趙麗妮 葉夢 于洋 王俊平

（沈陽醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 遼寧沈陽 110034）

多巴胺脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥治療帕金森氏病的研究

趙麗妮 葉夢 于洋 王俊平

（沈陽醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室 遼寧沈陽 110034）

目的： 研制多巴胺脂質(zhì)體，用于治療帕金森氏病。方法： 用大豆卵磷脂和油酸制備多巴胺脂質(zhì)體；采用昆明種小白鼠，腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）建立帕金森氏病動物模型，用于評價多巴胺脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥的治療帕金森氏病的療效。結(jié)果：多巴胺脂質(zhì)體的平均粒徑為20-120nm， Zeta電位為-25.6mV，對多巴胺的包封率為（98.2±1.6）%（n =3）；經(jīng)鼻給藥，多巴胺脂質(zhì)體具有顯著的抗帕金森氏病作用（p＜0.05）。結(jié)論： 采用大豆卵磷脂、油酸可以制備出多巴胺脂質(zhì)體，經(jīng)鼻給藥用于治療帕金森氏病有效。

多巴胺 脂質(zhì)體 經(jīng)鼻給藥 帕金森氏病

帕金森氏?。≒arkinson's disease， PD） 是一種神經(jīng)退行性運(yùn)動功能障礙性疾病。PD的病理改變主要是中腦黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性凋亡。因此，PD的治療策略之一是補(bǔ)充腦內(nèi)多巴胺。然而，多巴胺不能通過血腦屏障，因此目前尚不能用多巴胺治療PD。鼻腦通路可以讓藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞，其機(jī)制可能有：嗅上皮毛細(xì)血管吸收小分子脂溶性藥物后穿過血腦屏障進(jìn)入中樞，通過伸入顱內(nèi)嗅覺壺腹的嗅覺感受細(xì)胞間的細(xì)胞軸突轉(zhuǎn)運(yùn)，也可能通過鼻粘膜嗅上皮細(xì)胞之間的裂孔進(jìn)行細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)。有文獻(xiàn)報道，脂質(zhì)體等藥物載體經(jīng)鼻給藥可讓其攜帶的藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞［1-3］。因此，我們制備了多巴胺脂質(zhì)體，目的是通過經(jīng)鼻給藥治療帕金森氏病。

1 儀器與材料

1.1 儀器

P200II型高效液相色譜附UV200II型紫外可變波長檢測器（大連伊力特分析儀器有限公司）；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器附SHZ-CD型循環(huán)水真空泵 （上海亞榮生化儀器廠）；TGL-16M臺式高速冷凍離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；激激光粒度/Zeta 電位分析儀（ELS800，日本）；JEM透射-掃描電鏡（日本電子光學(xué)公司）。

1.2 藥品與試劑

多巴胺（志望化工有限公司，批號：20140812）， 大豆卵磷脂（Sigma） ，油酸（上海生物，批號：20140602） ，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

健康雌性昆明種小白鼠，體重18-22g（沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號 SC XK（遼20010103）。

2 方法與結(jié)果

2.1 多巴胺脂質(zhì)體的制備

將25mg鹽酸多巴胺，0.25g油酸和大豆磷脂1.0g溶于熱90%乙醇適量。采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法，在氮?dú)饬髦谐掖?，至形成黏稠的溶液，加?%聚乙二醇400（PEG400）溶液，脂質(zhì)體自發(fā)形成。采用0. 01%NaOH調(diào)節(jié)上述脂質(zhì)體分散系pH至7.4，置高速勻漿機(jī)冰水中勻漿15分鐘，200nm微孔濾膜濾過， 即得多巴胺脂質(zhì)體。

2.2 包封率的測定

2.2.1 多巴胺HPLC分析條件

報道，結(jié)合我們的儀器，多巴胺的HPLC分析條件如下：層析柱：SinoChrom ODS-BP5m，4.6mm×200mm；流動相：磷酸鹽緩沖液（磷酸二氫鉀8.34 g與磷酸氫二鉀0.87g加水使溶解成1000m l，pH5.8）-甲醇（98∶2）；檢測波長：280nm；流速：1.0 ml/ min。

2.2.2 多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取多巴胺對照品，配制成多巴胺溶液，濃度分別為：20、40、80、160、320（g/mL）。在上述色譜條件下，采用HPLC測定各樣品峰面積，進(jìn)樣量50L。以各樣品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計算得回歸方程：Y =17.814X -88.45， 結(jié)果表明在20-320 μg/mL范圍內(nèi)樣品濃度和峰面積呈線性關(guān)系（r =0. 9987）。

2.2.3 包封率的測定

采用絮凝分離法測定多巴胺脂質(zhì)體的包封率。精密量取多巴胺脂質(zhì)體0.25ml用15%NaCl和50mL容量瓶稀釋到50mL，靜置過夜，轉(zhuǎn)入10ml刻度試管5000rpm離心30分鐘，取下清液，按上述色譜條件和標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定下清液中多巴胺濃度。按下述公式計算包封率：

包封率（%）=1-（游離多巴胺濃度/多巴胺總濃度）×100%。

2.2.4 粒度和Zeta 電位測定

采用激光粒度/Zeta 電位分析儀，測定多巴胺脂質(zhì)體在蒸餾水中的粒度分布和Zeta電位。

2.3 抗帕金森病作用

2.3.1 小鼠帕金森氏病模型的制備

取昆明種雌性小白鼠50只，體重18-22g，按體重差最小原則分成5組（10只/組）：空白對照組，多巴胺對照，模型對照組，多巴胺組，多巴胺脂質(zhì)體組。除空白對照組和多巴胺對照，其它各組鼻腔給藥5天后，腹腔注射MPTP（20mg/kg）連續(xù)12天，同時繼續(xù)鼻腔給藥?？瞻讓φ?，不給任何藥物。多巴胺組，鼻腔給藥，但是腹腔不注射MPTP。經(jīng)鼻給藥劑量為5μL/10g動物。

2.3.2 爬桿試驗(yàn)

分別在在給予MPTP之后第6天和第10天，將小鼠置放于一根長50cm直徑1cm的木桿頂端，木桿上纏上紗布以防打滑，然后將受試小鼠放到桿頂，并記錄以下幾個時間：小鼠爬完桿長的全長所需要的時間；小鼠爬完桿長的上半部分所用的時間；小鼠爬完桿長下半部分所用的時間。將這3個時間相加作為本次被測小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)的總時間，并作統(tǒng)計學(xué)分析。

2.3.3 懸掛實(shí)驗(yàn)

分別在在給予MPTP之后第6天和第10天，將受試小鼠雙前肢懸掛于一水平電線上，如小鼠用兩后肢抓住電線則記3分，如用一后肢抓住電線則記2分，如果小鼠兩后肢均抓不住電線則記1分，最后計算得分情況，并作統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均至少重復(fù)3次，采用Microsoft Office Excel計算實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差），利用t檢驗(yàn)分析統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0. 05，定為有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 多巴胺納米脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥的小白鼠懸掛實(shí)驗(yàn)

表2 多巴胺納米脂質(zhì)體經(jīng)鼻給藥的小白鼠爬桿實(shí)驗(yàn)

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 多巴胺脂質(zhì)體的理化性質(zhì)

在蒸餾水中，多巴胺脂質(zhì)體的平均粒徑為20-120（nm）， Zeta電位為-25.6 mV，對多巴胺的包封率為（98.2±1.6）%（n =3）。

3.2 多巴胺納米脂質(zhì)體的抗帕金森氏病效應(yīng)

經(jīng)鼻給藥，在爬桿實(shí)驗(yàn)和懸掛實(shí)驗(yàn)中，多巴胺納米脂質(zhì)體對MPTP引起的帕金森氏癥狀的對抗作用如表1-2所示。

結(jié)果表明，多巴胺經(jīng)鼻給藥有一定的抗帕金森氏病作用，而且用脂質(zhì)體運(yùn)載多巴胺，可以顯著提高多巴胺的抗帕金森氏病作用。但是，尚不能使動物恢復(fù)正常。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)研究多巴胺脂質(zhì)體治療帕金森氏病的療效。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多巴胺經(jīng)鼻給藥有一定的抗帕金森氏病作用，而且用脂質(zhì)體運(yùn)載多巴胺，可以顯著提高多巴胺的抗帕金森氏病作用。但是尚不能使動物恢復(fù)正常。

多巴胺難以通過血腦屏障，因此，目前帕金森氏病的治療無法采用多巴胺。增加血腦屏障通透性，有可能促進(jìn)多巴胺進(jìn)入中樞，但是破壞血腦屏障中樞神經(jīng)系統(tǒng)難以維持正常的功能。因此，要想采用多巴胺直接治療帕金森氏病，必須讓藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞。

鞘內(nèi)注射和鼻粘膜給藥可以繞過血腦屏障［4］。鞘內(nèi)注射不方便，因此我們選擇了鼻粘膜給藥治療帕金森氏病。鼻腔給藥后藥物分子通過嗅粘膜，進(jìn)入腦脊液，可繞過血腦屏障的途徑。鼻粘膜壁薄，血管豐富，利于藥物滲和吸收。經(jīng)鼻給藥的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑包括嗅神經(jīng)通路，粘膜上皮通路（載體轉(zhuǎn)運(yùn)，胞飲或被動擴(kuò)散方式）以及細(xì)胞旁通路，即透過細(xì)胞間隙或周圍裂隙進(jìn)入細(xì)胞間液，從而轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入腦脊液）。還有其它通路，如淋巴系統(tǒng)，視神經(jīng)，三叉神經(jīng)等。之前有報道，脂質(zhì)體能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)和肽類藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞［2］。本試驗(yàn)表明，脂質(zhì)體還能夠促進(jìn)其攜帶的小分子、極性強(qiáng)的藥物繞過血腦屏障進(jìn)入中樞。多巴胺是攜帶正電荷的小分子極性很強(qiáng)的藥物，只能通過細(xì)胞旁路通道進(jìn)入腦脊液，吸收很有限。脂質(zhì)體攜帶多巴胺改變了電學(xué)性質(zhì)，同時可以通過胞飲、穿過鼻粘膜或細(xì)胞旁路進(jìn)入腦脊液，不過其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

5 結(jié)論

多巴胺脂質(zhì)體能夠提高多巴胺經(jīng)鼻給藥治療帕金森氏病的療效，但是尚不能達(dá)到完全消除帕金森病癥狀的程度。脂質(zhì)體如何促進(jìn)多巴胺進(jìn)入中樞，以及如何提高多巴胺脂質(zhì)體抗帕金森氏病的療效尚待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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1674-2060（2016）02-0214-02