、3∶12）混合，并在振蕩器上混勻形成混懸液，分別標(biāo)記為A、B，另有一組無(wú)菌生理鹽水C。

1.2方法：新西蘭大白兔18只（常州卡文斯），平均體重約4.5kg。隨機(jī)分成3組，每組6只，3%戊巴比妥鈉1ml/kg兔耳緣靜脈注射麻醉，背部剃毛，消毒鋪巾［7］。三組兔背部上下兩個(gè)區(qū)域用20ml 注射器注射混懸液，每點(diǎn)注射2ml注入到皮下層，形成圓形隆起并標(biāo)記，對(duì)照組注射生理鹽水。因混懸液中β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒較大，均采用16G注射針頭進(jìn)行注射，注射后為防止混懸液漏出，進(jìn)行縫合（圖1）。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1外觀:觀察兔背部注射區(qū)皮膚外觀有無(wú)紅腫等變化，進(jìn)行皮膚隆起區(qū)直徑大小的測(cè)量并記錄變化。

1.3.2組織學(xué)觀察：在第2、4、12 周三個(gè)節(jié)點(diǎn)每組提取部分注射組織，進(jìn)行組織切片，分別行HE染色及bmp2免疫組化染色。

2　結(jié)果

2.1混懸液的性狀：A、B兩種混懸液均具有良好的流動(dòng)性，適合通過(guò)注射器進(jìn)行推注，其顆粒大小適用于20ml注射器并16G針頭進(jìn)行注射（圖2）。

2.2大體觀察：注射1d后兔活動(dòng)正常，注射兩組大白兔背部注射部位的皮膚隆起，無(wú)異常表現(xiàn)，對(duì)照組皮膚隆起消失，已經(jīng)正常；2周時(shí)，混懸液包塊與皮膚之間的連接不夠緊密，有晃動(dòng)現(xiàn)象；A、B兩組注射隆起范圍有不同程度減少，皮膚正常，無(wú)紅腫及等炎性反應(yīng)，對(duì)照組已經(jīng)一切正常；4周時(shí)，發(fā)現(xiàn)混懸液包塊與皮膚之間的連接較為緊密，無(wú)明顯晃動(dòng)現(xiàn)象，注射隆起范圍進(jìn)一步減小，A、B組無(wú)明顯差異；各組注射部位的皮膚無(wú)明顯炎癥反應(yīng)；12 周時(shí)，發(fā)現(xiàn)混懸液包塊與皮膚之間的連接緊密，無(wú)晃動(dòng)現(xiàn)象；A、B組大白兔注射隆起范圍進(jìn)一步減少，皮膚稍有隆起，觸之柔軟。

2.3局部測(cè)量注射部位的直徑大小變化：局部注射后直徑變化，注射后當(dāng)時(shí)A組局部形成腫塊的直徑平均值為：62.04mm；2周后直徑平均值為：47.05mm；1個(gè)月直徑平均值：42.40mm；3個(gè)月直徑平均值：34.33mm。注射后兩周平均吸收24.16%；注射后1個(gè)月平均吸收32.24%；注射后3個(gè)月平均吸收44.66%。B組注射當(dāng)時(shí)直徑平均值為：61.34mm；2周后直徑平均值為：45.08mm；1個(gè)月直徑平均值：41.60mm；3個(gè)月直徑平均值：35.46mm；注射后2周平均吸收26.51%；注射后1個(gè)月平均吸收32.18%；注射后3個(gè)月平均吸收42.19%；A、B組的直徑減少率隨著時(shí)間的增加而增大，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.4組織學(xué)觀察：2周時(shí)發(fā)現(xiàn)混懸液包塊仍然與皮膚之間的連接不夠緊密，有晃動(dòng)現(xiàn)象；常規(guī)包埋后，進(jìn)行常規(guī)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，陶瓷顆粒為不透光物質(zhì)，所以光鏡下為黑色團(tuán)塊，顆粒與周?chē)M織之間界限清楚，沒(méi)有明顯連接，無(wú)明顯的纖維包膜形成，無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3）。4周時(shí)發(fā)現(xiàn)混懸液包塊與皮膚之間的連接較為緊密； HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，陶瓷顆粒與皮膚組織連接明顯，但組織形態(tài)不明顯，細(xì)胞分布也較為疏密，周?chē)鸁o(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)纖維包膜形成（圖4）；12周時(shí)觀察，發(fā)現(xiàn)混懸液包塊與皮膚之間的連接緊密； HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，光鏡仍能觀察到的陶瓷顆粒，顆粒周?chē)つw組織形態(tài)典型，可見(jiàn)顆粒與皮膚組織連接緊密，同時(shí)細(xì)胞分布致密（圖5）。

免疫組化顯示：沒(méi)有BMP2（骨形成蛋白2）陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，即各組別中沒(méi)有BMP2的表達(dá)（圖6）。

圖1　混懸液注射到兔背部皮下

圖2 混懸液形成均勻，流動(dòng)性好

圖3　2周時(shí)顆粒與周?chē)M織之間界限清楚，沒(méi)有明顯連接（400×）

圖4　4周時(shí)陶瓷顆粒與皮膚組織連接明顯，但組織形態(tài)不明顯，細(xì)胞分布也較為疏密（400×）

圖5　12周時(shí)光鏡仍能觀察到的陶瓷顆粒，顆粒周?chē)つw組織形態(tài)典型，可見(jiàn)顆粒與皮膚組織連接緊密，同時(shí)細(xì)胞分布致密（400×）

圖6　免疫組化顯示：沒(méi)有BMP2（骨形成蛋白2）陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，即各組別中沒(méi)有BMP2，的表達(dá)（400×）

3　討論

生物材料的替代治療是現(xiàn)代整形外科重要的治療手段之一［8］。近年來(lái)，注射美容技術(shù)和相關(guān)產(chǎn)品的發(fā)展為微創(chuàng)治療提供了可能，通過(guò)注射方式將填充劑直接注入需要的層次，并捏塑成型，達(dá)到糾正面部缺損、凹陷，直至形成完美的外觀。注射填充的發(fā)展主要取決于填充劑的研究與開(kāi)發(fā)，面部的骨性缺損、發(fā)育不良及軟組織凹陷所致的畸形及外觀欠佳已經(jīng)成為目前整形美容外科最常見(jiàn)的診療項(xiàng)目。傳統(tǒng)的手術(shù)方法有著良好的效果，但帶來(lái)創(chuàng)傷及并發(fā)癥較多。有些由于骨性結(jié)構(gòu)的缺損，凹陷甚至發(fā)育不足（如小頦畸形）導(dǎo)致的畸形及不完美，通過(guò)透明質(zhì)酸等軟組織填充劑來(lái)改善，硬度及塑形性滿足不了臨床需要，最后呈現(xiàn)的效果也不盡理想［9-10］。

β-磷酸三鈣生物陶瓷是一種骨填充材料，主要應(yīng)用在骨科、口腔、整形、眼科、耳鼻喉科及組織工程等領(lǐng)域的臨床骨缺損的填充及非荷重部位的骨缺損治療。β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性。研究表明，新西蘭白兔種植試驗(yàn)可見(jiàn)周?chē)M織長(zhǎng)入材料中，β-磷酸三鈣生物陶瓷在體內(nèi)能被完全為鈣和磷，一般1～2年基本降解吸收［11-12］。

本實(shí)驗(yàn)以β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒與透明質(zhì)酸形成混懸液制備成新的注射填充材料。在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行植入，觀察組織學(xué)反應(yīng)，提取的組織切片均顯示注射材料不會(huì)引起組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，隨時(shí)間推移組織細(xì)胞與材料結(jié)合緊密，說(shuō)明制備的新填充材料具有較好的組織相容性。本實(shí)驗(yàn)采用的是無(wú)交聯(lián)的玻尿酸，故注射后透明質(zhì)酸2周左右即吸收結(jié)束，β-磷酸三鈣生物陶瓷則可以長(zhǎng)期持續(xù)，3個(gè)月還保持原有形態(tài)，說(shuō)明其填充效果良好，代謝時(shí)間長(zhǎng)，形態(tài)維持良好，臨床上塑形性強(qiáng)［13］。同時(shí)，免疫組化提示BMP2無(wú)顯示，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2是一種分泌性多功能蛋白，具有誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞向成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞定向分化與增殖的能力，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟，參與骨和軟骨的生長(zhǎng)發(fā)育及其重建過(guò)程，進(jìn)而加速骨缺損的修復(fù)［14-15］；BMP2的出現(xiàn)提示局部有成骨的表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)BMP2的表達(dá)提示注射材料周?chē)鸁o(wú)成骨現(xiàn)象，說(shuō)明β-磷酸三鈣生物陶瓷在軟組織中不會(huì)誘導(dǎo)成骨，可以安全作為組織填充劑進(jìn)行應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用了β-磷酸三鈣生物陶瓷與透明質(zhì)酸3∶17及3∶12的比例進(jìn)行配置，大于3∶12比例配置后粘滯度太大，不利于注射推注，但怎樣配置更好，配置比例如何才能達(dá)到最好效果，還有待于進(jìn)一步研究，同時(shí)將注射β-磷酸三鈣生物陶瓷注入到骨膜下能否誘導(dǎo)成骨，是否能為骨缺損提供骨修復(fù)的可能也需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)將透明質(zhì)酸與β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒進(jìn)行混合形成混懸液進(jìn)行注射治療可行性較高，注射后與周?chē)M織相容性好，無(wú)排斥及變態(tài)反應(yīng)發(fā)生，β-磷酸三鈣生物陶瓷顆粒與透明質(zhì)酸混懸液作為一種新型注射類(lèi)填充劑的嘗試還需要進(jìn)一步的研究。

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Experimental study onβ-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite on injectable tissue filler

LIU Qing-yang1，LU Jian-xi2，ZHOU Zhi-hua3，GUO Xin-wen1，PAN Shu-ya1，LI Ping1，YAO Chen-wei2
（1.Department of Plastic Surgery，Shanghai RENAI Hospital，Shanghai 200235，China； 2.Shanghai Bio-Lu Biomaterials CO.，Ltd，Shanghai 201114，China； 3.Shanghai First People's Hospital，Shanghai 200080，China）

Objective The purpose of this study was to observe the effection of β-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite as a new kind of tissue fller. Methods β-Tricalcium Phosphate /Hyaluronic acid composite were used to make two kinds of composite （A，B） for different proportion （3∶17， 3∶12）. Physiological saline was control group. Twelve new Zealand rabbits were divided into 3 groups. The composites were injected randomly on the back of rabbit. Some of the rabbits were killed to be evaluated with histology at the time points 2，4 and 12 weeks after injection. Results No rejection and infammation were found on the back of the rabbits of A and B. Fiber tissue surrounding the composite was not pronounced. No osteogenesis phenomenon（bone morphogenetic protein2） were found at 1-12 weeks postoperatively. Conclusion β-Tricalcium Phosphate / Hyaluronic acid composite has good tissue compatibility and plasticity.It was not toxic and slow absorption.It did not produce Osteogenesis phenomenon in the soft tissue.This composite may become a new kind of injectable fller.

β-Tricalcium Phosphate； Hyaluronic acid； injection； tissue fller；bone morphogenetic protein2

R318

A

1008-6455（2016）08-0044-03

2016-05-15

2016-07-26

編輯/張惠娟

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研課題資助項(xiàng)目（20134284）