覃鴻妮 俞蘇敏

（蘇州工業(yè)園區(qū)服務外包職業(yè)學院 江蘇蘇州 215123）

青霉素結合蛋白PBP 2b基因的克隆與表達

覃鴻妮 俞蘇敏1

（蘇州工業(yè)園區(qū)服務外包職業(yè)學院 江蘇蘇州 215123）

在已知基因序列但缺乏DNA模版的情況下，人工設計合成多條引物，采用重疊PCR技術體外人工合成編碼青霉素結合蛋白的基因PBP 2b。將合成的PBP 2b基因連接到載體pet-30a上，并將重組表達載體（pet-30a）/PBP2b-tiger轉入T7 expression E.coli表達菌株中。重組工程菌經(jīng)IPTG誘導，用SDS-PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)青霉素結合蛋白（PBPs）成功表達。本研究構建了高表達青霉素結合蛋白（PBPs）的原核表達系統(tǒng)，制備出青霉素結合蛋白，從而為進一步從基因水平認識青霉素結合蛋白（PBPs）奠定基礎，為了解細菌耐藥的機制提供依據(jù)。

青霉素結合蛋白 PBP 2b基因 克隆 表達

青霉素結合蛋白（penicillin binding proteins， PBPs） 是細菌表面的一種微小蛋白質，PBPs由Suginaka 等于1972年第一次報道，能和青霉素共價結合，使青霉素具有完全的抗原性［1］。PBPs是一類在肽聚糖合成中起著重要作用酶類，當外源青霉素或其它β-內酰胺類抗生素作為青霉素結合蛋白底物（細胞正常代謝過程中，本應與青霉素結合蛋白反應結合的物質）的結構類似物，競爭性地與青霉素結合蛋白共價結合，就可以引起細菌細胞壁合成相關酶的缺乏，從而干擾細菌細胞壁的合成，以達到殺滅細菌的作用［2］。一旦青霉素結合蛋白的數(shù)量、種類或者與抗生素的親和力發(fā)生變化將會影響細菌的形態(tài)或細菌對抗生素的敏感性。細菌青霉素結合蛋白改變引起的細菌對抗生素的耐藥性是現(xiàn)研究的熱點之一，其對抗生素的改造、新抗生素的設計均有指導意義［3，4，5，6］。肺炎鏈球菌能引起肺炎、腦膜炎、中耳炎及敗血癥等多種疾病，是常見細菌性感染的主要病原菌之一，多年來一直是人類健康的大敵，也是科學家研究的焦點之一。PBP 2b基因是肺炎鏈球菌中已發(fā)現(xiàn)的5個編碼明確的青霉素結合蛋白的基因之一［7］，其表達蛋白為青霉素結合蛋白2b，基因編號為spr1517。本研究著重于編碼肺炎鏈球菌PBPs的其中一個基因PBP 2b的克隆及表達，為的是更深層次的了解青霉素結合蛋白相關基因的表達機制，以便為進一步深入研究青霉素結合蛋白奠定基礎，為了解細菌耐藥的機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 目的基因

在NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查詢Sundick等發(fā)表的肺炎鏈球菌的PBP 2b 基因的序列，根據(jù)其基因序列，利用PAS技術合成該基因即為本研究的目的基因。

1.1.2 受體菌TOP10、T7 expression E.coli ；載體 pet30a。

1.2 方法

根據(jù)基因序列委托相關公司設計和合成PCR擴增所需PBP 2b的引物，將引物稀釋到20pmol/uL，每條引物取2uL混勻作為引物混液。通過兩輪PCR擴增目的基因。第一輪PCR引物拼接獲得目的基因，第二輪PCR（基因擴增），在第一輪PCR以后， 以擴增的產(chǎn)物為模版，用片段兩端的引物進行基因擴增。擴增結果采用瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的基因.

1.2.2 目的基因克隆

（1）目的基因與載體雙酶切后連接

用BamHI與XhoI酶切來獲得目的基因PBP 2b，同時用BamHI與XhoI酶切載體pGEM-T。酶切后將目的基因與載體連接。

（2）連接產(chǎn)物轉化

取一管-80℃保存的感受態(tài)細胞（100μl），置冰上融化；加入連接產(chǎn)物pGEM-T/PBP 2b（10μl），輕輕旋轉離心管以混勻，冰浴30min；將1.5EP管置于42℃熱擊100s，然后迅速置冰浴3分鐘；向管中加入800uL LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)30min（目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇）；

將1.5EP管5000r離心5min，析出部分培養(yǎng)液，棄之，吸取前吹打一下，把約100ul已轉化的感受態(tài)細胞加到LB體瓊脂培養(yǎng)基上（含50ug/ml Amp，內已倒入若干無菌的玻璃珠），把平板輕輕地上下左右均勻搖晃，使得無菌的玻璃珠將細胞均勻涂開；將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃過夜培養(yǎng)，至藍白斑生長區(qū)分明顯為止。

圖1 目的基因的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 pGEM-T/PBP 2b 酶切電泳圖

1.2.3 陽性克隆的PCR鑒定

隨著生產(chǎn)力的發(fā)展，奴隸主土地的開墾面積越來越大，從前的“井田制”遭到破壞，許多奴隸主一方面使用奴隸開墾公田同時又大量招收“隱民”、“私屬徒”進行開荒，擴大自己的私田面積。有些貴族為了增加自己的收入大量開發(fā)荒蕪的上地，就成為擁有大量私田的地主。另一方面，從事大規(guī)模集體生產(chǎn)的奴隸，由于不堪忍受奴隸主的殘酷剝削和壓迫，則紛紛選擇逃亡，這樣就使井田逐漸荒蕪。井田制的破壞，就說明奴隸制社會的經(jīng)濟基礎開始崩潰。私田的不斷增多，促進了封建生產(chǎn)關系的產(chǎn)生和新興地主階級勢力的發(fā)展，最終打破了奴隸社會“工商食官”社會分工體系。

陽性克隆的驗證通過隨機挑取轉化平板上的陽性單菌落，接種于2mL LB培養(yǎng)基（50μg/ml Amp）中，37℃ 8h 220r振蕩培養(yǎng)后提取質粒對其目的基因進行PCR擴增，進而多擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。將pGEM-T/PBP 2b質粒用BamHI和XhoI酶切后通過瓊脂糖電泳來驗證目的基因并獲得目的基因。用移液槍吸取6 μl的菌檢PCR產(chǎn)物點入濃度為1%的檢測膠，電泳儀220V、280mA電泳7min。

1.2.4 蛋白表達

（1）將正確克?。╬et-30a）/PBP2b-tiger轉入T7 expression E. coli（NEB菌株），菌液涂布于同時含Amp和Kan的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜。

（2）取2克隆分別加入含4 m l L B的試管中，3 7°C培養(yǎng)至OD600=0.6 ，取一試管中加入4μl，濃度為1M的IPTG誘導劑，使終濃度為1mM，另一試管不加誘導劑作為陰性對照。再繼續(xù)培養(yǎng)3h，各吸取500μl菌液離心，棄上清。每管加入50μl 50mM，pH8.0的Tris-Hcl?；靹蚝螅兴?0min，離心取上清液，采用SDS-PAGE法鑒定表達產(chǎn)物。

2 結果與分析

2.1 目的基因的合成

目的基因的電泳檢測結果如圖1所示，PBP2b的PCR產(chǎn)物條帶大小在2000bp左右，與其理論值大小2262bp相符，可判斷PCR產(chǎn)物正確。

2.2 pGEM-T/PBP 2b 酶切結果

將pGEM-T/PBP 2b質粒用BamHI和XhoI酶切后通過瓊脂糖電泳來驗證目的基因并獲得目的基因。通過電泳圖2可表明上帶大小為3 0 0 0 b p左右，下帶在2 2 0 0 b p左右；與克隆載體p G E M-T 3100bp、目的基因PBP 2b 2262bp的大小相吻合。

2.3 表達載體的構建與驗證

將酶切下的目的基因PBP 2b連接到表達載體（pet-30a），用BamHI和XhoI酶切后通過瓊脂糖電泳來驗證目的基因是否導入。通過電泳圖3可表明上帶大小為5000 bp左右，下帶在2200bp左右；與表達載體（pet-30a）5300bp、目的基因PBP 2b 2262bp的大小相吻合，可判定表達載體構建正確。

2.4 PBP 2b所表達的蛋白檢測

通過不同濃度的IPTG來誘導PBP 2b，SDS-PAGE凝膠電泳來檢測蛋白，從圖4可知用0.3mmol/L、0.6mmol/L、0.9mmol/L 濃度的IPTG誘導出的蛋白大小約為87KD左右，與PBP 2b應表達蛋白大小相吻合，但表達強度不同，可判斷IPTG的濃度對于PBP 2b蛋白表達強度有一定影響。

圖3 表達載體的酶切驗證

圖4 PBP 2b蛋白表達檢測

3 結論與討論

3.1 青霉素結合蛋白PBP 2b基因的克隆

本研究運用PCR法獲得PBP 2b基因，將連接到切成指定的克隆載體上；在PCR過程中產(chǎn)物兩端加入BamHI和XhoI的酶切位點，經(jīng)限制性內切酶處理連接至表達載體，運用轉化表達載體成功獲得PBP 2b的克隆。

3.2 青霉素結合蛋白PBP 2b基因的表達

通過誘導劑IPTG的不同濃度來誘導PBP 2b蛋白，結果表明IPTG的濃度直接關系到重組蛋白的表達水平，本研究結果顯示，IPTG誘導E.coli BL21蛋白表達濃度在1 mmol/L以內時，其濃度越高誘導效果越好，但因IPTG既能誘導大腸桿菌表達外源蛋白質又同時對大腸桿菌有一定的毒害作用，故本研究沒有設置高于1mmol/L的誘導濃度。

PBPs譜變異與細菌耐藥性產(chǎn)生密不可分，本研究結果也為更深層次了解青霉素結合蛋白提供了實驗依據(jù)，為了解細菌耐藥性奠定基礎。

［1］朱竟赫，郭文潔，劉耀川等.革蘭陽性菌青霉素結合蛋白研究進展［J］，動物醫(yī)學進展，2010，31（1）：77-80.

［2］熊亞莉，青霉素結合蛋白研究進展［J］，國外醫(yī)藥抗生素分冊，2004，25（5）：193-197.

［3］向華國，王曉紅，熊札寬，李凌云，潘鵬，朱德保，梅毒螺旋體青霉素結合蛋白的克隆及表達［J］，中國熱帶醫(yī)學，2008，8（5）：723-724，727.

［4］陳婉純.呼吸道細菌對抗生素的耐藥性與合理使用抗生素［J］，中國醫(yī)藥指南，2013，11（21）：266-267.

［5］綦廷娜，王和，陳崢宏.細胞壁缺陷肺炎鏈球菌青霉素結合蛋白2b基因片段的檢測［J］，2010，36（5）：552-553.

［6］孔聰聰，劉改芳.幽門螺桿菌對抗生素耐藥的分子機制研究進展［J］，2014，29（4）：478-480.

［7］袁竹青，吳忠道，肺炎鏈球菌R6株全基因組序列的初步分析［J］，中國人獸共患病雜志2003，19（6）：93-97.

Q75

A

1674-2060（2016）02-0011-02

覃鴻妮（1983—），女，湖北長陽人，博士，講師，研究方向為分子生物學。