楊秦

（邵陽醫(yī)學高等?？茖W校 湖南邵陽 422000）

MshB基因突變對維羅納氣單胞菌菌毛動力的影響

楊秦

（邵陽醫(yī)學高等專科學校 湖南邵陽 422000）

目的：通過探索野生型（菌毛表達）和MSHB基因突變型（菌毛不表達）維羅納氣單胞菌動力方面的差別，證明菌毛在細菌運動方面的重要功能。方法：首先培養(yǎng)細菌長至對數(shù)生長期，讓后進行半固體培養(yǎng)基穿刺與平板挖溝培養(yǎng)實驗，最后對陽性率進行T分析。結果：兩者之間具有顯著差別（P＜0.05）。結論： 菌毛對維羅納菌的動力具有重要作用。

維羅納氣單胞菌 MSHB 動力

維羅納氣單胞菌是人畜共患病菌種。它和弧菌親緣關系較近，曾近一度認為是弧菌科家族。脂多糖、菌毛、S-layer、細胞毒素、蛋白酶等［1-2］等都是細菌常見的致病因子。本次工作的目的是通過MSHB基因野生型（有菌毛）和突變型（無菌毛）菌毛形成能力的差別，研究菌毛對于細菌動力能力的影響，為了解維羅納氣單胞菌的致病能力和藥物開發(fā)做基礎性研究。

1 材料和方法

1.1 細菌種類

野生型（MSHB+）和MSHB基因突變型（MSHB-）維羅納氣單胞菌均復蘇自-80℃。菌株均來自之前實驗成果。MSHB基因為菌毛蛋白基因。之前實驗已經(jīng)證明突變型的菌毛蛋白不表達，故而野生型有菌毛而突變型無菌毛［3］。

1.2 細菌培養(yǎng)基和生長條件

BHIB（Brain Heart Infusion Broth）培養(yǎng)基用作此次細菌的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)。待測試OD570=2.0左右（即對數(shù)生長期細菌），取出細菌用作后繼實驗。

1.3 半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)實驗

傳統(tǒng)半固體培養(yǎng)基有配制半固體干粉培養(yǎng)基購自天津市津東天正精細化學試劑廠，并嚴格按照其說明書要求配制。裝入試管成3厘米高的半固體培養(yǎng)基，錫箔紙封口后高溫滅菌。取對數(shù)生長期細菌接種半固體培養(yǎng)基， 從中央穿刺試管瓊脂的3/4，37 ℃培養(yǎng)，24～72 h 觀察結果。以細菌離開穿刺線生長， 擴散到培養(yǎng)基中使培養(yǎng)基變混濁為動力陽性， 細菌沿穿刺線生長，周圍培養(yǎng)基仍保持澄清為動力陰性。每種菌株重復50次。

1.4 平板挖溝培養(yǎng)實驗

鮮血瓊脂平板購買自上海撫生生物科技有限公司。以無菌手術刀在鮮血瓊脂平板中央挖去一條1cm寬的瓊脂條，形成一條小溝，放置一條4cm×0.5cm的無菌濾紙橫跨于兩邊培養(yǎng)基上，使之與小溝相垂直。在濾紙條的一頂端接種細菌的純培養(yǎng)物，置37℃溫箱中培養(yǎng)，每天觀察生長情況，直至7天，如接種端的隔溝對邊亦生長同樣細菌，表示該菌有動力。每種菌株重復50次。

1.5 SPSS統(tǒng)計分析。

每種使用SPSS19.0進行相關統(tǒng)計分析。

2 結果

圖1：A：半固體穿刺培養(yǎng)動力陽性。B半固體穿刺培養(yǎng)動力陰性。A試管中可見動力線渾濁，細菌向穿刺線周圍生長。證明其具有動力。B試管穿刺線清晰，細菌無動力。

表1：野生型和突變型維羅納氣單胞菌動力測試。半固體培養(yǎng)基穿刺實驗及平板挖溝培養(yǎng)實驗（共50支）均證明野生型（有菌毛）比突變型（無菌毛）維羅納氣單胞菌有更多的陽性率。野生型與突變型之間有顯著差別（P＜0.05）.菌毛在其運動中起到很重要的作用。

半固體培養(yǎng)基穿刺平板挖溝培養(yǎng)菌株 　　野生型（M s h B +） 　　突變型（M s h B -） 　　野生型（M s h B +） 　　突變型（M s h B -）總數(shù)（支） 　5 0 　5 0 　5 0 　5 0陽性（支） 　4 9 　4 0 　5 0 　3 7

3 討論

細菌的動力具有重要的病理學意義。本次實驗通過菌毛蛋白不表達的MSHB基因突變型維羅納菌與菌毛蛋白表達的野生型之前的對比，發(fā)現(xiàn)菌毛在維羅納氣單胞菌的運動能力中起的重要的作用。盡管在大多數(shù)細菌依靠鞭毛進行動力，但細菌也依靠菌毛動力［4-5］。IV型菌毛是普遍的用作動力的結構［6-7］。本次實驗所用維羅納氣單胞菌的菌毛便是屬于IV型菌毛。IV型菌毛的動力功能一直沒有直接證據(jù)，直到Hong S等［8］用tethering assay第一次直接證明IV型菌毛參與細菌的動力。IV型菌毛通過劃（Social Gliding Motility）和蹭動（twitching motility）移動，比如粘球菌用IV型菌毛進行劃行，假單胞菌和奈瑟菌依賴IV型菌毛進行蹭動［3，9］。IV型菌毛是很多致病病原體，比如霍亂弧菌、致病大腸桿菌［10-11］等和用來定植與黏附在上皮細胞上的的結構。相對于鞭毛的研究，菌毛的動力和生物膜方面研究相對較少。通過這次研究進一步證明菌毛在細菌動力方面的重要作用，為將來其生物膜形成及耐藥性方面的研究也奠定了初步基礎。

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Q2

A

1674-2060（2016）02-0019-02

1.2015年湖南省教育廳科研課題（15C1255） 2.2015年度湖南省大學生研究性學習和創(chuàng)新性實驗計劃項目（653）

楊秦（1981—），男，講師，主要研究方向為生物化學與分子生物學。