李娟娟　李　洋　楊　青,2△

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)系　上海　200438; 2 云南天然產(chǎn)物與生物制藥協(xié)同創(chuàng)新中心　昆明　650091)

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人源吲哚胺2,3-雙加氧酶-2的表達(dá)與純化

李娟娟1李洋1楊青1,2△

(1復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)系上海200438;2云南天然產(chǎn)物與生物制藥協(xié)同創(chuàng)新中心昆明650091)

目的構(gòu)建人源吲哚胺2,3-雙加氧酶-2 (human indoleamine 2,3-dioxygenase-2,hIDO2)原核表達(dá)載體,表達(dá)、純化獲得hIDO2蛋白。方法采用基因工程手段獲得hIDO2原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株,篩選合適的重組質(zhì)粒及異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)濃度進(jìn)行蛋白表達(dá);通過親和層析純化重組hIDO2,BCA法測定蛋白濃度并計(jì)算蛋白收率;SDS-PAGE電泳檢測hIDO2表達(dá)情況,通過軟件分析得到蛋白純度;Western blot檢測目的蛋白特異性。結(jié)果重組質(zhì)粒經(jīng)電泳分析、雙酶切、DNA測序鑒定表明構(gòu)建成功;經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2比pGEX-4T-1-hIDO2的hIDO2表達(dá)效果好;SDS-PAGE電泳及Western blot均驗(yàn)證了在相對分子質(zhì)量45 000處的特異性目的條帶的存在;經(jīng)測定及計(jì)算得出蛋白純度為97.1%,蛋白濃度為20 mg/mL,蛋白收率為15 mg/L。結(jié)論成功構(gòu)建重組質(zhì)粒用于表達(dá)及純化hIDO2,蛋白濃度、純度、收率及特異性均較高。

吲哚胺2,3-雙加氧酶-2;人源;蛋白表達(dá);蛋白純化

吲哚胺2,3-雙加氧酶-2 (indoleamine 2,3-dioxygenase-2,IDO2),是繼吲哚胺2,3-雙加氧酶-1 (indoleamine 2,3-dioxygenase-1,IDO1)、色氨酸雙加氧酶 (tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO)之后,第3個(gè)被發(fā)現(xiàn)能夠催化色氨酸沿著犬尿氨酸途徑 (kynurenine pathway,KP) 代謝的限速酶,可催化色氨酸分解產(chǎn)生L-犬尿氨酸、喹啉酸等多種具有生物活性的代謝產(chǎn)物[1]。其中TDO主要存在于肝臟中,受糖皮質(zhì)激素及L-色氨酸的誘導(dǎo)[2],尚未發(fā)現(xiàn)其免疫調(diào)節(jié)活性[3];IDO1 廣泛分布于除肝臟以外的其他組織中,是細(xì)胞內(nèi)的一種含亞鐵血紅素的單體蛋白質(zhì),1967年首次在兔腸道細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[4]。作為IDO1的類似蛋白,IDO2 (EC 1.13.11.52)于2007年首次被發(fā)現(xiàn)[5-8]。

研究表明,IDO1過度活化與抑郁癥[9]、阿爾茨海默病[10-11]、白內(nèi)障、癌癥等人類重大疾病密切相關(guān)[12-13]。在機(jī)制方面,IDO1可以通過介導(dǎo)T細(xì)胞凋亡或Tregs形成從而引起腫瘤免疫逃逸[14-15]。Qian等[16]研究發(fā)現(xiàn),IDO2也可以抑制人類T淋巴細(xì)胞的增殖。由IDO1所引起的對T細(xì)胞增殖的抑制作用可以由提高色氨酸濃度或加入其抑制劑1-甲基色氨酸 (1-methyl-tryptophan,1-MT)而逆轉(zhuǎn),與IDO1明顯不同的是,由IDO2引起的T細(xì)胞增殖的抑制作用即使補(bǔ)充高濃度色氨酸或1-MT也不能逆轉(zhuǎn)。這一現(xiàn)象說明,在抑制T細(xì)胞增殖的反應(yīng)中IDO2與 IDO1可能存在不同的信號(hào)調(diào)節(jié)通路,并且二者發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。Metz等[17]研究發(fā)現(xiàn)在IDO2基因敲除小鼠 (IDO2-/-mice)體內(nèi),依賴IDO1的Tregs產(chǎn)生量明顯減少,表明IDO2對于IDO1介導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制或炎性反應(yīng)是必要的,進(jìn)一步說明IDO2在免疫過程中十分重要。關(guān)于抑制IDO1還是IDO2具有更好的抗腫瘤效果,Hou等[18]曾在黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)用D-1-MT抑制IDO2并與環(huán)磷酰胺聯(lián)用可以顯著減小腫瘤,比L-1-MT抑制IDO1引起的抑瘤效果更好,不過之后未見類似的報(bào)道。以上研究表明,IDO2與IDO1關(guān)系密切,兩者可能共同作用參與腫瘤發(fā)生、腫瘤免疫耐受、炎性反應(yīng)等重大疾病或生理活動(dòng),因此IDO2有望成為IDO1以外又一重要的藥物發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)。

IDO1在腫瘤的免疫耐受、基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要作用已被人們所認(rèn)識(shí)。IDO1抑制劑因在IDO1介導(dǎo)的具有色氨酸代謝病理學(xué)特征的疾病(包括癌癥、艾滋病、阿爾茨海默病、抑郁癥、白內(nèi)障等)的治療中具有潛能而成為研究熱點(diǎn)。與被廣泛研究的IDO1相比,人們對IDO2的生理生化、免疫等方面的功能了解甚少,究其原因主要是IDO2的表達(dá)純化、結(jié)構(gòu)解析等方面的研究有限,IDO2尚未商品化,IDO2活性檢測系統(tǒng)建立、IDO2抑制劑篩選及應(yīng)用等工作尚未廣泛開展。

目前國內(nèi)尚無人源IDO2 (human IDO2,hIDO2)蛋白在細(xì)菌中表達(dá)、純化的相關(guān)報(bào)道,本研究首次采用基因工程手段構(gòu)建hIDO2原核表達(dá)載體,通過比較目的蛋白表達(dá)情況,篩選出適用于人源IDO2表達(dá)的重組質(zhì)粒及合適的IPTG誘導(dǎo)濃度,通過親和層析純化獲得高濃度、高純度、高收率、高特異性的hIDO2蛋白,為IDO2大規(guī)模表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

藥品與試劑 人源IDO2 cDNA (上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司);異丙基-β-D硫代半乳糖苷 (isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG,美國Sigma-Aldrich公司);5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽 (5-ALA,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);限制性內(nèi)切酶(日本TaKaRa公司)、PrimeSTAR Max DNA聚合酶 (日本TaKaRa公司);NovoRec重組酶(上海近岸科技有限公司);BL21 DE3/DH5α菌株 (Biovector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心);凝血酶 (美國Sigma-Aldrich公司);人源IDO2一抗(美國Santa Cruz Biotechnology公司);HRP標(biāo)記二抗、ECL顯色液、BCA法蛋白濃度測定試劑盒 (上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

儀器與設(shè)備 Legend Micro 17R高速離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司);轉(zhuǎn)膜儀、S1000TMPCR儀(美國BioRad公司);SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);SCS-24恒溫?fù)u床(江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎機(jī)(廣州聚能納米生物科技股份有限公司);垂直平板電泳儀(北京百晶生物技術(shù)有限公司);Hi 6FF蛋白純化鎳柱(上海楚知生物科技有限公司);GST預(yù)裝蛋白純化柱(上海生工生物工程有限公司);10 000蛋白超濾管(美國Millipore公司);Sephadex G-25脫鹽柱(美國GE公司);DNP型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Clinx ChemiScope (上海勤翔科學(xué)儀器有限公司);Multiskan MK3酶標(biāo)儀、超低溫冰箱(美國Thermo Fisher公司);

重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hIDO2的構(gòu)建 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hIDO2,使用全長1 263 bp hIDO2目的基因,根據(jù)NovoRec重組酶技術(shù)操作手冊設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物,該引物包括5′端不少于15bp與載體同源的序列以及20～25 bp的目的基因片段,經(jīng)過PCR擴(kuò)增可使得目的片段兩端均有不少于15 bp的序列與線性化載體的序列一致。重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hIDO2表達(dá)的融合蛋白含有GST-tag。具體引物序列及酶切位點(diǎn)信息見表1。

表1　pGEX-4T-1-hIDO2引物序列及酶切位點(diǎn)

Endonuclease sites are emphasized with linear underline;pGEX-4T-1-hIDO2 is digested withSalI andNotI.

以全長hIDO2的cDNA為PCR模板,利用PrimeSTAR Max DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得目的片段,反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性3 min,98 ℃、10 s,58 ℃、12 s,72 ℃、1.5 min,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,利用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段。然后用SalI、NotI雙酶切載體質(zhì)粒pGEX-4T-1,并回收線性化片段。

將回收后的目的DNA與線性化pGEX-4T-1按照 3∶1～10∶1的摩爾比加入到PCR管中,根據(jù)操作說明加入適量NovoRec重組酶及相應(yīng)Buffer,混合液于37 ℃水浴20 min。反應(yīng)結(jié)束后立即將重組反應(yīng)液轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中并冰浴30 min,然后在42 ℃恒溫水浴中熱激90 s,冰浴3 min,超凈工作條件下將轉(zhuǎn)化液均勻涂抹在含50 μg/mL氨芐抗生素 (Amp) 的培養(yǎng)板上,37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h,第2天從選擇性培養(yǎng)板上挑取單克隆在含50 μg/mL氨芐抗生素 (Kan)的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增,當(dāng)菌液D600>1.0之后抽提質(zhì)粒,進(jìn)行電泳鑒定,并將初步鑒定正確的陽性克隆送至上海華津生物科技有限公司測序,經(jīng)測序確認(rèn)構(gòu)建成功,可用于下一步蛋白表達(dá)。

融合蛋白GST-hIDO2的表達(dá)及純化用測序正確的pGEX-4T-1-hIDO2轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達(dá)菌株BL21 DE3,并接種到適量氨芐霉素抗性 (終濃度50 μg/mL)的LB中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)16 h;第2天按1:50的比例將上述培養(yǎng)物接種在1 L新的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),溫度及搖床轉(zhuǎn)速不變,當(dāng)菌液D600達(dá)到 0.6 時(shí)將培養(yǎng)溫度降至室溫并加入0.5 mmol/L的5-ALA及終濃度0.2 mmol/L的IPTG,室溫、150 r/min誘導(dǎo)16 h。誘導(dǎo)結(jié)束后4 ℃,5 400×g離心15 min,收集菌體,-80 ℃深冷冰箱凍存或用于下一步蛋白純化實(shí)驗(yàn)。

用適量預(yù)冷25 mmol/L Tris-HCl 緩沖液 (pH=7.5,含1 mmol/L PMSF,150 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑)均勻重懸菌體,低溫高壓條件下進(jìn)行菌體破碎:將重懸的菌液勻漿倒入預(yù)冷Tris-HCl沖洗過的細(xì)胞破碎儀,儀器利用超高壓能量使樣品通過狹縫瞬間釋放,在剪切效應(yīng)、空穴效應(yīng)、碰撞效應(yīng)的作用下,使菌體細(xì)胞破碎、均質(zhì)、乳化。由于進(jìn)樣、破碎、出樣全過程都在-4 ℃低溫循環(huán)水浴中進(jìn)行,有利于保持原有物質(zhì)活性和性能。為達(dá)到較理想的效果可將菌液反復(fù)進(jìn)樣破碎3次,所有操作按說明書指示進(jìn)行。破碎后收集該勻質(zhì)液于4 ℃、13 800×g 條件下離心40 min,棄沉淀取上清,然后將上清流經(jīng)已用4 ℃預(yù)冷保存的結(jié)合緩沖液(上海生工生物工程有限公司,pH=7.4)平衡的GST預(yù)裝柱;重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hIDO2表達(dá)的融合蛋白由于含有GST-tag,因此會(huì)特異性結(jié)合到柱料上,而雜蛋白則不能結(jié)合。用預(yù)冷的洗滌緩沖液(上海生工生物工程有限公司,pH=7.4)洗脫下雜蛋白,最后用預(yù)冷的洗脫緩沖液(上海生工生物工程有限公司,pH=8.0)洗脫下融合蛋白GST-hIDO2。

GST-hIDO2蛋白的酶切處理 由于融合蛋白GST-hIDO2帶有較大GST-tag (相對分子質(zhì)量約26 000),可能會(huì)對后續(xù)其他實(shí)驗(yàn)如酶活性測定、特異性抑制劑篩選或蛋白結(jié)晶等產(chǎn)生不良影響,用特異性酶將其切除,具體操作如下:

收集從GST柱上洗脫下來的融合蛋白,向其中加入適量凝血酶,充分混勻,4 ℃酶切約12 h;將酶切后的蛋白再次重新掛柱 (GST-tag可以特異性結(jié)合到柱料上,而切去了標(biāo)簽的hIDO2則不能結(jié)合),收集柱流出液即可得到不帶GST-tag標(biāo)簽的IDO2,最后用預(yù)冷的洗脫緩沖液洗脫標(biāo)簽蛋白;取適量蛋白與等體積2×蛋白加樣緩沖液混勻,100 ℃干浴15 min,SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán) (G-250)染色,觀察融合蛋白酶切情況。

重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2的構(gòu)建 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2,使用的也是全長1 263 bp的hIDO2,利用NovoRec同源重組技術(shù)操作手冊設(shè)計(jì)相應(yīng)引物。具體引物序列及酶切位點(diǎn)信息見表2。

表2　pET28a-hIDO2引物序列及酶切位點(diǎn)

Endonuclease sites are emphasized with linear underline;pET28a-hIDO2 is digested withNdeI andXhoI.

以上述hIDO2 cDNA為PCR模板,進(jìn)行高保真PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為:98 ℃預(yù)變性3min;98 ℃變性10s,56 ℃復(fù)性12s,72 ℃退火3min,28個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析,并利用膠回收試劑盒回收目的片段。限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI雙酶切質(zhì)粒pET28a,回收線性化載體片段。

DNA同源重組連接及DH5α感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化同pGEX-4T-1-hIDO2載體構(gòu)建的操作步驟,然后將轉(zhuǎn)化液均勻涂布在具有卡那霉素抗性的選擇性培養(yǎng)板上,37 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)16 h,次日挑取單克隆在含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)增。提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳分析,將初步鑒定出的陽性克隆送至專業(yè)的公司測序。

IPTG濃度篩選用測序正確的pET28a-hIDO2轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達(dá)菌株BL21 DE3,并接種到適量卡那霉素抗性 (終濃度50 μg/mL)的LB中,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)16 h;第2天按1:50的比例將過夜培養(yǎng)物接種在適量新的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),溫度及搖床轉(zhuǎn)速不變,當(dāng)菌液D600達(dá)到0.6時(shí)將培養(yǎng)溫度降至室溫并加入0.5 mmol/L的5-ALA及不同終濃度的IPTG,室溫、150 r/min誘導(dǎo)表達(dá)16 h。誘導(dǎo)結(jié)束后取等量pET28a-hIDO2轉(zhuǎn)化菌 (未加IPTG誘導(dǎo)組及不同終濃度IPTG誘導(dǎo)組)分別加入2×加樣緩沖液,100 ℃干浴15 min,SDS-PAGE電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染液 (G-250)染色,脫色檢測,觀察不同重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌目的蛋白表達(dá)情況。

重組hIDO2的表達(dá)與純化用測序正確的pET28a-hIDO2轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達(dá)菌株BL21 DE3并接種到適量50 μg/mL Kan的LB中,37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng);第2天按1∶50的比例將過夜培養(yǎng)物接種在1 L新的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng),溫度及搖床轉(zhuǎn)速不變,當(dāng)菌液D600達(dá)到0.6 時(shí)將培養(yǎng)溫度降至室溫并加入0.5 mmol/L的5-ALA及終濃度0.05 mmol/L的IPTG,室溫誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)結(jié)束后4 ℃,5 400×g離心15 min,收集菌體,-80 ℃深冷冰箱凍存或直接用于下一步蛋白純化實(shí)驗(yàn)。

用適量預(yù)冷的25 mmol/L Tris-HCl 緩沖液均勻重懸菌體,低溫高壓條件下進(jìn)行菌體破碎,實(shí)驗(yàn)操作步驟同GST-hIDO2純化。破碎結(jié)束后4 ℃、13 800×g離心40 min,收集上清,然后將上清流經(jīng)已用4 ℃預(yù)冷的PBS平衡的Ni-NTA預(yù)裝柱;重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2表達(dá)的融合蛋白由于含有6個(gè)組氨酸構(gòu)成的his-tag,因此會(huì)特異性結(jié)合到柱料上,而雜蛋白則不能結(jié)合。用預(yù)冷的含40 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫非特異結(jié)合的雜蛋白,再用含250 mmol/L咪唑的磷酸鹽緩沖液洗脫下目的蛋白。4 ℃條件下,將得到的hIDO2用10 000超濾管進(jìn)行蛋白濃縮,再利用Sephadex G-25脫鹽柱將蛋白緩沖液置換為50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液 (pH=7.5),得到純化的hIDO2蛋白。SDS-PAGE電泳檢測,考馬斯亮藍(lán)染液 (R-250)染色、脫色檢測,并用Bandscan 5.0凝膠圖像分析軟件分析目的條帶純度。

BCA法測重組hIDO2蛋白濃度根據(jù)BCA法蛋白濃度測定試劑盒的技術(shù)手冊進(jìn)行操作:首先取蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液0.5 mL加入到蛋白標(biāo)品BSA中,得到25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)液,然后等比稀釋得到25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25、0.390 625、0.195 312 5 mg/mL共8個(gè)濃度;根據(jù)樣品數(shù)量,按50∶1的體積比將BCA試劑A與BCA試劑B充分混勻,得到適量BCA工作液;取一個(gè)96孔酶標(biāo)板,各孔分別加入200 μL BCA工作液,然后按4 μL/孔分別加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或者適當(dāng)稀釋的待測蛋白hIDO2,用移液器輕輕吹打混勻或者放在酶標(biāo)儀上震蕩30 s。37 ℃靜置30 min后取出酶標(biāo)板,用酶標(biāo)儀在波長562 nm下讀取每孔的吸光度值(D)。以蛋白濃度 (mg/mL)為橫坐標(biāo),D為縱坐標(biāo),繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線;根據(jù)所測樣品的D值及標(biāo)準(zhǔn)曲線上的公式計(jì)算得到相應(yīng)的蛋白濃度 (mg/mL)。

重組hIDO2蛋白Western blot鑒定取1 μL純化后的hIDO2蛋白稀釋50倍,然后取適量與2×加樣緩沖液于Eppendorf 管中混勻,100 ℃干浴后取等量hIDO2及蛋白Marker上樣,SDS-PAGE電泳結(jié)束后利用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,5% (w/v,PBS配制)的脫脂牛奶常溫封閉2 h。加入適量人IDO2一抗 (兔源,1∶200稀釋)4 ℃孵育過夜,PBST (含0.3% Tween-20的PBS溶液)溶液洗膜 (每次10 min,洗3次)后再加入相應(yīng)的二抗 (山羊抗兔,1∶2 000),室溫震蕩孵育1 h,PBST再次洗膜后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒在Clinx ChemiScope儀器中顯色。

結(jié)　　　果

重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-hIDO2的構(gòu)建挑取pGEX-4T-1-hIDO2轉(zhuǎn)化的DH5α單克隆大量擴(kuò)增抽提重組質(zhì)粒,以環(huán)狀空質(zhì)粒pGEX-4T-1為陰性對照 (control),1%瓊脂糖凝膠電泳分析。由于重組質(zhì)粒含有1 263 bp的目的基因,因此其相對分子質(zhì)量會(huì)比空質(zhì)粒的大,電泳過程中遷移的速度慢,據(jù)此原理可以粗略判斷重組質(zhì)粒構(gòu)建情況 (圖1)。然后將初步鑒定出的陽性克隆送專業(yè)公司測序,測序結(jié)果經(jīng)比對軟件分析,重組質(zhì)粒中的基因序列完全正確,表明上述重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Control:pGEX-4T-1;Lane 1-4:Extracted pGEX-4T-1-hIDO2.

圖1pGEX-4T-1-hIDO2質(zhì)粒電泳驗(yàn)證

Fig 1Electrophoresis identification of pGEX-4T-1-hIDO2

融合蛋白GST-hIDO2的表達(dá)、純化及酶切處理 取等量未加IPTG誘導(dǎo)菌體總蛋白、0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)菌體總蛋白、GST柱流出液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液分別上樣進(jìn)行SDA-PAGE電泳檢測,從結(jié)果可以看出IPTG誘導(dǎo)組菌體總蛋白及洗脫緩沖液的泳道在相對分子質(zhì)量70 000左右處均有特異性融合蛋白GST-hIDO2條帶 (相對分子質(zhì)量大小包括約26 000的GST標(biāo)簽蛋白及約45 000的hIDO2),而未誘導(dǎo)組及其他雜蛋白組的泳道則沒有該目的蛋白條帶 (圖2,泳道1～5),表明融合蛋白表達(dá)成功;但是也存在一些問題,從泳道5可以看出從親和層析柱上洗脫的蛋白中不僅含有融合蛋白,還含有一定量的GST標(biāo)簽蛋白,對蛋白純度造成一定影響。

M:Protein marker;Lane 1:The total protein before induction;Lane 2:The total protein after induction with 0.2 mmol/L IPTG;Lane 3:GST resin flow-through fraction;Lane 4:Protein eluted by washing buffer (pH=7.4);Lane 5:Protein eluted by elution buffer (pH=8.0);Lane 6:HIDO2 after thrombin digestion;Lane 7:GST-tag after thrombin digestion.

圖2GST-hIDO2蛋白純化及其酶切處理結(jié)果

Fig 2Purification and thrombin digestion of GST-hIDO2

由于融合蛋白帶有相對分子質(zhì)量較大的GST標(biāo)簽,對后續(xù)hIDO2酶活性測定、hIDO2抑制劑篩選等實(shí)驗(yàn)可能會(huì)產(chǎn)生不良影響,因此我們用凝血酶對GST-hIDO2進(jìn)行了酶切處理。酶切結(jié)果如圖2所示,從泳道6-7我們可以看出標(biāo)簽蛋白切除效果不太理想2,GST-tag沒有切完全,造成得到的目的蛋白hIDO2有較大損失;延長酶切時(shí)間及改變酶切溫度重復(fù)實(shí)驗(yàn)也沒有明顯改善。綜合蛋白純度及酶切后蛋白濃度考慮,后續(xù)實(shí)驗(yàn)中沒有再使用pGEX-4T-1-hIDO2這一重組質(zhì)粒。

重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2的構(gòu)建從轉(zhuǎn)化的DH5α擴(kuò)增菌中提取重組質(zhì)粒,然后用NdeI、XhoI雙酶切重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2,酶切產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測 (圖3,泳道2)。發(fā)現(xiàn)在1 200 bp左右出現(xiàn)特異性DNA條帶大小與預(yù)測一致。測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中的基因序列完全正確,酶切及測序結(jié)果表明該重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Lane 1:DNA Marker;Lane 2:pET28a-hIDO2.

圖3重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2的酶切驗(yàn)證

Fig 3Identification of pET28a-hIDO2 by restriction endonuclease digestion

IPTG濃度篩選比較圖4泳道2、3、4可以看出,與未加IPT誘導(dǎo)組 (泳道2)相比,重組質(zhì)粒pET28a-hIDO2轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌株在0.05及0.1 mmol/L兩個(gè)濃度的IPTG誘導(dǎo)下 (分別為泳道3和4)均有hIDO2的表達(dá),且IPTG濃度為0.05 mmol/L時(shí)目的蛋白表達(dá)量更高,即該濃度的IPTG hIDO2誘導(dǎo)表達(dá)效果更好,因此下一步實(shí)驗(yàn)中hIDO2的擴(kuò)大表達(dá)均用該濃度的IPTG。

重組hIDO2的表達(dá)與純化pET28a-hIDO2轉(zhuǎn)化BL21 DE3菌株誘導(dǎo)表達(dá),將菌體破碎的上清流經(jīng)Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行蛋白純化,SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果見圖5 A。由圖看出,與未誘導(dǎo)組相比,0.05 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后,菌體總蛋白、250 mmol/L咪唑洗脫液在相對分子質(zhì)量約45 000處可見到特異的目的蛋白條帶,而未誘導(dǎo)組菌體總蛋白、40 mmol/L咪唑洗脫液則無此特異條帶,表明hIDO2表達(dá)成功。利用凝膠圖像分析軟件Bandscan 5.0分析泳道5,目的條帶hIDO2的灰度與該泳道所有蛋白條帶灰度的比值即為hIDO2的純度,通過軟件計(jì)算得出hIDO2純度達(dá)到了97.1%,純度非常高。

Lane 1:Protein marker;Lane 2:The total protein without induction;Lane 3:The total protein after induction with 0.05 mmol/L IPTG;Lane 4:The total protein after induction with 0.1 mmol/L IPTG.

圖4不同濃度IPTG hIDO2誘導(dǎo)表達(dá)效果篩選

Fig 4Identification of hIDO2 expression induced by different IPTG concentrations

重組hIDO2蛋白Western blot鑒定由圖5 B看出,與陰性對照(未誘導(dǎo)組菌體總蛋白)相比,上樣純化后的hIDO2的泳道在相對分子質(zhì)量45 000處有非常明顯的蛋白條帶,且無任何雜條帶,表明純化后的hIDO2特異性很強(qiáng)。

BCA法測重組hIDO2蛋白濃度根據(jù)BCA濃度測定試劑盒的說明書進(jìn)行操作,以蛋白標(biāo)品濃度對每個(gè)濃度的D562值繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,趨勢線的R2>0.999,表明標(biāo)曲線性較好。將待測hIDO2的D值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線上的公式,計(jì)算得到蛋白濃度為20 mg/mL。再利用獲得目的蛋白的總量與總誘導(dǎo)表達(dá)菌量的比值計(jì)算出hIDO2的收率為15 mg/L,蛋白濃度及收率均達(dá)到較高水平。經(jīng)計(jì)算,本實(shí)驗(yàn)純化的hIDO2比活力為69.4 μmol·h-1·mg-1。

A:Lane 1,protein marker;Lane 2,the total protein before induction;Lane 3,the total protein after induction with 0.05 mmol/L IPTG;Lane 4,protein eluted at 40 mmol/L imidazole;Lane 5,protein eluted at 250 mmol/L imidazole;B:Western blot of hIDO2.

圖5hIDO2純化過程中SDS-PAGE檢測及Western blot鑒定結(jié)果

Fig 5SDS-PAGE analysis and Western blot of hIDO2 purification

討　　　論

作為催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑分解代謝的關(guān)鍵限速酶,IDO1廣泛分布于人和動(dòng)物的多種組織和細(xì)胞中[19];機(jī)體在正常狀態(tài)下呈低水平表達(dá),但在某些特殊或病理狀態(tài)下 (如妊娠、器官移植、慢性感染以及腫瘤等)其表達(dá)水平會(huì)顯著上升,主要通過引起局部微環(huán)境色氨酸耗竭及生成神經(jīng)毒性代謝產(chǎn)物等機(jī)制[20],直接或間接對T細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生影響,參與介導(dǎo)局部的免疫抑制反應(yīng)[9,21],并與神經(jīng)系統(tǒng)疾病 (如阿爾茲海默癥、抑郁癥等)也有著非常密切的聯(lián)系,引起了人們的廣泛關(guān)注。鑒于IDO1在免疫調(diào)控和多種人類重大疾病發(fā)生過程中不可替代的作用,IDO1已成為上述疾病治療的重要靶標(biāo)[22],IDO1抑制劑作為極具開發(fā)前景的藥物也吸引了眾多研究者和制藥工作者的目光[23-24]。

與IDO1相比,IDO2蛋白的分布范圍相對局限,小鼠體內(nèi)表達(dá)IDO2蛋白最豐富的器官是腎,其次是副睪、肝臟;在某些組織中IDO1和IDO2均有表達(dá),但是卻定位于不同的細(xì)胞中,例如在腎臟中,IDO1的表達(dá)主要定位于腎血管而IDO2卻只表達(dá)于腎小管[1]。盡管與IDO1在表達(dá)分布、底物親和性、酶活性高低、pH等方面具有一定差異,但I(xiàn)DO2與IDO1在功能上是保守的,即IDO2也是催化色氨酸降解的限速酶之一,IDO2參與了多種生理和病理的免疫調(diào)節(jié)[16-17]。

本研究采用基因工程手段構(gòu)建了2個(gè)hIDO2原核表達(dá)載體pGEX-4T-1-hIDO2和pET28a-hIDO2,并通過比較目的蛋白表達(dá)情況篩選出hIDO2表達(dá)效果較好的重組質(zhì)粒及IPTG濃度;通過親和層析方法獲得了純化的hIDO2,經(jīng)測定及計(jì)算得出蛋白純度為97.1%,蛋白濃度為20 mg/mL,蛋白收率為15 mg/L。SDA-PAGE電泳檢測及Western blot分析均發(fā)現(xiàn)在相對分子質(zhì)量約45 000處有特異性目的條帶。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功獲得了高濃度、高純度、高收率、高特異性的hIDO2蛋白,所用質(zhì)粒載體、菌株均為一般實(shí)驗(yàn)室常用易得的原材料,方法簡單易行,為IDO2大規(guī)模表達(dá)奠定基礎(chǔ)。通過這一方法獲得的IDO2蛋白可以廣泛用于研究其體內(nèi)酶活性、特異性抑制劑篩選、蛋白結(jié)晶,也為進(jìn)一步探尋IDO2的正常生理功能、參與疾病發(fā)生的機(jī)制等重要課題提供非常有價(jià)值的研究對象。

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E-mail:yangqing68@fudan.edu.cn

Expression and purification of human indoleamine 2,3-dioxygenase-2

LI Juan-juan1,LI Yang1,YANG Qing1,2 △

(1DepartmentofBiochemistry,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China;2theCollaborativeInnovationCenterofYunnanNaturalProductsandBiologicalPharmacy,Kunming650091,YunnanProvince,China)

ObjectiveTo construct human indoleamine 2,3-dioxygenase-2 (hIDO2) prokaryotic expression vectors to express and obtain purified hIDO2.MethodsUsing genetic engineering method to obtain hIDO2 prokaryotic expression vectors and transformEscherichiacoliexpression strains among which an optimal recombinant plasmid and isopropy-β-D-thiogalactoside (IPTG) concentration were screened and used for massive hIDO2 expressing.Affinity chromatography was used for hIDO2 purification.BCA method was used for protein concentration and yield measurement,SDS-PAGE electrophoresis was used for hIDO2 expression quantity determination and the purity was calculated with relevant software.Western blot was used for specificity detection.ResultsElectrophoretic analysis,double restriction endonuclease digestion and sequencing confirmed the successful construction of hIDO2 expression vectors.pET28a-hIDO2 was found to be a better recombinant plasmid to express human IDO2 than pGEX-4T-1-hIDO2.A specific target stripe at molecular weight (Mr) of about 45 000,same as predicted,was observed in both SDS-PAGE electrophoresis and Western blot.The purity,concentration and yield of hIDO2 was 97.1%,20 mg/mL

indoleamine 2,3-dioxygenase-2;human;protein expression;protein purification

Q331,Q786

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.04.004

2016-03-26;編輯:王蔚)

國家自然科學(xué)基金 (81373396,81573310);高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金 (20130071110037)

and 15 mg/L,respectively.ConclusionsWe successfully constructed recombinant plasmids using which we expressed and purified hIDO2 with high concentration,purity and yield.

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81373396,81573310) and the Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (20130071110037).