趙建

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部 河南南陽 473000）

一株銅綠假單胞菌的分離鑒定與耐藥性分析

趙建

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部 河南南陽 473000）

目的：對矽肺患者痰標(biāo)本中分離到的菌株NY-7進行分離鑒定。方法：將菌株NY-7經(jīng)形態(tài)觀察，生化反應(yīng)，16s rDNA鑒定后分析其耐藥性。結(jié)果：經(jīng)生化鑒定及16s rDNA鑒定所分離細菌NY-7為一株銅綠假單胞菌。結(jié)論：對病原菌進行有效鑒定，并分析其耐藥性，對于臨床防治疾病具有重要作用。

病原菌 16s rDNA鑒定 耐藥性

抗菌藥物因長期性、廣泛性應(yīng)用,且在應(yīng)用過程中存在一定不合理性,導(dǎo)致菌株產(chǎn)生較為明顯耐藥性,因此了解病原菌特性及其耐用性對于臨床用藥具有重要作用［1］。本文NY-7進行分離鑒定,并分析其耐藥性,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從矽肺患者痰標(biāo)本分離到的菌株NY-7。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：10 g 蛋白胨,5 g 酵母浸粉,5 g NaCl,18 g瓊脂定容至1 L。高壓濕熱滅菌,121 ℃,20分鐘。

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基：20g蛋白胨,5g牛膽鹽,10g乳糖,0.03g中性紅,5 g NaCl,18 g瓊脂定容至1 L。

1.2.2 細菌形態(tài)鑒定

通過革蘭氏染色和簡單染色的方法觀察細菌的大小、形態(tài)及其革蘭氏反應(yīng)類型。

1.2.3 生理生化檢測

通過用質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853菌株做對照,依據(jù)伯杰氏細菌分類鑒定手冊（9th edition）［2］中的方法進行蔗糖、水楊酸、D-木糖、硫化氫、乳糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖、甘露醇、間-肌醇、尿素酶、七葉苷水解、葡萄糖、山梨醇、吲哚、M-R、V-P、枸櫞酸鹽利用、明膠液化等生化實驗。

1.2.4 16S rDNA基因序列分析

用試劑盒提取菌株NY-7的DNA,將染色體DNA作為PCR擴增的摸板PCR擴增NY-7的16S rDNA基因。所用的引物是通用正向引物P1（5'-3'） AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和通用反向引物P2（5'-3'） GGTTACCTTGTT ACGACTT。

PCR反應(yīng)條件：94℃,5min；94℃,3min；58℃,1min；72℃, 1min；72℃,3min。擴增產(chǎn)物直接進行測序,測序結(jié)果通過http：// www.ncbi.nih.nlm.gov網(wǎng)站進行BLAST序列比對。

對銅綠假單胞菌耐藥性進行分析,自瓊脂培養(yǎng)基挑選分離的銅綠假單胞菌,接種到M-H瓊脂平板。將質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853作對照,分析藥物敏感性,所選取藥物為：青霉素、氨芐西林、哌拉西林、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻呋、亞胺培南、四環(huán)素、氨曲南、丁胺卡那、慶大霉素、氯霉素、妥布霉素、強力霉素、紅霉素、環(huán)丙沙星、羅紅霉素、氧氟沙星、諾氟沙星、磷霉素等［3］。

2 結(jié)果

2.1 菌株NY-7的形態(tài)特性

NY-7在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長18～24h可以見到扁平、濕潤的菌落,該菌產(chǎn)生的帶熒光的水溶性色素使培養(yǎng)基呈亮綠色；在血瓊脂平板上生長時可以見到在菌落的周圍有溶血環(huán),菌落呈金屬光澤；革蘭陰性菌,菌體的一端有單鞭毛,無芽胞。葡萄糖氧化分解、氧化酶、精氨酸雙水解、乙酰胺酶、葡萄糖酸氧化、硝酸鹽還原產(chǎn)氨試驗均為陽性。根據(jù)《伯杰氏手冊》將NY-7初步鑒定為銅綠假單胞菌。

2.2 16s rDNA 鑒定結(jié)果

PCR擴增的16S rDNA基因片段,NY-7的大小為1.4kb左右。登陸NCBI網(wǎng)站,16s rDNA序列比對結(jié)果表明,菌株NY-7與質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853具有99.9%的同源性。

2.3 菌株NY-7的藥物敏感性試驗

分離的銅綠假單胞菌NY-7對于氨芐西林、青霉素、紅霉素、利福平、氯霉素高度耐藥（R）,對于羅紅霉素、四環(huán)素、頭孢吡肟中度敏感（I）,對于磷霉素、亞胺培南、氧氟沙星、諾氟沙星、丁胺卡那高度敏感。藥敏試驗中各種藥物對大腸桿菌的抑菌圈直徑如表1所示。

表1 藥敏試驗中各藥物對NY-7的抑菌圈直徑（mm）

3 討論

本論文通過進行形態(tài)觀察、生理生化實驗、16S rDNA核酸序列將來自矽肺患者痰標(biāo)本中分離到的菌株NY-7鑒定為銅綠假單胞菌。NY-7在普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)菌落扁平、濕潤,產(chǎn)生綠色帶熒光的水溶性色素；在血瓊脂平板上生長時可以見到在菌落的周圍有溶血環(huán),菌落呈金屬光澤；革蘭陰性菌,菌體的一端有單鞭毛,無芽胞；葡萄糖氧化分解、氧化酶、精氨酸雙水解、乙酰胺酶、葡萄糖酸氧化、硝酸鹽還原產(chǎn)氨試驗均為陽性通過16s rDNA 測序后表明NY-7的 16s rDNA 序列與質(zhì)控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853同源性為99.9%,因此確定NY-7為銅綠假單胞菌。NY-7對于氨芐西林、青霉素、紅霉素、利福平、氯霉素高度耐藥（R）,對于羅紅霉素、四環(huán)素、頭孢吡肟中度敏感（I）,對于磷霉素、亞胺培南、氧氟沙星、諾氟沙星、丁胺卡那高度敏感。由于廣譜抗生素的廣泛使用,銅綠假單胞菌對多種抗生素快速產(chǎn)生耐藥性,這就使得臨床的抗感染治療顯得越來越困難。因此,臨床上還應(yīng)加強消毒防御,合理地科學(xué)地使用抗生素,并應(yīng)在藥敏試驗結(jié)果指導(dǎo)下進行抗感染治療［4］。

［1］ 劉奕.655例銅綠假單胞菌的分布及耐藥性分析［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（11）： 1308-1310.

［2］ 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.第1版.北京東黃城北街16號：科學(xué)出版社，2001，64-65.

［3］胡錫仙，張?zhí)?ICU肺部感染的病原菌分布及藥敏分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2013，23（10）：2472-2474.

［4］隋素琴，尤兆雄，張瑞君.醫(yī)院感染病原菌的分布及耐藥性分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（20）：4639-4641.

Q93

A

1674-2060（2016）03-0320-01

趙建（1974—），女 ，講師。