秦春艷

（中國航天建設(shè)集團(tuán)有限公司 北京 100071）

嗜鹽單胞菌ST-1的分離及其石油烴類降解特性的研究

秦春艷

（中國航天建設(shè)集團(tuán)有限公司 北京 100071）

從油田石油污染物中分離出了一株菌株ST-1，通過形態(tài)和16S rDNA序列的分析，初步鑒定屬于Halomonas的一個種。對該菌株降解石油烴的能力進(jìn)行了實驗，結(jié)果表明，菌株生長的指數(shù)期石油烴降解速率較大， 最大降解率達(dá)到80%以上， 降解的最適溫度為27～34℃，最適 pH 為 6.8～8.3。提高接種量可以加快反應(yīng)速度。

嗜鹽單胞菌 石油烴 降解特性

廣泛存在于土壤、地下水、海洋、湖泊等環(huán)境中的天然微生物種群對石油烴的降解作用是石油污染物從環(huán)境中消除的基本途徑之一［1,2］。

本文從大慶油田石油污染土壤中分離篩選到一株菌株ST-1,通過形態(tài)和16S rDNA序列分析對菌株進(jìn)行了鑒定,并對其石油烴降解的特性進(jìn)行了研究,以期為該菌株在石油污染物的降解中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基（g/L）：KH2PO43.48,Na2HPO41.5,MgSO40. 70,（NH4）2SO44,酵母粉0.01,2%乙醇,0.5%柴油,PH=7.0～7.2。用于石油烴降解菌的富集培養(yǎng)。

配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,用于菌株的形態(tài)觀察、保存及活化。

1.2 石油烴降解菌的分離和篩選

取無菌水（含有玻璃珠）90ml,將其中加入土樣10g或水樣10ml。取富集培養(yǎng)基95ml,將其中加入上清液5ml,于25℃,200r/min的搖床富集培養(yǎng)3d。取新鮮的富集培養(yǎng)液80ml,將其中轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)液20ml,繼續(xù)培養(yǎng),一共轉(zhuǎn)接4次。

取富集培養(yǎng)液,按梯度稀釋后,涂平板,在25℃條件下培養(yǎng)3d,隨機(jī)挑取菌落,采用劃線的方法反復(fù)分離純化,直至得到純培養(yǎng)菌株。

1.3 菌株的鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察

準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨平板,將分離得到的菌株涂布于上,在25℃條件下,培養(yǎng)2d,觀察長出的菌落形態(tài)、做革蘭氏染色反應(yīng)和觀察細(xì)胞在電子顯微鏡下的形態(tài)。

1.3.2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增及序列測定

將劃線分離后的菌株,挑取單菌落,進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增,用0.1%的瓊脂糖凝膠對其PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳,經(jīng)過goldview染色后,在紫外下照射觀察PCR產(chǎn)物條帶情況,產(chǎn)物交測序公司測序［3］。

1.4 菌株的石油降解特性分析

準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基,將活化后的菌株接種到其中,在25℃,200r/min的條件下,搖床富集培養(yǎng)12h,將其作為種子液。以5%的接種量（種子液）接入培養(yǎng)基中,25℃,200r/min的條件下培養(yǎng),3h取一次樣,檢測培養(yǎng)基的OD600、PH和石油烴的濃度。

表2-1 菌株ST-1的生理生化測定Table2-1 Physiological and biochemical tests of the strain ST-1

圖2-3 菌株 ST-1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2-3 Phylogenetic tree of the strain ST-1

圖2-4 菌株不同生長階段的石油烴降解效果Fig.2-4 Effects of different growth stages of petroleum hydrocarbon degradation strains

為了考察溫度、PH值、接種量對石油烴降解的影響,進(jìn)行了單因素實驗：

（1） 溫度：將種子液接種到培養(yǎng)基中,在15、20、25、30、35、40℃中培養(yǎng),每隔24h,測其吸光度。

（2）PH值：將種子液接種到培養(yǎng)基中,用H2SO4或NaOH調(diào)節(jié)PH,在PH為3,4,5,6,7,8,9,的條件下培養(yǎng),每隔24h,測其吸光度。

（3）接種量對石油烴降解的影響：分別取2ml、4ml、6ml、8ml接種于石油烴濃度為1000mg/L的培養(yǎng)基中,在25℃,200r/min下培養(yǎng),每隔8h取樣測石油烴的濃度。

圖2-5 溫度對石油烴降解效果的影響Fig.2-5 The influence of temperature on the effect of petroleum hydrocarbon degradation

圖2-6 PH對石油烴降解效果的影響Fig.2-6 The influence of PH on the effect of petroleum hydrocarbon degradation

圖2-7 不同生物量條件下石油烴類的降解率Fig.2-7 The degradation of petroleum hydrocarbons under the conditions of different biomass ratio

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)特征

菌株在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)后得出結(jié)果為該菌的細(xì)胞為球狀,菌落呈圓形、黃色,表面光滑,不透明,邊緣整齊。

2.2 菌株的形態(tài)及生理生化測試

對該菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化特征鑒定,結(jié)果見表2-1。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株的16S rDNA堿基的全序列輸入GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)與假單胞菌屬10個菌株的同源性在 93%～94%,將與菌株ST-1同源性最高的菌株序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖 2-3可見,這些同源性序列分為4個不同的分支,菌株 ST-1與Halomonas 位同于一個分支,并且這個分支的支持率達(dá)到90%,而其它的3個屬可以作為外群,菌株 ST-1定位于Halomonas屬,, 所以從這個聚類關(guān)系可以判斷, 菌株 ST-1屬于Halomonas的一個種。

2.4 菌株的石油烴降解特性

2.4.1 不同生長階段的石油烴降解特性

菌株在不同生長曲線下的石油烴降解曲線如圖2-4所示。

菌株4h后進(jìn)入指數(shù)期,24h后進(jìn)入穩(wěn)定期。石油烴降解主要發(fā)生在指數(shù)期,24h時石油烴降解率達(dá)到81.3%,期間的最大石油烴降解速率達(dá)6.25mg/（Lh）；其后培養(yǎng)液中的石油烴濃度變化不大。菌株ST-1的延滯期短,生長速度快,這可能是其石油烴降解速率較高的主要原因之一［4,5］。

2.4.2 石油烴降解效果受環(huán)境因子的影響

前面所測的溫度和PH對菌株ST-1的石油烴降解效果的影響見圖2-5和2-6。在不同溫度下,菌株ST-1培養(yǎng)至12h時,其石油烴降解效果差異顯著,由于菌株的生長速度快,從而使石油烴降解作用也較快,本實驗測得30℃時去除效率是最高的,故此溫度下石油烴被降解的最多。在27～34℃內(nèi),石油烴降解速率均在80%以上,其中,在15～40℃時,石油烴都有不同程度的降解,表明菌株降解石油烴的溫度適應(yīng)范圍較廣。

菌株ST-1的PH適應(yīng)范圍較廣,在PH為6.8～8.3時,石油烴降解速率均達(dá)90%以上,但PH＜6時,石油烴降解效果急劇降低,這可能與菌株較能適應(yīng)堿性環(huán)境的特性相關(guān)［6］。

2.4.3 菌株對石油烴降解效果的影響

本實驗從菌株的接種量對石油烴的降解效果來研究,從圖2-7可以看出,提高接種量可以加快反應(yīng)速度,縮短延遲期,但接種量在6.0～8.0ml之間時,接種量對石油烴的降解速率影響不大,并且生物量越高,石油烴降解率迅速上升期也較短。

3 結(jié)論

（1）本實驗得到的菌株 ST-1在固體培養(yǎng)基上的生長特征、形態(tài)特征以及溫度適應(yīng)性、pH值范圍等。通過 16S rDNA等分子生物學(xué)手段的鑒定可以初步判斷此菌種屬于Halomonas屬,且有可能為新種。

（2）本實驗對菌株ST-1對石油烴的降解進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明,石油烴降解發(fā)生在菌株生長的指數(shù)期,最大降解率達(dá)到80%以上, 降解的最適溫度為27～34℃,最適 pH為6.8～8.3,此時,最大降解速率達(dá)到90%以上。

（3）本實驗從菌株的接種量對石油烴的降解效果方面進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,提高接種量可以加快反應(yīng)速度,縮短延遲期,但接種量達(dá)到一定值時,對石油烴的降解速率影響不大,并且生物量越高,石油烴降解率迅速上升期也較短。

［1］姚德明，許華夏.石油污染土壤生物修復(fù)過程中微生物生態(tài)研究［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2002，21（1）：26～28.

［2］A tlas R.M.and Pramer D.Focus on Bioremediation［J］.ASM News，1990，56：7.

［3］Luo Peng， Hu Chaoqun， Zhang luping， et al. Effects of DNA extraction and universal primers on 16S rRNA gene-based DGGE analysis of a bacterial community from fish farming water［J］. Chinese Journal of Oceanology and Limnology.2007， 25：310-316.

［4］Plotnikova EG， Alyntseva OV， Kosheleva IA， et al. Bacterial degraders of polycyclic aromatic hydrocarbons isolated from salt-contaminated soils and bottom sediments in salt mining areas. Microbiology. 2001，70：51-58.

［5］鄧波等.生化法處理高溫高鹽油田采出水.中國給水排水，2003，194：76-78.

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1674-2060（2016）03-0315-02

秦春艷（1986—），女，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物的研究。